UR Typicité des Produits Alimentaires, Département QEA, VetAgroSup Campus Agronomique de
Clermont, 89 Avenue de l’Europe, BP 35, F-63370 Lempdes.
Introduction
La pratique actuelle pour déterminer la qualité de la viande et assurer sa sécurité sanitaire repose principalement sur une inspection des services vétérinaires et sur un échantillonnage conséquent. Cette approche semble limitée car elle ne peut garantir totalement la protection des consommateurs. En effet, le contrôle de la totalité des échantillons est techniquement, financièrement et logistiquement impossible. En outre 50 méthodes chimiques, physiques et microbiologiques ont été proposées pour la détection de la contamination et la mesure de la qualité microbienne de la viande (Ellis et al 2002, Nychas et al 2007). La plupart de ces méthodes ne sont pas adaptées pour une détection rapide de la détérioration de la viande. Elles sont laborieuses, longues à mettre en œuvre et par conséquent donnent des informations rétrospectives. La spectroscopie de fluorescence est une technique très intéressante qui a été utilisée pour l'identification bactérienne (Ammor et al 2004, Leblanc et Dufour 2002), la séparation des bactéries et des levures (Bhatta et al 2006), la différenciation entre les micro-organismes appartenant à différentes familles taxonomiques (Giana et al 2003, Leblanc et Dufour 2002, Tourkya et al 2009). Ces études ont démontré le potentiel de la spectroscopie de fluorescence pour suivre les changements physicochimiques observés pendant le stockage de la viande. Néanmoins ces différentes études ont été effectuées sur un spectrofluorimètre de laboratoire qui n'est pas adapté pour les mesures en ligne dans les industries agroalimentaires. L'objectif de la présente étude est de présenter les potentialités d’un spectrofluorimètre portable, composé d’une diode électroluminescente (LED), d’un spectromètre, d’une sonde déportée à fibres optiques et d’une interface informatique pour la détermination de la qualité microbienne de la viande de bœuf hachée.
Matériels et méthodes
Les matières premières – De la viande de bœuf hachée (race Charolaise) a été divisée en portions de 110g puis emballée
soit sous air ou sous vide. Les échantillons ont été divisés en 2 groupes. Le premier a été stocké à 5°C et le second à 15°C. Les dénombrements microbiens et les mesures de fluorescence ont été réalisés à 5 °C aux temps (0, 24, 48, 72, 97, 121, 169, 217, 240 et 264h) et à 15°C aux temps (0, 6, 12, 23, 27, 32, 36, 47, 51, 56, 61, 71, 78, 96, 120, 168, 192, et 216 h).
Analyse microbiologiques – Les flores microbiennes ont été dénombrées sur des milieux de cultures sélectifs gélosés et
selon des méthodes normalisées : la microflore totale viable cultivable (TVC) a été déterminée sur gélose nutritive PCA (Merck, 1.05463, Darmstadt, Germany) (ISO, 2293). Les Pseudomonas ont été dénombrées sur milieu Cetrimide, Fucidine and Cephaloridine (CFC, Oxoid, CM559 supplémenté avec SR 103E, Basingstoke, UK) (ISO, 13720). La microflore lactique a été déterminée sur milieu De Man, Rogosa and Sharpe (MRS, Merck, 1.10660, Darmstadt, Germany). Les levures-moisissures ont été dénombrées sur gélose Oxytetracycline Glucose (OGA, Biokar Diagnostic, 1mL de supplément sélectif a été ajouté à 110mL de milieu de base OGA – BK053, F60000 Beauvais, France). Les dénombrements ont été réalisés en duplicata. Les résultats sont exprimés en Unité Formant Colonie (UFC) par gramme.
Spectrofluorimètre portable – Les spectres de fluorescence (SF) de la viande de bœuf hachée ont été enregistrés en
utilisant un spectromètre miniature (IDIL Fibres Optiques, Lannion, France). Trois longueurs d'onde d'excitations ont été testées (280, 320 et 380nm) afin d’obtenir des spectres d'émission sur les plages spectrales 307-460, 346-600 et 410- 705nm, respectivement. Chaque spectre de fluorescence est la résultante d’une moyenne de 5 scans. Chaque mesure a été effectuée 5 fois afin d’assurer une bonne répétabilité des résultats. Les SF enregistrés pendant l'altération de la viande lors du stockage ont été analysés à l’aide du logiciel MATLAB 7.0.4 (The MathWorks, Inc).
Régression des moindres carrés partiels - Dans la présente étude la méthode de régression des moindres carrés partiels
(PLS) a été utilisée afin de prédire l’intensité de la contamination microbienne de la viande à partir des SF. Les modèles de régression ont été validées par la méthode "leave-one-out cross-validation". La performance des modèles PLS a été
évaluée en analysant, le coefficient de détermination de validation (R2) et le coefficient RPD =1/(1-R2)1/2.
Résultats et discussion
Les spectres de fluorescence de viande hachée – Des spectres typiques de viande hachée enregistrés pendant son
altération lors du stockage sont présentés sur la Fig. 1. Les SF obtenus avec la LED 280nm présentent un maximum situé à 350nm (Fig. 1A). Cette bande d'émission peut être attribuée à la fluorescence du tryptophane d’après Tourkya et al (2009). Les SF obtenus avec la LED 320nm présentent un maximum situé à 450nm (Fig. 1B). Cette bande peut être attribuée à la vitamine A et au NADH d’après Skjervold et al (2003) et Le Blanc et Dufour (2002). Les SF obtenus avec la LED 380nm présentent un maximum situé à environ 560nm (Fig. 1C). Skjervold et al (2003) ont identifié la même longueur d'onde d'excitation pour certain constituants du tissu conjonctif de la viande. Les SF enregistrés, après
excitation à 280, 320 et 380 nm au cours de l’altération de la viande lors du stockage, présentent une nette évolution de leur intensité de fluorescence (Fig.1). Cette évolution spectrale suggère que la spectroscopie de fluorescence est sensible aux modifications physicochimiques engendrées par les microorganismes lors de l’altération de la viande.
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 Fl uo re sc en ce (a .u ) Wavelength (nm) 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 425 445 465 485 505 525 545 565 585 Fl uo re sc en ce (a .u ) Wavelength (nm) 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 480 530 580 630 680 730 Fl uo re sc en ce (a .u ) Wavelength (nm)
Fig1. Spectres de fluorescence enregistrées sur des échantillons de viande hachée au cours du stockage à 5°C après excitation à 280 nm (A), 320 nm (B) et 380 nm (C) (conditionnement sous vide).
Modèles PLS pour les échantillons stockés à 5°C - Les modèles PLS obtenus à partir des spectres enregistrés lors du
stockage de la viande à 5°C présentent de bons résultats de régressions pour les trois LED d'excitations (280, 320 et
380nm). Tous les modèles de régressions obtenus présentent d’excellents R2 (0,82 à 0,99) et de bons coefficients RPD
(2,37 à 8,95). Les meilleurs modèles de prédiction pour les TVC sont obtenus avec la LED 320nm pour les échantillons
emballés sous vide (R2= 0,97; RPD= 5,65) et sous air (R2= 0,94; RPD= 3,94). L’excitation avec la LED 380nm permet
d’obtenir les meilleurs modèles de prédiction de la contamination par les bactéries lactiques dans les échantillons
conditionnés sous vide (R2= 0,95; RPD= 4,57) et sous air (R2= 0,95; RPD= 4,43). Les meilleurs modèles de prédiction
pour les levures/moisissures sont obtenus avec la LED 320nm pour les échantillons conditionnés sous vide (R2= 0,94;
RPD= 4,02) et sous air (R2= 0,96; RPD= 5,05). Enfin, les meilleurs coefficients de régressions pour les Pseudomonas
sont obtenus avec la LED 320nm aussi bien pour les échantillons conditionnés sous vide (R2= 0,96; RPD= 5,19) que
sous air (R2= 0,89; RPD= 8.95). Ceci suggère que les différents spectromètres testés peuvent être utilisées pour prédire
la charge bactérienne d’un échantillon de viande. Sur la base des résultats obtenus, il semble que la qualité des modèles de prédictions soit indépendante des conditions d'emballage.
Modèles PLS pour les échantillons conservés à 15 ° C - Les modèles PLS-R obtenus présentent de bons coefficients de
régressions (R2= 0,59 à 0,96 ; RPD= 1,40 à 4,93) à la fois pour les échantillons emballés sous vide et sous air. Le
meilleur modèle PLS pour les TVC (R2= 0,83; RPD= 2,41) est obtenu avec la LED 280nm pour les échantillons
conditionnés sous vide. Cependant, le meilleur modèle PLS, pour les échantillons conditionnés sous air (R2= 0,96;
RPD= 4,84) est obtenu avec la LED 320nm. Les coefficients de régression les plus élevés pour la prédiction des
bactéries lactiques sont obtenus en conditionnement sous air (R2= 0,89; RPD= 3,04) et sous vide (R2= 0,78; RPD= 2,13)
avec les LED 320 et 380nm, respectivement. Les meilleurs modèles de régression pour les levures/moisissures sont
obtenus avec la LED 320nm (R2= 0,89; RPD= 3,02) pour les échantillons conditionnés sous air et avec la LED 380nm
pour les échantillons conditionnés sous vide (R2= 0,96; RPD= 4,93). Enfin, les R2 et RPD les plus élevés pour la
prédiction des Pseudomonas ont été calculés pour les conditions sous air (R2= 0,91; RPD= 3,25) et sous vide (R2= 0,7;
RPD= 1,82) avec les LED 320 et 380 nm, respectivement.
La précision des modèles de régression peut être considérée comme excellente pour les échantillons stockée à 15°C sous vide et sous air. Ceci suggère que les spectrofluorimètres développés pourraient être utilisés pour prédire la charge
bactérienne de la viande hachée. Néanmoins, les modèles prédictifs obtenus à 15°C présentent des valeurs de R2 et de
RPD plus faibles que pour les modèles obtenus à partir des échantillons stockés à 5°C.
Conclusion
Ce travail préliminaire démontre qu'il est possible de déterminer avec beaucoup de précisions la charge microbienne d’une viande de bœuf hachée en utilisant un spectrofluorimètre portable équipé d’une LED (280, 320, et 380 nm), d’un spectromètre et d’une sonde déportée à fibres optiques. Cette étude semble très prometteuse pour le développement d’un outil portable permettant de réaliser des mesures rapides et en ligne de la qualité microbiologique de la viande de bœuf.
References
Ellis D. I., Broadhurst D., Kell D.B., Rowland J.J., Goodacre R., 2002. Appl. Environ. Microbiol., 68, 2822-2828. Nychas G.-J. E., Douglas L.M., Sofos, J.N. 2007. In M.P. Doyle & L. R. Beuchat (Eds.), Food microbiology: Fundamentals and frontiers (3rd ed., pp. 105-140). Washington, DC: ASM Press.
Ammor S., Yaakoubi K., Chevallier I., Dufour E., 2004. J. Microbiol. Meth., 59, 271-281. Leblanc L., Dufou, E., 2002. FEMS Microbiol. lette, 211, 147-153.
Bhatta H., Goldys E.M. Learmonth R.P., 2006, Appl. Microbiol. Biotech., 71, 121-126. Giana H.E., Silveira L., Zangaro R.A., Pacheco M.T.T. 2003, J. Fluoresc., 13, 489-493. Tourkya B. Boubellouta T., Dufour E., Leriche F. 2009. Curr Microbiol., 58, 39-46.
(A) 280 nm (B) 320 nm (C) 380 nm