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Texte intégral

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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Legat, A. (2010). Contribution à l'étude du monde d'action de deux adjuvants synthétiques ciblant TLR4, diC14-amidine et CRX-527 (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Ecole Interfacultaire des Bioingénieurs, Bruxelles.

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D 03752

ULB UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

ÉCOLE INTERFACULTAIRE DE BIOINGENIEURS

Contribution à i'étude du mode d'action de deux adjuvants synthétiques ciblant TLR4 :

diCi 4 -amidine et CRX-527

t* C E

à'K;

Centre de Biologie Structurale et de Bioinformatique

/

_

Structure et Fonctions des Membranes Biologiques

Directeur de thèse : Michel Vandénbranden Co-promoteur : Jean-Marie RuyssçhaSll

Co-encadrement : Michel Goldman & Dominique Dewit

i

Amandine Légat

(3)

ULB UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

ÉCOLE INTERFACULTAIRE DE BIOINGENIEURS

Contribution à l'étude du mode d'action de deux adjuvants synthétiques ciblant TLR4 :

diCi 4 -amidine et CRX-527

structure et Fonctions des Membranes Biologiques Centre de Biologie Structuraie et de Bioinformatique

Directeur de thèse : Michel Vandenbranden Co-promoteur : Jean-Marie Ruysschaert

Co-encadrement : Michel Goldman & Dominique Dewit

Amandine Légat

Janvier 2010

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f^cmcrcîcmcnts

Je^tv&vw à/ remerotef ;

Jean-Marie Ruysschaert et Michel Vandenbranden 'pour fcut découA/rir et cUmer leu retherche/, meUi' au4J«>, et surtout, pour m/avoir ioutenae^

jUiCfU/cuA/ bout, med^é' vna déloccdCicutton/ veri' GoaelCey. Merci/ à Jeavu-MarCe/

pour ioru eUde^ "ityacturarte/" et à MCchet pour io/ pcvtierte/ et yyvu écoute^ wtéme/

quand d n/apayle/t&ryvpy.

Miche! Goldman pour ion accueiL aa ieln de/ VTMI, pour ion^ écout&i ion ûnplCcatCchv et nondreur^ encouraqe4nenty.

Dominique Dewit pour yon encadr&ment au/ court de/ o&i/ deAAr/ diervdère/y^

O/tonée^. MercO pour tey- conyeily, ta ^erdiHeyye/ et ton/ humour, maCy également pour tey correettony efCpi^eyyey.

Marcelle Van Mechelen et Philippe Hermand pour leAAr coUahorcctUm/trèy profeyyiOŸineUe/eru reyt<xrd (xcce^yihle/et diypovuMe/. CefuturuplcUyirde^tra/ceiller cu/eovouy.

Séverine Thomas. Un tout grand merci/ pour ton youtien technique/ et logistique/ yuper efficace/. Certainey manipy m/ourcUent yemblé/ interminabley yanytoi/. Maiyj&/tieny auyyi/àte/remercier pour ton awiitié/et tahonne/humeur.

Toute/ Véquipe de/ yupery coUèguey : Laure, long, Muriel, Aurore, David, Emmanuel 1 e, pour leur yympathie, leur bonne humeur et le co-voiturage. Pour ley coury intenyify yur ley béhéy et ley tutuy, ley hvbiy, etc/... Maiy auyyO yur ley escargoty, la french Manucure et ley chinoiyeriey. Toufoury à Vécoute, disponibley et prêty à aider. Bref dey coUèguey en or, même bien pluy que dey coUèguey.

(5)

Stan et Stéphane pour leury réfLe^Uony pertlney\te^. Merci/ Stcu^/ pour tow cUde/, tey comeily, tow a\/iy parfoCy tyanché/ quand/ nouy héiitCowy a^/ec' Vorrunique/.

Laurence et Ester qui/nouy facUitent </quxytCdien: Louwence/qui/

donner Valerte/ dèy que/ le/ ion^ eyt cwrOvé/, Eiter qui/ dCitrCbue/ henucoup trop de/

horJyowy. Merci/pour votre/yyurire/et votre/dé^ouemerCt.

Merci/ uuyiO du touy ley "IMI peop1 e" qui/ font tout pour qu/CL y fuae/ how vüvre/.

Je/ voudraty remercier Vi ncent, ma/ fumiUe/ et mou heUe/ famCüe/ pour leur yyutiew, leury encourugemerty, pour m/’a\/oir écoutée/ ley Joury de/ ioleit et ley Jour y de/ pluie/. Je/ vouy remercie/ d/ être/ leu pour moi/.

Enfin, touyleygeny, qui/de/prèyou/de/loin, OY\tparticiJ)é/à/cette/Thè^e/qui/

m’O/ opprLy énormément de/ choie^.

II

(6)

f^ésumé de la thèse

Une compréhension fine et détaillée ciblant les mécanismes d’action de nouvelles molécules adjuvantes sur notre système immunitaire vise de manière directe à l’élaboration de nouveaux vaccins plus ciblés et plus efficaces, mais aussi à élargir nos connaissances quant à l’induction d’une réponse immune protectrice.

Au cours de cette thèse nous avons voulu comprendre les modes d’action de deux molécules lipidiques distinctes.

La première est le lipide cationique diCu-amidine dont il avait été démontré une action sur les cellules dendritiques en culture par une voie qui restait à élucider. Ce lipide cationique s'organise sous forme de liposomes en milieu aqueux et peut s'associer à de nombreux antigènes. La seconde est un analogue synthétique de l'adjuvant monophosphoryl lipide A (MPL), un dérivé du LPS, nommé CRX- 527. A l'instar de sa molécule parente, le CRX-527 active le récepteur TLR4 et est considéré comme un adjuvant potentiel de vaccin ou comme immunostimulant isolé.

Au cours de notre travail, nous avons démontré que la diCn-amidine active les cellules cibles via le récepteur TLR4. En effet, l'absence de ce récepteur abolit les réponses induites par le lipide cationique diCn-amidine et la transfection du gène codant pour TLR4 rend répondeuses des cellules qui n'exprimaient pas ce récepteur. De plus, la diCn-amidine active et mature des cellules dendritiques, aussi bien de provenance murine qu'humaine, suggérant qu'elle puisse être utilisée en tant qu’adjuvant. Il avait d’ailleurs été précédemment décrit que l'injection d'un complexe diCu- amidine / allergène chez la souris induisait une réponse immune suffisîmte pour conférer une protection contre cet allergène. Dans ce contexte, nous avons caractérisé au niveau cellulaire la réponse induite suite à l'injection du complexe diC14-amidine / ovalbumine chez la souris. Cette réponse se manifeste par une production d'IFNy lors d'une re-stimulation ex vivo par l'antigène OVA.

En ce qui concerne la molécule CRX-527, nous nous sommes particulièrement focalisés sur le rôle du co-récepteur du TLR4, le CD14, dans les réponses innées induites par le CRX-527. Nous avons établi que, de manière inattendue et contrairement à la plupart des ligands TLR4, le CRX-527

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induit la production de nombreuses cytokines et chimiokines en complète absence de CD 14, même à faible dose. De plus, l'ajout de CD14 sous sa forme soluble ne modifie pas le niveau des réponses associées à la voie de signalisation MyD88 / NF-kB. Cependant, il semblerait que la stimulation de cellules par du CRX-527 en présence de CD 14 soluble recombinant, favorise plutôt la voie TRIF / 1RF3, comme le suggère l'augmentation du taux de production d'IFNp et d'activation d'lRF3. La molécule CD14 (membranaire et/ou soluble) ne serait donc pas qu'un simple transporteur de ligands, comme il l'a été décrit par le passé, mais bien une protéine impliquée dans la modulation des réponses induites lors de l'activation du TLR4. Le CD14 jouerait donc un rôle, aussi bien au niveau de la discrimination des ligands, que celle des voies de signalisation activées.

IV

(8)

/Abréviations

Alum sels d'aluminium

ADN acide désoxyribonucléique

AGP Aminoalkyl Glucosaminide 4-Phosphate AP-1 Activating Protein - 1

APC Antigen-Presenting Cells ou Cellules Présentatrices d'Antigène ARN acide ribonucléique

ASC Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CARD BIR Baculoviral Inhibitor of apoptosis protein Repeat containing domain BM-DC Bone Marrow Dendritic Cell

CARD Caspase Activation and Recruitement Domain CHO Chinese Hamster Ovary

CLR C-type Lectin Receptor CTL Cytotoxic T Lymphocyte

DAI DNA-dependent Activator of Interferon-regulatory factors DAMP Damage Associated Molecular Pattern

DC Dendritic Cell

DC-Chol 3B-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride DDA DimethylDioctAdecylammonium

diCi4-amidine N-t-butyl-N’-tétradécyl-3-tétradécylamino-propionamidine DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane

DOTMA 1,2-di-0-octadecenyl-3-trimethylammonium propane EMCV EncephaloMyoCarditis Virus

ERK Extracellular signal-Regulated Kinase

FADD FAS-Associated Death Domain-containing protein GPI glycosylphosphatidylinositol

HBV Hépatite B Virus

HDL High-Densily Lipoprotein HEK Human Embryonic Kidney cells HPV Human Papilloma Virus

HSV Herpes Simplex Virus

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iE-DAP y-D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid IFN Interferon

Ig Immunoglobuline IkB Inhibitor kB IKK IkB Kinase IL Interleukine

IL-IR Interleukine-1 Receptor IPAF ICE Protease Activating Factor IPS-1 IFNP Promoter Stimulator I IRAK IL-I Receptor — Associated Kinase IRF Interferon-Regulatory Factor

ISRE Interferon-Stimulated Response Elément JNK c-Jun N-terminal Kinase

LAL aggégation de Lysats d'Amébocytes de Limule LBP Lipopolysaccharide Binding Protein

LGP2 Laboratory of Genetics and Physiology 2 LPS Lipopolysaccharide

LRR Leucine-Rich-Repeat LIA LipoTeichoic Acid Mal MyD88-Adaptor-like

MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase mCD14 membrane-bound CD 14

MCMV Murine CytoMegaloVirus MD-2 Myeloid Differentiation-2

MDA5 Melanoma Differentration-Associated gene 5 MDP Muramyl DiPeptide

MHC Major Histocompatibility Complex Mo-DC Monocytes-derived Dendritic Cell MPL MonophosPhoryl Lipid A

MyD88 Myeloid Différentiation primary-response gene 88 NF-kB Nuclear transcription Factor-icB

NK Natural Killer NLR NOD-like Receptor

NOD Nucléotide binding and Oligomérization Domain OVA Ovalbumine

PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern pDC plasmacytoid Dendritic Cell

PNH Paroxysmal Noctumal Hemoglobinuria

VI

(10)

polyI:C polyInosine-polyCytidylic acid PRR Pattern Récognition Receptor PYD Pyrin Domain

RICK RIP-like Interacting Caspase-like apoptosis regulatory Protein kinase RIG-1 RNA helicase retinoic-acid-Inducible Gene - 1

RLH RIG-l-like RNA Helicase RSV Respiratory Syncytial Virus

SARM Stérile a- and Armadillo-Motif-containing protein sCD14 soluble CD14

TAB2 TAKl-Binding protein 2 TAKl TGF-P Activated Kinase 1 TBKl TANK-Binding Kinase 1

TGF-P Transfonning-Growth-Factor beta Th T-helper

TIR Toll/InterIeukine-1 Receptor

TIRAP Toll/IL-IR domain-containing Adaptor Protein TLR Toll-like Receptor

TNF-a Tumor Necrosis Factor - alpha) TRAF TNF Receptor-Associated Factor TRAM TRIF-Related Adaptor Molécule

TRIF TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFNP VSV Vesicular Stomatits Virus

WNV West Nile Virus

WT Wild Type, sauvage, ou non-muté

(11)

'J'abtc des Matières

I

ntroduction

- 1 -

1/ La vaccination...- 1 -

1.1. Bref historique de la vaccination__________________________________________________ -1 - 1.2. Le défi actuel de la vaccination -1 - 2/ Les récepteurs du système immunitaire inné, sentinelles détectant la présence de pathogènes...- 3 -

2.1. Description des familles de récepteurs PRRs__________________________________________ - 3 - 2.1.1. Caractéristiques des PRRs... - 3 -

2.1.2. Les récepteurs TLRs (Toll-like receptors)... - 4 -

2.1.3. Les récepteurs RLHs (RIG-l-like RNA Helicases)... - 6 -

2.1.4. Les récepteurs NLRs (NOD-like receptors)...-1 -

2.2. Les récepteurs PRRs détectent diverses classes de pathogènes______________________ - 9 - 2.2.1. La détection des bactéries par les PRRs...- 9 -

2.2.2. La détection des virus par les PRRs...- 12 -

3/ La signalisation des TLRs (Toll-like receptors) - rôle des différentes molécules impliquées dans les réponses induites...- 15 -

3.1. Les cascades de signalisation associées aux TLRs___________________________________-15 - 3.1.1. Les molécules adaptatrices associées aux TLRs... - 15 -

3.1.2. L'activation des facteurs de transcription NF-kB et AP-1 et la production de cytokines inflammatoires... - 17 -

3.1.3. L'activation des facteurs de transcription de la famille des IRFs et la production des Interférons de type I...- 18 -

3.2. Le TLR4, récepteur du LPS (lipopolysaccharide)_____________________________________ - 19 - 3.2.1. L'activation du TLR4 par le LPS... - 19 -

3.2.2. Rôle de la LBP (LPS Binding Protein) dans l'activation du TLR4...- 21 -

VIII

(12)

3.2.3. Le CD14, un co-récepteur membranaire ou plasmatique du TLR4...- 23 - 3.2.4. Le MD-2...-26-

4/ Les ligands du TLR4 et leurs effets sur les cellules du système immunitaire inné & adaptatif...- 28 -

4.1. Le LPS________________________________________________________________________-28- 4.2. Le MPL (MonophosPhoryl Lipid A)______________________________________________ - 30 - 4.3. Les AGPs (Aminoalkyl Glucosaminide 4-Phosphates)____________________________ - 32 -

5/ Les lipides cationiques...- 34 -

5.1. Propriétés des lipides cationiques_______________________________________________ - 34 - 5.2. Les liposomes cationiques et le système immunitaire_____________________________ - 35 - 5.2.1. Effets des liposomes eationiques seuls... - 36 - 5.2.2. Les liposomes cationiques en tant qu'adjuvant de vaccin... - 36 - 5.2.3. Association d'un immunomodulateur aux liposomes cationiques... - 37 -

5.3. La diCi4-amidine - 37 -

B

ut du

T

ravail

- 40

-

R

ésultats

- 42 -

1/ Mise en évidence du récepteur activé par les liposomes de diCi4-amidine___________ - 42 - 1.1. Résultats préalables aux recherches effectuées... - 42 - 1.2. Résumé des résultats obtenus dans la première publication intitulée "Les liposomes

cationiques de diCu-amidine stimulent des cellules dendritiques myéloïdes via TLR4 (Toll-like receptor 4)"... - 42 - 1.3. Résultats supplémentaires...- 51 - 2/ Implication du CD14 dans l'activation du TLR4 par le CRX-527_______________________ - 54 - 2.1. Résultats préalables aux recherches effectuées... - 54 - 2.2. Résumé des résultats obtenus dans la seconde publication intitulée "Les réponses CD 14 indépendantes induites par un composé synthétique mimant le lipide A" - 54 - 2.3. Résidtats supplémentaires... - 66 -

(13)

D

iscussion -

70

-

1/ La diCi4-amidine -70-

2/ Le CRX-527 -76-

3/ Conclusion générale -81 -

B

ibliographie -

83

-

A

nnexes -

106

-

Publications supplémentaires : - 106-

X

(14)
(15)
(16)

1 NTRODÜCTION

l_a vaccination

1.1. Bref historique de la vaccination

Le principe de la vaccination fut découvert par Edward Jenner en 1796. Il observa en effet que les individus en contact avec des bovins infectés par le virus de la vaccine (cowpox ou variole bovine) étaient protégés d'une infection par la variole. Jetmer inocula donc la vaccine à un jeune garçon ; il développa une maladie légère qui disparut rapidement. Ensuite, le garçon fut infecté cette fois-ci par la variole, et il ne développa pas la maladie. Jenner venait de mettre au point la vaccination antivariolique. Par la suite, Louis Pasteur élargira le principe du vaccin à d'autres maladies infectieuses telles que le choléra des poules et le charbon des ruminants. Ces travaux menèrent Pasteur à l'élaboration d'un vaccin contre la rage, avec en 1885 la première vaccination d'un enfant mordu par un chien enragé, [livre intitulé "L'Histoire des vaccinations"]

Depuis cette époque, un grand nombre de vaccins composés de pathogènes vivants, atténués ou tués, et par la suite des vaccins synthétiques ont été mis au point, permettant une avancée importante dans la lutte contre la maladie.

1.2. Le défi actuel de la vaccination

Les premiers vaccins élaborés par Pasteur étaient composés du pathogène dont la virulence avait été atténuée (comme par exemple le vaccin contre la rage). Ce type de vaccins traditionnels ne nécessitent pas l'addition d'un adjuvant (composé qui est ajouté afin d'augmenter les réponses immunes) car ils stimulent suffisamment le système immunitaire par leurs propres constituants. De la même manière, les vaccins constitués du pathogène entièrement inactivé sont souvent suffisamment

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immunogènes sans adjuvant (par exemple, le virus de l'Hépatite A). Par contre, dans les vaccins synthétiques ou recombinants, l'antigène choisi est une protéine qui, dans la majorité des cas, active trop faiblement le système immunitaire. De ce fait, la formulation de cet antigène avec un adjuvant est essentielle. Bien que la mise au point de tels vaccins semble moins évidente, ils présentent une série d'avantages non négligeables, et parmi ceux-ci, une amélioration de leur production qui est mieux standardisée et maîtrisée et, de la sécurité du vaccin car les risques sont plus facilement contrôlables.

Néanmoins, les vaccins recombinants présentent encore toute une série de limitations. Par exemple, les vaccins contre le HBV (Hépatite B Virus) ou le HPV (Human Papilloma virus), qui sont composés, entre autre, de sels d'aluminium (ou Alum) à titre d'adjuvant, ont démontré leur efficacité pour induire une réponse humorale (avec la production d'anticorps spécifiques), mais pas de réponse cellulaire significative (c'est-à-dire une réponse des lymphocytes T qui est spécifique de l'antigène).

Remarquons que l'Alum fut pendant longtemps le seul adjuvant autorisé chez l'homme. Suite à la difficulté d'induire des réponses cellulaires, l'élaboration d'un vaccin contre certains pathogènes comme la malaria ou la tuberculose est moins aisée. En effet, la lutte contre ces maladies nécessite non seulement l'induction d'une immunité humorale efficace, mais aussi une forte immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T CD4^ et CD8^ afin d'éliminer les cellules infectées. C'est pourquoi, les sels d'aluminium étant de très mauvais inducteurs de la réponse cellulaire, la mise au point de nouveaux adjuvants à médiation cellulaire est cruciale pour le développement de tels vaccins. [1]

Actuellement, le développement de nouveaux vaccins implique donc la mise au point de nouveaux adjuvants. La majorité des récepteurs ciblés par ces nouveaux adjuvants sont les PRRs (Pattern Récognition Receptors), dont nous discuterons dans le paragraphe suivant. Les PRRs étant une cible prometteuse, l'étude de ces récepteurs, et notamment les réponses induites suite à l'administration de leurs ligands, a décuplé au cours des dix dernières années. Remarquons que les PRRs font partie du système immunitaire inné et qu'ils sont portés notamment par les cellules présentatrices d'antigènes (ou APCs : Antigen-Presenting Cells). De fait, la stimulation de ces récepteurs mène à l'activation des cellules du système immunitaire inné, et à la présentation des antigènes aux lymphocytes T et B spécifiques, aboutissant au déclenchement de la réponse adaptative.

En conclusion, l'identification de ligands des PRRs qui induisent des réponses spécifiques et adaptées à la maladie pourrait mener à l'élaboration de nouveaux vaccins ciblant des pathologies actuellement incurables.

-2-

(18)

2y/l^cs récepteurs du système immunitaire inné, sentinelles détectant la présence de pathogènes

2.1. Description des familles de récepteurs PRRs

2.1.1. Caractéristiques des PRRs

Le rôle physiologique des récepteurs PRRs est de détecter la présence d'un pathogène qui a infecté les tissus de l'hôte, afin de déclencher l'activation du système immunitaire. Les pathogènes sont ainsi reconnus par les cellules du système immunitaire inné via ces récepteurs spécialisés dans la détection de structures moléculaires uniques aux microorganismes, les PRRs. Leurs ligands naturels sont des molécules issues de pathogènes dénommées PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns) ou, de manière plus générale, des composés qui signalent la présence d'un danger, DAMPs (Damage Associated Molecular Pattern). Vers 1989, Janeway écrivait que les PAMPs sont adéquats à la détection par le système immunitaire inné pour trois raisons : 1) ces molécules ne varient pas parmi les microorganismes d'une classe donnée, comme c'est le cas de diverses bactéries qui ont des PAMPs en commun ; 2) elles sont uniques aux microorganismes, permettant la discrimination entre les molécules du soi et du non-soi ; 3) elles jouent un rôle clé dans la physiologie du microorganisme et sont donc essentielles à sa survie ; c'est pourquoi ces molécules vont très peu évoluer pour échapper à la détection par le système immunitaire inné [2].

Chaque PRR reconnaît une catégorie de PAMPs donnée. Bien que ces récepteurs fassent partie du système immunitaire inné, ils présentent une certaine spécificité. En effet, la détection d'un PAMP mène à l'activation de cascades de signalisation afin de déclencher une réponse anti-pathogène qui est, dans une certaine mesure, adaptée au microbe présent [3]. De fait, tous les PRRs n'activent pas les mêmes mécanismes de défense. Mais, de manière générale, leur activation par un pathogène induit une réponse inflammatoire et la phagocytose du microorganisme. Ces réponses immunes permettent l'activation des cellules présentatrices d'antigènes (APCs) qui vont migrer Jusqu'au ganglion lymphatique drainant afin de présenter les antigènes via les molécules MHC (Major Histocompatibility Complex) I et II aux cellules du système immunitaire adaptatif, telles les

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Figure 1 : Localisation des différents récepteurs TLRs, ainsi que les PAMPs reconnus par chaque récepteur. (Image provenant de la référence n°14).

Figure 2 : Les récepteurs TLRs sont composés d'un domaine intracytoplasmique homologue à celui du récepteur de l'IL-l. Ces régions intracytoplasmiques contiennent un

domaine TIR. (Image provenant de la référence n°20).

-À-

(20)

lymphocytes T CD4^ et CD8^. En conclusion, les PRRs sont des récepteurs du système immunitaire inné, dont l'activation par des pathogènes peut aboutir à l'induction d'une réponse spécifique médiée par les lymphocytes B et/ou T [2; 4],

Il existe plusieurs familles de récepteurs PRRs. Parmi elles, la plus investiguée est actuellement est la famille des TLRs (Toll-like Receptors) qui sont des récepteurs transmembranaires localisés à la membrane cytoplasmique ou endosomiale. D'autres récepteurs PRRs situés dans le cytoplasme des cellules de l'hôte jouent également un rôle important dans la détection des pathogènes.

Parmi eux, la famille des RLHs (RIG-l-like RNA Helicases) et la famille des NLRs (NOD-like Receptors). Bien que d'autres récepteurs sont décrits dans la littérature pour leur rôle dans les réponses immunes innées (CLRs : C-type Lectin Receptors, scavenger receptors, système du complément), nous nous limiterons à la description de ces trois grandes familles de récepteurs PRRs dans les paragraphes suivants.

2.1.2. Les récepteurs TLRs rToll-like receptors)

Au cours des années 1940, les microbes furent fractionnés puis injectés chez le mammifère afin d'isoler et de caractériser la (ou les) molécule(s) responsable(s) de la réponse inflammatoire. L'une des premières molécules identifiées et étudiées en détail fut le LPS (lipopolysaccharide). Depuis lors, d'autres composés microbiaux furent découverts, tels que l'ARN (acide ribonucléique) double brin, l'ADN (acide désoxyribonucléique), le peptidoglycane et les lipopeptides [5]. Le LPS fut d'abord référencé comme une "endotoxine" résistante à la chaleur, associée aux bactéries Gram négatives (voir paragraphe sur la détection des bactéries par les PRRs), et capable d'induire l'état de choc et la mort chez le cobaye [5]. Ce n'est que 50 ans plus tard, en 1990, que le groupe de Wright identifie le CD14 comme le récepteur du LPS. Toutefois, le CD 14 est une protéine à ancre GPI (glycosylphosphatidylinositol) ce qui signifie qu'elle ne possède pas de domaine transmembranaire.

Cette découverte n'expliquait donc pas la transmission du signal à l'intérieur de la cellule et le mécanisme d'activation des cascades de signalisation [6]. D'autre part, le groupe de Jules Hoffman démontre, en 1996, que le récepteur Toll, connu pour son importance essentielle dans la différenciation dorso-ventrale de la drosophile au court de l'embryogenèse, joue un rôle clé dans l'immunité anti-fungique chez cette mouche [7]. Au cours des armées suivantes, l'existence, chez l'homme, d'un récepteur homologue au Toll de la drosophile fut décrite par Medzhitov et Janeway et

(21)

Th1 -cel-promoting pathogen molacules {8uch as the TLR Ugands LPS, CpG-contalnlng DNA and viral RNA)

I

L-1pandTNF IFN-y

• 1^1 -type responaes

• Pro-lnllammatory responses

• Immunlty to Intracelular pathogens

• (Autolmmune dseases)

Figure 3 : Les ligands des récepteurs TLRs activent les cellules du système immunitaire inné, ce qui peut aboutir à l'activation des lymphocytes T, cellules du système

immunitaire adaptatif. (Image provenant de la référence n°23).

Imminaitiiiiulim Ctllulw lidaradion Typa of iminint rapoin*

TLA ligands

Bacterïal lipopaptida, lipoprotein and lipoCeidioic acid; mycobacterial TLR-2, ia. 2/6 Th1, antibody (Ab), NK ceM lipogl^an; yeast zymosan, porin

Viral double strandsd RNA TLR-3 NKcall

Lipopolyiactharide. Upid A monophoiphorYl lipid A (MPL*I. AGPt TLR4 Sirong Thl, Ab

Flagelin TLR-5 Thl, CTL, Ab

Viral singla strandad RNA, imkiazoquinolinM TLR-7/8 Strong Thl. CTL

Bacterial DNA. Q>G DNA. bemozoin TLR-9 Strong Thl, CTL and Afa^‘ NK caM

Uropadwgenic bacterla, prctozoan profilln TLH-11 Thl

Table I : Exemple de réponses adaptatives induites par les ligands des récepteurs TLRs.

(Image provenant de la référence n°l).

(22)

baptisée "human ToH" puis TLR (Toll-like receptor) [8], Ce n'est finalement qu'en 1998 que Poltorak et ses collègues découvrent le récepteur transmembranaire du LPS, le TLR4 [9].

Depuis, dix TLRs différents ont été mis en évidence chez l'homme et douze chez la souris. Ces deux espèces partagent les TLRs 1 à 9, le TLRl 0 n'est présent que chez l'homme, alors que les TLRs 11, 12 et 13 n'ont été identifiés que chez la souris [5], Tous ces récepteurs se présentent sous la forme d'homodimères ou d'hétérodimères capables de détecter des PAMPs distincts provenant de microorganismes tels que les bactéries, les virus, et les champignons [10], Le TLR2 peut former un hétérodimère avec le TLRl ou le TLR6 pour reconnaître des lipoprotéines et lipopeptides [11;12] ; le TLR4 détecte la présence de LPS [9] ; et le TLR5, de la flagelline [13]. Ces TLRs sont exprimés à la membrane cytoplasmique ce qui leur permet de détecter la présence de leur ligand dans le milieu extracellulaire (figure 1) [14], Enfin, le TLRS, les TLRs7/8 et le TLR9 qui sont exprimés à la membrane endosomiale lient différents types d'acides nucléiques [15-17] présents dans la lumière de l'endosome (figure 1) [18], C'est principalement l'étude des souris déficientes pour un récepteur TLR donné qui a permis de déterminer ou de confirmer le rôle des différents TLRs et de les associer à différents PAMPs [19],

Les TLRs sont des récepteurs transmembranaires de type 1, caractérisés par un domaine extracellulaire composé de motifs répétés LRRs (Leucine-Rich-Repeat) et d'une partie cytosolique homologue au récepteur de l'interleukine 1 (IL-IR) appelée TIR (Toll/Interleukine-1 Receptor) (figure 2) [20]. Les motifs LRRs sont composés de 24 à 29 acides aminés et permettent la reconnaissance des PAMPs ; le domaine TIR, long de 200 acides aminés est nécessaire à la transmission du signal en aval du récepteur [18;21;22].

En terme d'inflammation, les ligands des récepteurs TLRs activent les macrophages (figure 3) [23], ils sécrètent alors des cytokines pro-inflammatoires, notamment le TNF-a (Tumor Necrosis Factor alpha), l'IL(Interleukine)-ip et l'IL-6, qui coordonnent la réponse inflammatoire locale et systémique [2], D'autre part, l'activation des cellules dendritiques par les ligands des TLRs mène au déclenchement d'une réponse dite "adaptative" par la présentation de l'antigène aux lymphocytes T naïfs. Différents types de réponses adaptatives seront induites selon le contexte cytokinique et cellulaire. Cependant, il a été montré que la plupart des ligands des TLRs sont de bons inducteurs de la réponse de type Th-1 (T-helper 1) (table I) (figure 3) [1].

Nous discuterons et décrirons en détail le pattern de signalisation des récepteurs TLRs dans les chapitres suivants.

(23)

______ Heücaae Domain:___________^

Conformatlonal Change ?

SIgnaltng Domain binding

ConsBfved helicase motifs Répression Oolliain GARD

1 % 1 la II III IV V VI 925

A ?>A \

T55I : 1

\ K270 ; ATP Binding

\K 1(

23 3

e

41 \

-i,

y

... ^

RJirkAC* —F—^

% \

LGP2:

Figure 4 : Représentation schématique des différents domaines qui composent les récepteurs RLHs. (Image provenant de la référence n°25).

Figure 5 : Modèle d'activation de RIG-1 et MDA5 par de TARN. (Image provenant de la référence n°34).

(24)

2.1.3. Les récepteurs RLHs (RIG-l-like RNA Helicases).

Dans le chapitre précédent, nous avons mentionné que des acides nucléiques présents dans l'endosome sont reconnus par les TLRs. Cependant, certains ARNs apparaissent également dans le cytoplasme de la cellule résultant, par exemple, d'une réplication virale. Ces séquences de nucléotides pathogènes sont détectées par des récepteurs PRRs cytoplasmiques appelés RLHs (RJG-l-like RNA Helicases). Le premier récepteur découvert de ce type fut RIG-1 (RNA helicase retinoic-acid- inducible gene I) [24] et les principaux membres de cette famille RLHs sont RIG-1, MDA5 (Melanoma Differentration-Associated gene 5), et LGP2 (Laboratory of Genetics and Physiology 2) [25j.

RlG-1 et MDA5 sont deux récepteurs homologues (figure 4) [26], Ces récepteurs, ayant pour fonction la détection d'acides nucléiques intracytoplasmiques, lient l'ARN par leur domaine C- terminal, alors que le domaine N-terminal (CARDs : Caspase Activation and Recruitement Domains) induit la transduction du signal par activation de molécules adaptatrices [2]. Le troisième membre de cette famille, LGP2 présente également une forte homologie avec RIG-1 et MDA5 mais il ne possède pas de domaine CARD (figure 4).

Malgré leur homologie, RIG-1 et MDA5 ne sont pas activés par les mêmes ligands [27]. Par exemple, les ARNs simples brins qui présentent une structure triphosphate à leur extrémité 5' sont détectés par RIG-1 [28;29]. Cette structure 5'-triphosphate est générée par de nombreuses ARN- polymérases virales, mais pas par la machinerie cellulaire de l'hôte. C'est pourquoi les ARNs endogènes ne sont pas détectés par les RLHs. De plus, ces ARNs endogènes sont généralement simples brins et ils possèdent une structure CAP, comme les ARNs messagers, qui empêche donc l'activation des récepteurs RLHs [30].

Une seconde caractéristique importante pour la discrimination entre l'activation de RIG-1 ou de MDA5 est la longueur des ARNs [31]. Par exemple, le ligand synthétique, analogue d'ARN double brin, le polyLC (polyinosine-polycytidylic acid) (qui est connu pour activer le TLRS lorsqu'il se trouve dans l'endosome) active MDA5 s'il est localisé dans le milieu intracytoplasmique [32]. Toutefois, la digestion de polyLC en plus petit fragments modifie l'implication de MDA5 dans la détection de ce ligand. En effet, les molécules résultantes sont majoritairement détectées par RIG-1, et non plus par MDA5 [31]. MDA5, lie donc des ARNs doubles brins de plus grande taille que ceux détectés par le récepteur RIG-1 [31].

(25)

(Image provenant de la référence n°26).

(26)

Enfin l'ADN double brin, présent dans le cytoplasme d'une cellule, est détecté par DAI (DNA- dependent Activator of Interferon-regulatory factors), une molécule cytosolique dont la fonction biologique n'était pas connue avant qu'elle ne soit impliquée dans la détection d'acides nucléiques [33].

D'un point de vue mécanistique, l'activation de RJG-1 résulterait d'un changement conformationnel du récepteur. A l'état basal, le monomère adopte une forme repliée sur elle-même (figure 5) [34] et c'est la liaison de l'ARN qui induit un changement conformatiormel qui permet l'activation de la molécule adaptatrice IPS-1 (IFNP Promoter Stimulator 1) [35]. IPS-1 interagit avec TRAF3 (TNF Receptor-Associated Factor 3) afin d'activer TBKl (TANK-Binding Kinase 1) et IKKi (IkB Kinase i ; également appelée IKKe), puis les facteurs de transcription IRF3 (Interferon- Regulatory Factor 3) et IRF7 (Interferon-Regulatory Factor 7), aboutissant à la production d'IFNs (Interferons) de type 1 (figure 6). Les IFNs de type 1 comprennent notamment l'IFNP et de multiples isoformes de l'IFNa. RIG-1 induit également la production de cytokines pro-inflammatoires par interaction de IPS-1 avec FADD (FAS-Associated Death Domain-containing proteln) qui active le facteur de transcription NF-kB (Nuclear transcription Factor-KB) (figure 6) [25].

Le troisième membre de la famille des RLHs est LGP2. Il ne possède pas de domaine GARD, et il n'induit donc pas la production d'IFNp. De plus, en absence de LGP2, le polyLC intracytoplasmique induit une forte production d'IFNs de type I [36]. Par conséquent, LGP2 pourrait jouer un rôle inhibiteur sur l'activité de RIG-1 et/ou MDA5, mais cette notion reste controversée et nécessite de nouvelles investigations.

2.1.4. Les récepteurs NLRs (NOD-Mke receotors).

Les NLRs (NOD-like receptors) sont une famille de récepteurs PRRs intracellulaires contenant plus de 20 membres classés en sous-familles (figure 7) [37]. Ils sont caractérisés par la présence d'un domaine NOD (Nucléotide binding and Oligomérization Domain), également appelé NACHT[38].

Les NLRs sont composés de trois domaines importants : un domaine de liaison effecteur, un domaine central contenant le NOD et un domaine de reconnaissance du ligand [38-40]. L'extrémité C- terminale contient une région LRR qui permet la détection de PAMPs et l'activation du récepteur. La région intermédiaire du récepteur est un domaine de type NOD. Cette région est nécessaire à l'oligomérisation du récepteur par interaction entre leurs domaines NODs. Enfin, à l'extrémité N-

(27)

r

NOD ^

subfamily

V.

NALP ^

subfamily

IPAF

subfamily V

{

Nod1 Nod2 NLRC3 NLRC5 NLRX1 Nalpl Nalp2-9 11-14 Nalpl 0

IPAF NAIP

CIITA

Figure 7 : Représentation schématique des différents domaines des récepteurs appartenant à la famille des NLRs. (Image provenant de la référence n°37).

(28)

terminale du NLR se situe la région effectrice qui active les voies de signalisation. On dénote trois types de régions effectrices, à savoir, CARD, PYD (Pyrin Domain) ou BIR (Baculoviral Inhibitor of apoptosis protein Repeat containing domain) qui définissent les trois sous-familles de récepteurs NLRs (figure 7) [39], A l'heure actuelle, les récepteurs NLRs les mieux décrits, sont les récepteurs NODl et NOD2, IPAF (ICE Protease Activating Factor) et Nalp3 [38],

En 2003, il a été démontré que les récepteurs NODl et NOD2 reconnaissent des molécules bactériennes produites durant la synthèse ou la dégradation du peptidoglycane (composant essentiel de la membrane bactérienne), à savoir le iE-DAP (y-D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid) qui est détecté par NODl [41;42] et le MDP (Muramyl DiPeptide) qui active NOD2 [43].

A l'état basal, le domaine LRR de ces récepteurs est replié sur le domaine NOD pour empêcher l'oligomérisation spontanée et l'activation du NLR [39]. Après la détection du PAMP par une région LRR, le récepteur subit un changement conformationnel qui déclenche son oligomérisation [44], et permet, de ce fait, le recrutement et l'activation de la molécule effectrice [45]. Pour les récepteurs NODl et NOD2, la molécule effectrice est RICK (RIP-like Interacting Caspase-like apoptosis regulatory Protein kinase ; également appelé Rip2) ]46;47]. Cette voie de signalisation active le facteur de transcription NF-kB (figure 8) et les MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases)

[39;46;48;49].

Parmi les NLRs, on distingue également la sous-famille NALP (figure 7) [40;50]. Les membres de cette famille forment un complexe de protéines désigné par le nom d'Inflammasome dont l'un des plus étudiés est l'Inflammasome Nalp3. Il est composé de Nalp3 (ou Cryopyrin), de l'adaptateur ASC (Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CARD) et de la caspase-1. La caspase-1 est responsable de la transformation des précurseurs de l'IL-ip (la proIL-lp) et de l'IL-18 (la proIL-18) en cytokines matures, ce qui permet leur sécrétion (figure 8) [51;52].

L'Inflammasome Nalp3 est activé par de nombreuses molécules, dont des composés bactériens [53-55] et des signaux endogènes de danger [55;56]. Remarquons que le groupe de Flavell a récemment montré que les cristaux d'aluminium (Alum : adjuvant le plus utilisé dans les vaccins synthétiques destinés à l'homme) active également l'Inflammasome Nalp3 [57]. En effet, bien que l'Alum soit utilisé depuis plusieurs dizaines d'années dans des vaccins, aucun récepteur n'avait été identifié avant les travaux de Flavell.

Comme d'autres Inflammasomes, l'engagement de Nalp3 active la caspase-1 qui mature l'IL- ip (figure 8). La formation de l'IL-ip mature nécessite toutefois la production préalable de la proIL-

(29)

Figure 8 : Les récepteurs PRRs intracytoplasmiques NLRs, leurs ligands et leurs cascades de signalisation. (Image provenant de la référence n°3).

Gram-positiva bacteria

Lipotelchoic acid

Gram-negative bacteria

Porin

Peptidogiycan

Figure 9 : Structure et composition de la membrane de bactéries Gram positives et Gram négatives. (Image provenant de la référence n°3).

(30)

ip (le précurseur de l'IL-ip). C'est donc un mécanisme en deux étapes qui permet la sécrétion de cette cytokine : 1) le premier signal induit l'accumulation dans le cytoplasme de la proIL-ip, il peut être régulé par un signal TLR ; et 2) un second signal active la caspase-1 qui clive la proIL-lp en IL-ip afin de sécréter la cytokine mature [50].

Enfin IPAF et NAIP5 sont également deux membres de la famille des récepteurs NLRs (figure 7) [50;58j. Ils détectent la présence dans le milieu intracellulaire de flagelline, induisant la sécrétion d'IL-ip [59-61], Il est important de remarquer que l'induction d'IL-ip par la flagelline intracellulaire ne dépend pas du TLR5 [62] parce que ce TLR reconnaît la flagelline extracellulaire.

2.2. Les récepteurs PRRs détectent diverses classes de pathogènes

2.2.1. La détection des bactéries par les PRRs

Les bactéries sont des organismes unicellulaires procaryotes dont la plupart possèdent une paroi cellulaire composée de peptidoglycanes (figure 9). Elles sont classées selon deux groupes majeurs dénommés Gram positif et Gram négatif. Cette classification, qui fut mise au point par le bactériologiste Gram, a pour critère la coloration positive ou négative de la paroi bactérienne, selon l'épaisseur du peptidoglycane. Certains composants de la membrane bactérienne sont des PAMPs reconnus par des récepteurs PRRs (figure 9), dont certains TLRs et NLRs. Ces récepteurs Jouent donc un rôle majeur dans la détection des bactéries par le système immunitaire.

Le LPS (lipopolysaccharide), ou endotoxine, est l'un des composants le plus immunostimulant de la membrane des bactéries Gram négatives (figure 9). Il est associé à des pathologies comme le choc septique survenant à la suite d'une infection bactérienne [3;63]. C'est le TLR4 qui détecte la présence de LPS dans le milieu (table II) (figure 10). Ce TLR est activé non seulement par des ligands bactériens, mais également par diverses molécules qui ne proviennent pas de bactéries, comme le taxol [64] et les Hsp (beat shock protein) 60 et 70 [65;66]. Des souris présentant une mutation dans le gène codant pour TLR4 répondent de façon atténuée aux bactéries Gram négatives. L'inhibition de ces réponses immunes augmente donc la susceptibilité des souris, lors d'une infection. Par exemple.

(31)

Tabl« 1. TLR Racognition of Microbial Componanta

Microbial Components Specfes TLR Usage

Bacterta

LPS Gram-negative bacteria TLH4

Oiacy lipopeptkiee Mycopésma TLfW/n.R2

Trtacyl ipopeptdes Bacteria and mycobacteria TLni/TLR2

LTA Group B Streptococcus TLR6/TLR2

PG Qram-positve bacteria TLH2

Port™ Neissena TLR2

Lipoambinomennan Mycobacteria TLR2

Flagelin Flagelated bacteria TLRS

CpG-ONA Bacteria and mycobacteria TLR9

ND Uropathogenic bacteria TLB11

Table II : Composants bactériens reconnus par les TLRs. (Image provenant de la référence n°3).

Figure 10 : Des composants bactériens activent les TLRs en extracellulaire et les NLRs en intracellulaire. (Image provenant de la référence n°40).

(32)

les souris déficientes pour TLR4 sont fortement susceptibles à une infection par Salmonella typhimurium, une bactérie Gram négative [67; 68],

Les bactéries Gram positives peuvent, elles aussi, stimuler le système immunitaire inné par des composants de leur membrane cellulaire. Malgré l'absence de LPS dans la composition de la membrane des bactéries Gram positives, elles contiennent du LTA (LipoTeichoic Acid), des lipoprotéines et du peptidoglycane qui sont détectés par les PRRs (figure 9). De fait, TLR2 (associé au TLRl ou au TLR6) joue un rôle important dans la détection de ces PAMPs bactériens par la formation d'un hétérodimère TLRl/2 ou TLR2/6 qui permet la détection des lipopeptides di- ou tri-acylés (table II), respectivement [69;70j. Par exemple, des souris TLR2 ''' sont fortement susceptibles à une infection par Staphylococcns aureus [71] ou Streptococcus pneumoniae [72], deux bactéries Gram positives.

Important pour la détection des bactéries flagellées, le TLR5 reconnaît la flagelline (figure 10), une protéine constituant le flagelle bactérien (table II) [13]. Une mutation dans le gène du TLR5 (TLR5^’^^™'’), chez l'homme, a été associée à une augmentation de susceptibilité aux pneumonies, causées par la bactérie flagellée Légionella pneumophila (figure 10) [73].

Chez la souris (et non chez l'homme), le TLRl 1 semble lui aussi impliqué dans la détection des bactéries, puisque les souris TLRIT^' sont susceptibles à une infection par des bactéries uropathogéniques (table II), suggérant que le TLRl 1 détecte des produits de ces bactéries [74].

Enfin, l'ADN bactérien peut être reconnu par le TLR9 (table II) [17]. Son effet stimulant est dû à la présence de séquences CpG non méthylées qui sont abondantes chez les bactéries. Au contraire, chez les mammifères, ces séquences sont fortement méthylées et leur fréquence est réduite, c'est pourquoi elles n'activeraient pas le TLR9. Comme ce TLR se situe dans l'endosome, l'ADN bactérien doit être délivré dans ce compartiment afin d'être détecté par le récepteur. Remarquons que l'expression du TLR9 dans ce compartiment intracellulaire pourrait prévenir la détection de l'ADN de l'hôte qui ne doit s'y trouver qu'accidentellement [3].

Pour résumer, la famille des TLRs est importante pour la détection des bactéries (TLRl/2, TLR2/6, TLR4, TLRS et TLR9), mais d'autres PRRs sont également impliqués. En effet, les récepteurs NLRs détectent également des composés bactériens lorsque ces microorganismes sont présents cette fois dans le cytoplasme cellulaire. Bien que la majorité des bactéries se développe à l'extérieur des cellules eucaryotes, certaines, comme Listeria monocytogenes, et Chlamydia

(33)

Microbe | PAMP PRR Site of récognition

Glycoproteins TLR2.TLR4 Cell surtace

^ 5'PPP RNA RIG-I Cytoplasm

K RNA TLR7, TLR8 Endosomes

dsRNA TLR3, MDA5, RIG-I Endosomes/cytoplasm

Genomic ONA TLR9, DAI Endosomcs/cytoplasm

Lipopeptides TLR2 Cell surface

^ ^ Lipoteichoid acid TLR2 Cell surface

Peptidoglycan TLR2 Cell surface

(( ^ LPS TLR4 Cell surface

'WW JJ Flagellin TLR5 Cell surface

CoG DNA TLR9 Endosome

B-form DNA DAI Cytoplasm

acier a Oiaminopimelic acid NODl Cytoplasm

Muramyl dipeptide NOD2 Cytoplasm

Table III : PAMPs viraux et bactériens reconnus par les PRRs. (Image provenant de la référence n°75).

(34)

trachomatis sont des pathogènes intracellulaires (facultatifs ou obligatoires) [75], Dans le milieu intracytoplasmique, ces bactéries ne peuvent donc pas être détectées par les TLRs.

Par exemple, NODl et NOD2 (figure 10) sont impliqués dans les réponses induites par de nombreuses bactéries in vitro [46;76-82). Cependant, le rôle des récepteurs NODl et NOD2 in vivo semble moins clair.

En effet, il existe une discordance entre la détection d'une bactérie par NODl ou NOD2 in vitro et le rôle protecteur de ces NLRs in vivo. Par exemple, la bactérie Chlamydia trachomatis qui est détectée par NODl in vitro, provoque une maladie comparable lors d'une infection vaginale des souris NODl'^' et des souris non-mutées [83], Cependant, NODl joue clairement un rôle lors d'une infection par Hélicobacter pylori car la déficience de NODl augmente la susceptibilité des souris [84], Remarquons que la voie d'entrée du pathogène semble déterminer l'implication des NLRs. En effet, l'infection de Listeria monocytogenes par la vole intraveineuse ou intrapéritonéale n'est pas modifiée par la déficience de NOD2, alors que cette même bactérie administrée par la voie orale rend les souris NOD2'^‘ plus susceptibles que des souris non-mutées [85].

Le rôle des récepteurs NODs dans l'initiation des réponses inflammatoires lors d'une Infection bactérienne reste donc controversé. Toutefois, de manière générale, il semblerait que la fonction prédominante de NOD2 dans l'immunité anti-bactérienne intervienne plutôt au niveau local que de façon systémique. En plus, il est possible qu'il y ait moins de redondance avec d'autres PRRs localement qu'au niveau systémique [39;40j.

En plus de NODl et NOD2, d'autres NLRs sont impliqués. Par exemple, une infection bactérienne peut induire la maturation de l'IL-ip par la caspase-1 qui est activée par l'Inflammasome [3], et notamment l'Inflammasome Nalp3 (figure 8).

Enfin, chez la souris, les NLRs NAIP5 et/ou IPAF sont indispensables pour contrôler une infection par la bactérie flagellée Légionella pneumophila (figure 8) [86-88]. Par exemple, des bactéries Légionella pneumophila incapables de synthétiser la flagelline se multiplient robustement dans des macrophages, alors que l'infection par la souche non-mutée est limitée par la détection de sa flagelline viaNAIPS (et non par le TLRS) [61;89].

En conclusion, les bactéries sont reconnues par le système immunitaire inné via l'activation de TLRs et/ou de NLRs détectant les PAMPs bactériens (table III). Bien que ces récepteurs semblent indispensables in vitro, le rôle de chacun in vivo nécessite de plus amples investigations afin de mieux comprendre l'induction des réponses innées lors d'une infection. Une meilleure connaissance de

(35)

(î) Virus entry by *»

, • , fusion (T) Virus entry by

• ’ * %|r* endocytosis

Uncoating

(+)RNA .

Cytoplasm

Nucléus

0Repliication

^'^WiMAAnrwfü lyi/tîJ'lAruvinj

Current Opinion in immunology

Figure 11 : Mécanisme général d'infection et de réplication d'un virus. (Image provenant de la référence n°90).

Figure 12 : Les DCs et les NKs ont un rôle central dans les défenses anti-virales. (Image provenant de la référence n°93).

(36)

l'implication de chaque PRR permettrait d'adapter le traitement à administrer lors de maladies bactériennes.

2.2.2. La détection des virus par les PRRs

Tous les virus sont composés d'acides nucléiques, aussi bien ADNs que ARNs, et d'une capside, coquille protéique qui entoure le génome viral. Beaucoup de virus sont aussi entourés d'une enveloppe de phospholipides qui contient des glycoprotéines virales. Ces composants constituent les principaux PAMPs viraux reconnus par les PRRs [35].

De fait, une des conséquences des infections virales est l'introduction de nucléotides ARNs et/ou ADNs dans l'endosome et le cytoplasme (fîgure 11) [75;90]. Ces nucléotides viraux sont détectés par les cellules non-immunes infectées aussi bien que par les cellules du système immunitaire inné, telles que les macrophages et les cellules dendritiques. En effet, ces cellules vont rapidement déclencher une réponse anti-virale en produisant des IFNs de type 1 et des cytokines pro­

inflammatoires [91;92j. Les IFNs de type 1 induisent l'apoptose des cellules infectées et la résistance cellulaire à l'infection virale, en plus de l'activation des cellules NK (Natural Killer ; cellules cytotoxiques appartenant au système immunitaire inné) (figure 12) [93] et des cellules T. Par conséquent, les IFNs jouent un rôle crucial dans la réponse anti-virale innée, mais aussi dans l'activation du système immunitaire adaptatif [91].

Les nucléotides issus des virus sont reconnus par les RLHs et les TLRs [91]. La contribution respective de ces deux familles de PRRs varie en fonction de la voie d'infection du virus au niveau cellulaire (fîgure 13). De fait, les TLRs ne sont pas capables de détecter des virus localisés dans le cytoplasme. Ces derniers sont alors reconnus par les récepteurs RLHs (RIG-1 et MDA5) (figure 13) [91].

Globalement, il existe quatre classes de PAMPs viraux identifiés à ce Jour : l'ARN double brin, l'ARN simple brin, les séquences CpG non-méthylées et les glycoprotéines de l'enveloppe virale (table III) [35].

Les virus se répliquent dans les cellules infectées en utilisant la machinerie cellulaire de l'hôte.

Pour ce faire, bon nombre d'entre eux produisent de l'ARN double brin dans le cytoplasme cellulaire (figure 11) [91]. Le TLR3 fut le premier récepteur d'ARN double brin identifié [15]. Par exemple, l'implication du TLRS dans la détection de virus fut démontrée in vitro sur des cultures de DCs

(37)

Cyteplatmle viral Viral proMn EfMloaofmMyaoaofne vkal RNA racognHIon racognllion fMidaic acM racognition

Ctfrvrt OpMon «1 krvntnologr DNA

IPS-1

Figure 13 : Les PRRs détectent la présence de produits viraux selon leur localisation.

(Image provenant de la référence n°90).

Convantlonal DC

Proktflammatory tVp*i Frolnflammatory I

1 eytokinaa IFN» oytokiriM I

Figure 14 : Détection des virus par le TLR3 et les RLHs. (Image provenant de la référence n°3).

-13

(38)

(Dendritic Cells) conventionnelles ou de cellules épithéliales (figure 14) [35]. En accord avec les données in vitro, des souris TLR3'^‘ produisent moins d'IFNs de type I suite à une infection par le virus MCMV (Murine CytoMegaloVirus) comparé aux souris WT (Wild Type, sauvage, ou non-muté) [94].

Cependant, de manière surprenante, le TLR3 n'est pas impliqué dans la recotmaissance de nombreux virus alors que ceux-ci produisent des ARNs doubles brins. C'est pourquoi le rôle du TLR3 in vivo reste controversé [95;96[. De fait, non seulement le TLR3 ne permet pas la détection d'une série de virus in vivo, mais en plus, une infection par le WNV (West Nile Virus), le Phlebovirus, ou le virus de l'influenza est moins délétère pour les souris TLR3'^‘ que pour les souris WT [97-99]. En effet, malgré que ces virus soient à ARN simple brin, ils produisent des ARNs doubles brins lors de leur cycle de réplication et devraient logiquement être reconnus par le TLR3, puis éliminés. Contre toute attente, il semblerait que ces virus prennent plutôt avantages de la réponse inflammatoire induite par le TLR3.

Le rôle de ce récepteur in vivo demande donc de nouvelles investigations ]3;35[.

Beaucoup de cellules infectées produisent des IFNs de type I indépendamment du TLR3. En effet, de nombreux virus restent localisés dans le cytoplasme de la cellule infectée et ne se retrouvent donc jamais dans l'endosome. Dans ce cas, ce sont les récepteurs RLHs, RIG-1 et MDA5, qui détectent ces ARNs viraux présents dans le milieu intracytoplasmique (figure 14). Leur reconnaissance, in vivo, par les récepteurs RLHs joue un rôle important dans les défenses de l'hôte contre l'infection virale ]27;32;100[. Par exemple, les souris RIG-T^' sont plus susceptibles à une infection par le VSV (Vesicular Stomatits Virus) et les souris MDA5’^’ sont plus susceptibles au EMCV (EncephaloMyoCarditis Virus), comparé aux souris WT [91].

Un autre acteur incontournable de la réponse anti-virale est la cellule pDC (plasmacytoid Dendritic Cell). Les pDCs sont connues pour leur production importante d'IFNs de type I lors d'une infection virale [3;30;91[. Elles expriment fortement le TLR7 (qui reconnaît l'ARN simple brin) et le TLR9 (qui est activé par l'ADN présentant des motifs CpG non méthylés) (figure 15) mais pas le TLR3 [101-103]. In vitro, plusieurs virus (HSV (Herpes Simplex Virus)-1, MCMV, etc.) activent les pDCs [94; 101-103]. Encore une fois, les choses se compliquent in vivo. Par exemple, une infection par le MCMV est aggravée en absence de TLR9, alors que ce TLR n'a pas d'importance lors d'une infection locale par le HSV-1 [94;104;105]. Mais globalement, il semblerait que le TLR7 et le TLR9, portés par les pDCs, jouent un rôle in vivo, qui, toutefois, dépendrait du virus et de la voie d'infection.

Pour terminer, les glycoprotéines virales permettent également la détection des virus. Par exemple, l'activation du TLR4 par la protéine F du RSV (Respiratory Syncytial Virus) limite la réplication de ce virus in vivo [106]. Un second exemple est l'activation du TLR2 par toute une série

(39)

ProInfUmmitoiy Typ* I

cytokinw |pNt

Figure 15 : Détection des virus par le TLR7 et le TLR9 portés par les pDCs. (Image provenant de la référence n°91).

-14-

(40)

de protéines virales. Cependant, l'activation du TLR2 et/ou du TLR4 par un virus induit préférentiellement la production de cytokines pro-inflammatoires plutôt que des IFNs de type I. Par conséquent, cette détection aboutit majoritairement à de l'inflammation plutôt qu'à une réponse anti­

virale efficace [3].

(41)

MyD88

)S 3S 86e 91801^ m 235

&

a.,

H 1

1 2S0 2SS

I lll

TRIf

380 530 661 699 71

TIR

]

Myflstoyiation

TRAM

$ARM

Figure 16 : Représentation schématique des cinq molécules adaptatrices associées aux récepteurs TLRs. (Image provenant de la référence n°108).

«.-IR TUM-TLR2

or TUS or TU2-TU6 TUU TLR4

TLR7TLR8 OfTU9

SARM

Figure 17 : Vue d'ensemble des facteurs de transcription activés par les différentes molécules adaptatrices appartenant à la superfamille des récepteurs IL-IR / TLRs. (Image

provenant de la référence n° 108).

(42)

L.a signalisation des TLK^ CTolUikc reccptors) --rôle des différentes molécules implicjuées dans les réponses induites

3.1. Les cascades de signalisation associées aux TLRs

L'activation des cascades de transduction de signal (associées aux récepteurs TLRs) par un pathogène a pour but d'induire une réponse immunitaire aboutissant à la résolution de l'infection [107].

Cette signalisation, qui permet la transmission du signal de danger détecté par un récepteur, débute par le recrutement de molécules adaptatrices par le domaine intracellulaire du récepteur et aboutit à la translocation dans le noyau de facteurs de transcription, ciblant les gènes d'intérêts. Dans ce chapitre, nous décrirons tout d'abord les molécules adaptatrices et puis les principaux facteurs de transcription impliqués dans les réponses induites par les ligands des récepteurs TLRs.

3.1.1. Les molécules adaptatrices associées aux TLRs

Le signal de danger détecté à l'extérieur de la cellule ou dans l'endosome par un récepteur TLR est transmis à l'intérieur de la cellule. Les premières protéines activées dans le cytosol sont les molécules adaptatrices. La transmission d'un signal via les récepteurs TLRs peut impliquer jusqu'à cinq molécules adaptatrices : MyD88 (Myeloid Différentiation primary-response gene 88), Mal (MyD88-Adaptor-like) également appelée TIRAP (Toll/IL-IR domain-containing Adaptor Protein), TRIF (TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFNP), TRAM (TRIF-Related Adaptor Molécule) et SARM (Stérile a- and Armadillo-Motif-containing protein) (figure 16). Ces protéines permettent le couplage du récepteur avec des kinases se situant en aval de celui-ci [108;109].

Lors de l'activation des TLRs (toujours sous forme d'un dimère), la liaison du ligand induit un changement conformationnel qui rapproche les deux domaines TIRs intracytoplasmiques (figure 17) [110-112]. Ce rapprochement des domaines TIRs permet le recrutement des molécules adaptatrices.

(43)

TLR8 TUW1

TLHII TUB2/B TLR4

Cdl «urfac*

Eixjosonw TLfO TLH7 TLB9

_____ ^inittinmmorï m ^--- »Typ*IIR

Figure 18 : Cascades de signalisation des récepteurs TLRs. (Image provenant de la référence n°l 17).

(44)

La première molécule adaptatrice identifiée fut MyD88. Elle fut d'abord décrite pour son rôle dans la signalisation du récepteur de l'IL-1 (IL-IR) [113;114] puis pour son implication dans la signalisation de plusieurs TLRs (TLR2, TLR4, TLR5, TLR7/8 et TLR9) (figure 17) [115;116].

MyD88 active des cascades de phosphorylation via des kinases pour aboutir à la translocation de facteurs de transcription (NF-kB et AP-1). MyD88 recrute des membres de la famille IRAK (IL-1 Receptor - Associated Kinase) dont IRAK4 qui est la kinase la plus proche de MyD88, puis IRAKl.

La suite de la cascade implique les molécules TRAF6, TAKl (TGF-p Activated Kinase 1) et TAB2 (TAKl-Binding protein 2), puis IKK et p38 / JNK (c-Jun N-terminal Kinase) (figure 18) [117],

Cette voie de signalisation dépendante de MyD88 n'est pas la seule voie de signalisation associée aux TLRs. Par exemple, des souris MyD88'^‘ produisent des IFNs de type I en réponse au LPS [118], démontrant l'existence, au moins pour le TLR4, d'une voie de signalisation indépendante de MyD88.

Le second adaptateur découvert est Mal [119;120]. Mal est important pour la signalisation du TLR2 et du TLR4 (figure 16 & 17). Il servirait de lien entre MyD88 et le récepteur (figure 19)

[

121

;

122

].

Cependant, cette découverte n'explique pas la production de cytokines par la voie indépendante de MyD88 (TLR4 et TLR3). En effet, des cellules MaF'^' stimulées par un ligand du TLR2 ne produisent pas de cytokines, alors qu'en réponse à un ligand du TLR4, cette production n'est que partiellement inhibée (figure 17) [121;122], ce qui souligne toujours l'existence d'une autre voie.

En plus, le phénotype des cellules Mal'^' et MyD88'^' est comparable en réponse à un ligand de TLR4, suggérant que MyD88 et Mal font partie de la même voie de signalisation.

La découverte de la molécule adaptatrice TRIF (figure 16) [123] résolut le problème de l'activation d'une voie de signalisation indépendante de MyD88. TRIF est donc décrit comme l'une des molécules adaptatrice du TLR4 et la seule molécule adaptatrice utilisée par le TLR3 (figure 17). Par exemple, des souris déficientes pour TRIF sont incapables de produire de l'IFNP en réponse à des ligands du TLR3 ou du TLR4 (figure 17) [124]. De plus, en réponse aux ligands du TLR4, des cellules doublement déficientes TRIF'^' et MyD88'^' ne produisent plus de cytokines à l'instar de cellules TLR4'^' [124;125], ce qui démontre que les deux voies de signalisation sont atteintes dans les cellules doublement déficientes.

(45)

Endosome

Cytoplasm

• TUO

/ "\ cS)

TRAFS ) TAB1/M Ub

Nucléus ^ T ^ I--- ► ry

AAÇ|3A/^|f\/V^3^\AAAAAA

I ► In1

i\AA/VAAA/^|a/\^3^\AAAAAA

► Type I IFN

► Inflammatory cytokines

Figure 19 : Représentation schématique des cascades de signalisation et des facteurs de transcription activés en réponse aux ligands de TLR3 et TLR4. (Image provenant de la

référence n°138).

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Les cascades de signalisation en aval de TRIF comprennent TRAF3, TBKl et IKKi qui phosphorylent le facteur de transcription IRF3 (figure 18 & 19) [126-128], mais aussi TRAF6 qui active NF-kB (plus tardivement que par la voie dépendante de MyD88) [129].

Le quatrième adaptateur identifié est TRAM (figure 16) [130;131]. TRAM est uniquement impliqué dans la voie de signalisation dépendante de TRIF, associée au TLR4.

Enfin, la dernière molécule adaptatrice décrite à ce jour est SARM (figure 16) [132], SARM interfère avec la fonction de TRIF (figure 17) [133]. En effet, son expression bloque les réponses associées à cette voie de signalisation.

3.I.2. L'activation des facteurs de transcription NF-

k

B et AP-1 et la production de cytokines inflammatoires

La liaison d'un ligand à son récepteur TLR active les cascades de transduction de signal afin d'induire la translocation des facteurs de transcription du cytosol vers le noyau. Une fois dans le noyau, le facteur de transcription peut interagir avec la région promotrice d'un gène régulant la production de la protéine codée par ce gène. Les principaux facteurs de transcription activés en réponse aux ligands des TLRs sont NF-kB, AP-1 (Activating Protein - 1) et la famille des IRFs.

NF-kB est un facteur de transcription qui est associé, dans la signalisation des TLRs, aux réponses inflammatoires [20]. En plus de son importance pour les réponses immunes, NF-kB est impliqué dans la survie, la prolifération et la différentiation cellulaire [134].

NF-kB est maintenu inactif dans le cytoplasme par IkB (Inhibitor kB) (figure 19) [135]. Suite à une stimulation par divers ligands des TLRs, IkB est phosphorylé par le complexe IKK [136; 137], puis dégradé ce qui libère NF-kB. Le facteur de transcription migre alors dans le noyau où il se lie aux promoteurs des gènes qui contiennent des sites kB [134;138]. NF-kB est activé par des ligands de tous les TLRs décrits jusqu'à ce jour. Son activation nécessite la présence de MyD88 (TLR2, TLR4, TLR7/8 et TLR9), mais aussi de TRIF (TLR4 et TLR3) (figure 18 & 19). Ce facteur de transcription est associé à la production et la sécrétion de cytokines et chimiokines inflammatoires.

Un second facteur de transcription, AP-1, induit des médiateurs de l'inflammation [138]. Il est activé par les MAPKs, telles que JNK, p38 et ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) [138] qui sont elles-mêmes phosphorylées par TAKl (figure 19) [139].

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