L’approche en termes d’indicateurs de vulnérabilité

A adaptação ao H2O2 durante 30 min induziu aumentos de aproximadamente 2 vezes no nível de duas proteínas envolvidas em processos de sinalização celular - Asc1p e Pil1p, sendo que somente a proteína Asc1p manteve os seus níveis alterados ao longo dos 90 min de adaptação ao H2O2. A proteína Asc1p é uma proteína ortóloga da proteína RACK1 de mamífero, que faz parte da subunidade ribossomal 40S e que actua como um repressor da tradução. No entanto, a proteína RACK1 também se associa à isoforma βII do PKC, o que leva a pensar que a proteína Asc1p também possa estar associada a uma via de transdução de sinal (Gerbasi et al., 2004). A recente identificação da proteína Asc1p como sendo a subunidade β da proteína G, que se liga à proteína Gpa2p, que desempenha um papel de sinalização em resposta a nutrientes, atribuiu uma nova função à Asc1p. A proteína Asc1p pode ligar-se ao efector enzimático adenilciclase (Cyr1) e diminuir a produção de cAMP em resposta a um estímulo pela glucose. Este efeito é oposto ao desempenhado pela Gpa2p, que promove a produção de cAMP através de um estímulo de glucose. A Asc1p desempenha assim múltiplas funções na célula, podendo desempenhar funções na transdução de sinal desde os receptores da superfície celular aos efectores intracelulares (Zeller et al., 2007). Por outro lado, estudos efectuados anteriormente recorrendo à estirpe mutada no gene que codifica para a Asc1p, mostraram que há um aumento de sensibilidade destas células a fármacos que actuam

129 na parede celular, sugerindo, assim, que esta proteína é necessária à manutenção da integridade da parede celular (Valerius et al., 2007).

Os níveis da proteína Pil1p (do inglês, phosphorylation is inhibited by long chain bases) encontram-se aumentados nas células adaptadas ao H2O2 durante 30 min. Esta proteína, assim como a proteína Lsp1 (do inglês, long chain bases stimulate phosphorylation), desempenham um papel de regulador negativo dos cinases PDK-like, dos cinases Pkh1p e Pkh2p, que actuam na cascata de sinalização dos cinases Pkc1p-MAP e na via Ypk1. Estas duas vias, que actuam em paralelo controlando a integridade da parede celular (Roelants et al., 2002), são reguladas pelas LCB (do inglês, long chain bases), as bases de cadeia longa, precursoras dos esfingolípidos. As proteínas Pil1p e Lsp1p são proteínas substrato dos cinases Pkh1p e Pkh2p. As LCB inibem a fosforilação da Pil1p mas estimulam a fosforilação da Lsp1p. Estas vias de sinalização das LCB mediadas pelos cinases Pkh e os esfingolípidos são importantes para a endocitose de proteínas e lípidos (Grossmann et al., 2007). Sabe-se igualmente que o aumento transitório dos níveis das LCB, em condições de stress térmico, inibe a fosforilação da Pil1p catalisada pelo cinase Pkh2, reduzindo a forma fosforilada da Pil1p-P (Zhang et al., 2004). A Pil1p-P é a forma inibidora, permitindo assim que os cinases Pkh1/2p fosforilem a Pkc1p e os cinases Ypk1/2 activem as vias anteriores. Os processos finais destas vias estão relacionados com a integridade da parede celular e com a repolarização do citosqueleto de actina durante o stress térmico, sendo por isso importantes no controlo do crescimento e sobrevivências celulares (Zhang et al., 2004).

Embora as proteínas Pil1p e Lsp1p tenham sido inicialmente caracterizadas como reguladoras da via de sinalização Pkh, recentemente foi demonstrada a existência de uma nova estrutura, denominada por eisossoma, do qual fazem parte estas proteínas (Walther et al., 2006). Os eisossomas são estruturas estáticas que marcam os futuros locais de formação dos patch de actina, onde se inicia o recrutamento das proteínas necessárias à endocitose (Walther et al., 2006). Os eisossomas encontram-se localizados por debaixo da membrana plasmática e sequestram um subgrupo de proteínas da membrana plasmática em domínios membranares, que colocalizam com os locais de endocitose de proteínas e lípidos (Walther et al., 2006; Grossmann et al., 2007). Os eisossomas desempenham, pois, um papel na endocitose, quer de proteínas, quer de lípidos. Experiências anteriores, em que foi utilizada a proteína híbrida Pil1-GFP, permitiram observar que esta proteína se encontra maioritariamente junto à membrana plasmática, não se detectando a Pil1-GFP na fracção solúvel da célula (Walther et al., 2006). Tendo em atenção estes dados, é justificável a identificação da Pil1p na fracção proteica das membranas plasmáticas. A composição completa do eisossoma ainda não é conhecida, sabendo-se apenas que as proteínas Pil1p e Lsp1p são as subunidades mais importantes desta estrutura. A Pil1p funciona como a proteína organizadora dos

130 eisossomas, visto que a sua deleção leva ao colapso da organização normal dos eisossomas e à recolocação dos eisossomas remanescentes na periferia da célula (Walther et al., 2006). Este efeito é específico da Pil1p, visto que a deleção da proteína Lsp1p não produz os mesmos efeitos na célula e também não induz um agravamento dos efeitos observados nas células de levedura na ausência da Pil1p. Os eisossomas parecem desempenhar um papel central na organização da membrana plasmática, visto que a deleção do gene PIL1 codifica uma das subunidades que leva a que ocorra uma grande invaginação aberrante da membrana plasmática associada aos eisossomas remanescentes e uma perda de um domínio para a distribuição normal de várias proteínas e lípidos esteróis da membrana plasmática.

Para além das vias de sinalização LCB mediadas pelos cinases Pkh e dos esfingolípidos serem importantes para os processos de endocitose, também os eisossomas regulam os processos endocíticos que modulam a organização da membrana plasmática visto que dois dos componentes desta estrutura, as proteínas Pil1p e Lsp1p são fosforiladas pelos cinases Pkh (Zhang et al., 2004). A fosforilação da Pil1p pelos cinases Pkh altera a constante de associação da Pil1p, que no estado fosforilado está na forma livre, e no estado não fosforilado está na forma ligada, associada ao eisossoma (Walther et al., 2006). Quando a Pil1p está hiperfosforilada o eisossoma desagrega-se, mas se a Pil1p está hipofosforilada formam-se os eisossomas.

O facto de nas electroforeses bidimensionais se terem identificado duas manchas correspondentes à proteína Pil1p, que se encontram aumentadas nas células adaptadas a 150 μM de H2O2 durante 30 min, indica claramente a existência de modificações pós- traducionais e leva-nos a pôr a hipótese que cada uma poderá corresponder a uma das duas formas anteriores – a Pil1p fosforilada e a não fosforilada. Curiosamente também foi observado um aumento dos níveis da proteína Pil1p na membrana plasmática de S.

cerevisiae, na presença do antifúngico calcoflúor (Delom et al., 2006), o que vem

demonstrar a resposta desta proteína não só à presença de um oxidante, como o H2O2 mas também a um composto que ataca a parede celular.

Estas duas proteínas, Asc1p e Pil1p, têm então em comum a interacção com as vias de sinalização celular, sendo particularmente interessante que a proteína Pil1p responda à presença de bases de cadeia longa, um dos componentes dos esfingolípidos, que por seu lado são dos compostos mais abundantes na membrana plasmática de S. cerevisiae, particularmente nas jangadas membranares. Estas alterações em proteínas envolvidas em fenómenos de sinalização celular, podem ser pertinentes na indicação de quais os componentes relevantes na resposta celular ao nível da transdução de sinal durante a resposta adaptativa ao H2O2 em S. cerevisiae, bem como permitir fazer a ligação entre alterações relatadas ao nível dos lípidos membranares e um possível fenómeno de sinalização celular. A interacção da proteína Pil1p com bases de cadeia longa adquire

131 uma maior importância se considerarmos a diminuição significativa, na membrana plasmática das células adaptadas ao H2O2, dos níveis de um dos VLCFA (2-OH-C26:0) (capítulo 5.2.2), um componente quer de ceramidas quer de esfingolípidos (Dickson et

al., 2006).