Le CD14. un co-récepteur membranaire ou plasmatique du TLR4

Comme nous l'avons décrit dans le chapitre précédent, la LBP transfère le LPS de la membrane bactérienne ou de micelles / agrégats vers le CD 14 (figure 23). Ce CD 14 existe sous deux formes, soluble ou membranaire (figure 23). La forme membranaire du CD 14, le mCD14 (membrane- bound CD 14), est une protéine à ancre GPI exprimée constitutivement, principalement à la surface des monocytes, des macrophages et des neutrophiles [191]. La forme soluble du CD14, le sCD14 (soluble CD 14), est produite abondamment dans le sérum.

Ces deux formes de CD 14 sont issues d'une seule espèce d'ARNm traduite et traitée dans le réticulum endoplasmique où une ancre GPI peut être accrochée à la protéine nouvellement synthétisée. Lorsque l'ancre GPI est accrochée, le mCD14 passe dans l'appareil de Golgi afin d'être transporté jusqu'à la membrane cytoplasmique [192]. D'autre part, le sCD14 est généré constitutivement selon deux mécanismes distincts qui forment deux types de sCD14 (49kDa ou 55kDa) [193]. L'un des sCD14 est une protéine de 55kDa qui a échappé à l'ancrage GPI, la seconde forme de 49kDa est dérivée du clivage protéolytique du mCD14 par une sérine protéase [193;194].

La proportion de mCD14 versus sCD14 qui est produite dans une culture cellulaire dépend de la présence de huit acides aminés situés à l'extrémité C-terminale de la protéine. De fait, des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) transfectées avec le gène complet du CD 14 expriment fortement le

*Î4-mCD14 et sécrètent peu de sCD14 alors que la transfection du gène codant pour le CD 14 tronqué de huit acides aminés induit majoritairement la production de sCD14 [192],

Le CD 14 était connu comme un marqueur de différenciation des monocytes lorsqu'il fut décrit en 1990 par l'équipe de Wright pour son importance dans la réponse induite par le LPS, et cela bien avant la découverte du TLR4 (en 1998) [6; 156; 195]. Ce groupe montra effectivement que des anticorps bloquants anti-CD14 inhibent la production de TNF-a d'un échantillon de sang total stimulé avec du LPS [6j. Ce résultat fiit reproduit dans de nombreux systèmes in vitro utilisant notamment des monocytes et des neutrophiles (cellules CD 14^) [6; 196] ou encore des cellules endothéliales qui n'expriment pas le CD14 au niveau de leur membrane cytoplasmique (cellules CD14 ) [197;198]. Dans le cas des cellules endothéliales, c'est la déplétion du sCD14 se trouvant dans le milieu de culture qui permet de mettre en évidence le rôle du CD 14 ]197].

Les nombreuses études réalisées dans ce domaine démontrent donc que le blocage ou la déplétion du CD 14 (soluble et membranaire) modifie la sensibilité des cellules au LPS. En absence de CD 14, la concentration de LPS doit être augmentée de 100 à 10.000 fois pour induire une réponse [195].

Après la découverte du TLR4 en 1998, le groupe de Jiang suggère, pour la première fois, que le CD14 facilite le contact entre le LPS et le TLR4 [199]. Cette hypothèse fut confirmée : le CD14 augmente effectivement la réactivité de cellules au LPS en le liant et facilitant son transfert vers le complexe TLR4/MD-2 [200] et l'activation du facteur de transcription NF-kB par le TLR4 est augmentée avec l'addition de CD14 soluble [201]. Depuis lors, plus de 1400 publications documentent l'importance du CD14 dans les réponses induites par le LPS [165]. Toutefois, certaines observations soulèvent encore de nombreuses questions.

Le CD 14 est particulièrement nécessaire à l'activation de la voie de signalisation dépendante de TRIF en aval du TLR4 [202]. Sans CD 14, certains ligands activent le TLR4 en recrutant seulement MyD88 / Mal et non TRIF / TRAM, et les autres ligands n'activent aucunes des deux voies. En présence de CD14, ces mêmes ligands du TLR4 peuvent recruter MyD88 / Mal et TRIF / TRAM, activant donc les deux voies. En plus de cela, l'équipe d'Ogawa suggère que de faibles modifications dans la structure de ligands du TLR4 sont détectées par le sCD14, et non le mCD14, modifiant les réponses induites dans des cultures cellulaires [203]. D'autre part, d'anciennes publications décrivent que la P2-Intégrine est nécessaire à la liaison du LPS à la surface de la cellule [204] et qu'elle peut partiellement remplacer le CD 14 [205;206]. Toutefois, cette notion ne fait pas l'objet de recherches

récentes. En résumé, la tendance qui se dégage de tous ces travaux est que le CD 14 n'est pas qu'une protéine capable de transporter le LPS jusqu'à son récepteur, mais qu'il joue également un rôle dans la discrimination des ligands en modulant les réponses induites par TLR4.

En plus de son association au TLR4, le CD14 joue également un rôle dans la signalisation du TLR2, facilitant la reconnaissance de peptidoglycane et du LTA (lipoteichoic acid) [207-210]. Par exemple, l'élimination du CD14 par mutation inhibe de moitié la détection des ligands du dimère TLR2/6 [202;211]. Le CD14 recotmaît non seulement de nombreuses molécules bactériennes, mais il faciliterait également la détection de virus en les liant à la surface cellulaire [106;212;213]. De plus, le CD14 lie l'ARN double brin et interagit avec le TLR3 qui est situé dans l'endosome [214].

Enfin, à l'instar de la LBP, une forte concentration de sCD14 facilite la neutralisation et l'élimination du LPS par son transfert vers les HDLs [215]. Cet effet est favorisé par l'induction de la synthèse de sCD14 en réponse à la présence de LPS. Ce co-récepteur, le CD14 posséderait donc une fonction duale : d'abord une activité initiale stimulant l'inflammation ce qui augmente la résistance aux bactéries, ensuite une activité inhibitrice qui élimine le LPS présent dans le milieu [216].

L'importance du CD 14 a également été examinée in vivo grâce à la génération de souris déficientes [206;217]. En accord avec les observations in vitro, les souris CD14'^‘ répondent peu au LPS et sont (de 10 à 100 fois plus) résistantes à ses effets létaux [217]. Cependant, une forte concentration de LPS peut partiellement contourner le CD 14, et donc, induire une réponse partiellement indépendante de celui-ci [217;218]. L'absence de CD14 protège également l'animal d'une mort par choc septique induite par des bactéries Gram négatives [219]. Par contre, dans d'autres modèles infectieux, les souris CD14‘^‘ montrent, de manière surprenante, une réduction importante de leur bactériémie, ce qui suggère un rôle inattendu du CD 14 qui favoriserait la dissémination de certaines bactéries Gram négatives [220;221]. De nouvelles études semblent donc nécessaire pour mieux comprendre l'importance du CD 14 in vivo au cours d'une infection bactérienne. La fonction du CD 14 pourrait toutefois dépendre du type d'infection et de la voie d'entrée du pathogène.

Dans le but de comparer le CD 14 humain et murin, il a été montré que des souris transgéniques exprimant le CD 14 humain sont significativement plus sensible au LPS [222]. De plus, la région C-terminale du CD 14 nécessaire pour la signalisation TLR4 est différente entre l'homme et la souris [208;223]. Les réponses induites via le CD 14 seraient donc dépendantes de l'espèce.

Chez l'homme, un polymorphisme dans le gène du CD14 à la position -159 a été décrit pour la première fois en 1999 [224]. Le ch2mgement d'un nucléotide C en T à la position -159, située dans le

TLR4

TKENDS in Ulcwbiology

Figure 24 : Le TLR4 s'associe au MD-2 dans le réticulum endoplasmique à l'aide de la protéine chaperonne gp96, avant d'être exprimé à la membrane cellulaire. (Image

promoteur du gène est associé à une augmentation du taux de sCD14 ainsi qu'une augmentation du taux des IgE (Immunoglobulines E) totaux présents dans le sérum [224-226], Une hypothèse expliquant cet effet serait que le sCD14 présent en grande quantité dans l'organisme, limite les réponses de type Th-1, induites par certains pathogènes, ce qui favoriserait un profil de réponse Th-2 caractérisé notamment par la production des IgE [225], Par conséquent, le polymorphisme CD14/-159 serait associé au développement de l'asthme et des allergies [191],

Enfin, la PNH (Paroxysmal Noctumal Hemoglobinuria) est une maladie assez rare qui rend les personnes atteintes partiellement déficientes pour le CD 14. En fait, les patients développant la PNH présentent un défaut clonal dans un gène impliqué dans la biosynthèse des ancres GPI. Par conséquent, aucun mCD14 n'est exprimé à la membrane de leurs monocytes, mais leur sérum contient néanmoins du sCD14. La majorité de sCD14 dans ces patients est donc dérivée directement d'un pool intracellulaire et non du clivage du mCD14 [192], En effet, seul le sCD14 55kDa est détecté dans le sérum des patients PNH [193;227], Suite au défaut d'expression du mCD14, les monocytes de patients PNH ne produisent pas de cytokines en réponse au LPS [228-230], et la stimulation d'un échantillon de sang PNH par du LPS montre également une production de TNF-a réduite [231;232[. Deux groupes détectent cependant des médiateurs de l'inflammation produits en quantité faible mais non négligeable, ceux-ci seraient induits grâce à la présence de sCD14 dans le milieu [227;233[.

3.2.4. Le MD-2

La troisième protéine nécessaire à l'activation fonctionnelle du TLR4 par le LPS est le MD-2 (myeloid differentiation-2) [234], MD-2 est une glycoprotéine de 160 acides aminés contenant deux sites de glycosylation importants pour son association au TLR4 ]235;236[. Il peut également être sécrété sous forme soluble et s'associer alors en homodimères [164;237[.

La fonction du MD-2 dans l'activation du TLR4 (figure 23) fut d'abord suggérée par la mise en évidence d'une mutation ponctuelle (C59Y) dans ime région conservée, empêchant les cellules de répondre au LPS [238]. Au préalable, une variété d'expériences in vitro ont démontré que des cellules exprimant le TLR4 seul ne répondent pas à une stimulation par du LPS [234;235[. En effet, il fut établi que la transfection du gène ou l'addition de la protéine soluble du MD-2 restaure l'activation du TLR4 ]164;238-240[. De plus, des souris déficientes pour le MD-2 sont incapables de répondre au LPS, elles survivent donc mieux à un choc endotoxique induit par du LPS / galactosamine et sont plus susceptibles à une infection par la bactérie Gram négative Salmonella typhimurium [241].

Figure 25 ; Structure de deux domaines extracellulaires du TLR4 (en bleu et vert) interagissant avec deux MD-2 (en gris) et deux LPS (en rouge), obtenue par étude

cristallographique. (Image provenant de la référence n°248).

Figure 26 : MD-2 détermine la réponse induite par le lipide IVa. (Image provenant de la référence n°250).

Des ainalyses de cytométrie et des expériences de co-précipitations démontrent que le MD-2 s'associe directement au domaine extracellulaire du TLR4 [242;243]. Par conséquent, l'association de MD-2 avec le TLR4 est critique pour la reconnaissance du LPS et l'activation subséquente du récepteur. Parmi les trois co-récepteurs du TLR4 (LBP, CD 14 et MD-2) seul le MD-2 est indispensable à la détection de LPS, à l'instar du TLR4. En effet, des souris TLR4'^‘ et des souris MD-

T'' ne répondent absolument pas au LPS, contrairement à des souris CD14'^' ou LBP'^', avec lesquelles des réponses partielles peuvent être obtenues, dans certaines conditions de stimulation; telle qu'une forte concentration de LPS [241],

Ajoutons qu'en plus de la non réponse des cellules à des ligands TLR4, l'absence du MD-2 est aussi associée à une diminution de l'expression de ce TLR. En effet, le TLR4 s'accumule dans l'appareil de Golgi des fibroblastes MD-2 '^', alors que dans les cellules non-mutées, le TLR4 est exprimé à la surface cellulaire [241]. C'est dans le réticulum endoplasmique que le TLR4 et le MD-2 s'associent avec l'aide d'une protéine chaperonne gp96 (figure 24) [164]. De fait, dans des cellules gp96‘^‘, l'hétérodimère TLR4 / MD-2 ne se forme pas [244].

Il faut également savoir que le MD-2 partage certaines caractéristiques avec une famille de protéines liant des lipides extracellulaires [245]. On considère actuellement que MD-2 possède au moins deux propriétés nécessaires à la reconnaissances du LPS : un site de liaison cationique accessible et une cavité hydrophobe [246;247]. Récemment, un complexe TLR4 / MD-2 / LPS a pu être cristallisé [248] montrant que le LPS interagit majoritairement avec le MD-2 et non avec le TLR4 (figure 25).

Enfin, il existe des différences entre le MD-2 murin et humain. Par exemple, Kawasaki montre que le Taxol est recormu par le TLR4 / MD-2 murin, et non par le TLR4 / MD-2 humain [64;249]. Ce groupe associe cette différence de réponse au Taxol à une différence d'espèce au niveau du MD-2 (figure 26) [250]. Dans un second exemple, le lipide IVa, un précurseur du lipide A, est agoniste du TLR4 / MD-2 murin et antagoniste du TLR4 / MD-2 humain [251;252]. Plusieurs études montrent que MD-2 semble essentiel dans cette spécificité d'espèce [252;253]. Cependant, une équipe attribue ce rôle au TLR4 [254]. TLR4 et MD-2 pourraient donc, tous les deux, déterminer la spécificité de reconnaissance des ligands.

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Figure 27 : Structure chimique de la molécule de LPS majoritaire extraite de la bactérie

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