La diCu-amidine

Dans la première partie de nos résultats, nous avons montré l'implication du récepteur TLR4 dans l'activation de cellules myéloïdes par des liposomes de diCi4-amidine (Publication I). En effet, nous avons montré que des cellules (HEK, DCs) sont activées par ces liposomes cationiques lorsqu'elles expriment le TLR4, contrairement à des cellules qui n’expriment pas ce récepteur TLR (Publication I - Fig.l & Fig.3). De plus, cette activation semble spécifique du TLR4 puisque d'autres TLR (TLR2 et TLR3) ne peuvent remplacer le TLR4 (Publication I - Fig.3). Ces réponses cellulaires ont été mesurées par l'activation du facteur de transcription NF-kB, par la production de cytokines (dont IL-12p40, TNF-a, IFNP), ou par l'expression des molécules de costimulation (CD80 et CD86).

C'est donc la première fois que l'on démontre l'implication du récepteur TLR4 dans les réponses induites par un lipide cationique, à savoir la diCn-amidine (Ce résultat est le fruit d'une collaboration entre 3 laboratoires : Allergologie expérimentale, IMI et SFMB).

Contrairement à la diCu-amidine, plusieurs autres lipides cationiques, dont le DOTAP, ne semblent pas stimuler TLR4, puisque le facteur de transcription NF-kB qui est notamment associé à ce récepteur, n'est pas activé. En effet, Vangasseri n'obtient aucune activation significative de ce facteur de transcription pour tous les lipides cationiques qu'il a testé [302]. De plus, ces autres lipides cationiques n'induisent pas de production significative de TNF-a, une cytokine massivement produite lors d'une stimulation du TLR4 [302;324], Néanmoins, parmi ces lipides cationiques, certains dont le DOTAP ou la Lipofectamine, induisent une augmentation de l'expression des molécules de costimulation CD80 et CD86 [302]. Ces molécules sont surexprimées lors de la maturation des DCs et

70-impliquées dans la présentation de l'antigène. Leur surexpression traduit donc une activation des cellules.

Par la suite, le groupe de Vangasseri a démontré que la stimulation des cellules par le lipide cationique DOTAP induit l'activation de ERK, un membre des MAPKs et la production de MCP-1 / CCL2, une chimiokine attirant et activant plusieurs populations cellulaires dont les monocytes et les macrophages [303]. Donc, DOTAP a effectivement la capacité d'induire une activation cellulaire.

Sur base de ces observations, Vangasseri et ses collègues postulent l'existence d'un récepteur capable de détecter les lipides cationiques. L'activation de ce récepteur hypothétique augmenterait l'expression des molécules de costimulation et activerait les MAPKs par une voie différente de la signalisation MyD88 / NF-kB, au vu de l'absence de production de cytokines inflammatoires [302].

A ce jour, la diCi4-amidine reste donc le seul lipide cationique synthétique, décrit dans la littérature, capable d'activer la voie de signalisation TLR4 / MyD88 /NF-kB.

D'autre part, soulignons que Zuhom a démontré l'interaction entre un lipide cationique et la pi-intégrine [304]. Ce récepteur serait impliqué dans le mécanisme de la transfection par des lipides cationiques tels que la Lipofectamine. Alors que cette étude ne s'intéresse pas aux propriétés immunostimulantes des lipides cationiques, d'autres équipes, dans d'autres contextes, suggèrent un lien entre l'activation du récepteur pi-intégrine et la voie des MAPKs [330;331[. Rappelons que ERK qui appartient à la famille des MAPKs est activé par le lipide cationique DOTAP. De plus, une autre intégrine, la p2-intégrine (CD 18 ou mac-1) a été associée à l'activation du TLR4 [205;206[. Donc, globalement, les intégrines pourraient Jouer un rôle dans la reconnaissance des lipides cationiques et leur étude pourrait améliorer la compréhension des mécanismes d'activation. L'étude de l'implication de la p2-intégrine dans l'activation du TLR4 par la diCu-amidine n'a pas encore été réalisée jusqu'à présent, et cette voie serait probablement intéressante à explorer.

La diCi4-amidine étant un nouveau type d'agoniste du TLR4, nous avons montré qu'elle était capable d'activer, comme d'autres ligands, aussi bien la voie MyD88 dépendante que la voie TRIE dépendante (Publication I - Fig.l). À l'instar du MPL ou du LPS, elle possède des chaînes acylées qui pourraient interagir avec le site actif du récepteur. Cependant, la région polaire du lipide cationique est différente de celle du MPL ou du LPS. De plus, la charge portée par cette région est différente (positive pour la diC|4-amidine et négative pour le MPL ou le LPS). Ces charges négatives portées par les groupements phosphates des molécules de type MPL sont décrites comme importantes pour l'activation du récepteur. Toutefois, cela ne signifie pas nécessairement qu'elles doivent être portées

par tous les ligands du TLR4. En effet, le TLR4 est activé par de nombreux ligands dont les structures et les charges portées sont différentes. Comme le montre la figure IX, le taxol présente peu de points communs avec le MPL ou la diCn-amidine bien qu'il interagisse avec le même récepteur que ces derniers (figure IX), ce qui soulève la question de la spécificité des agonistes TLR4. Donc, à l'exception de la longueur des chaînes acylées présentes dans une série de ligands TLR4 de type MPL, la relation structure / activité reste encore incomprise.

diQ4-aniidme

MPL

Figure IX : Structure des ligands du TLR4 : diCi4-amidine, taxol, et MPL

Les données cristallographiques sur l'interaction de ces différents ligands avec le complexe TLR4 / MD-2 permettraient peut-être de mieux cerner les caractéristiques essentielles des agonistes de ce récepteur. Des cristaux ont été obtenus pour les complexes MD-2 / Eritoran [332], MD-2 / lipide Via [247], et TLR4 / MD-2 / LPS [248] ; les deux premiers étant des antagonistes et le dernier un agoniste. Ces travaux montrent que les chaînes acylées des ligands s'insèrent dans le site actif du récepteur. Ce site actif serait composé majoritairement de la poche hydrophobe du MD-2. En effet, le cristal TLR4 / MD-2 / LPS montre cinq chaînes du LPS se logeant dans la poche du MD-2, la sixième chaîne du LPS est en contact à la fois avec TLR4 et MD-2 [248]. Par conséquent, MD-2 jouerait un rôle crucial dans la liaison des ligands. De fait, d'autres équipes démontrent que MD-2 est le co­ récepteur qui détermine la spécificité d'espèce dans les réponses induites par des molécules comme le lipide IVa [251;252[.

72-Sur base de la structure révélée par le cristal MD-2 / lipide IVa, Mark Lensink du laboratoire SFMB (groupe de Jean-Marie Ruysschaert et Michel Vandenbranden), a modélisé les interactions qui pourraient se produire si la diCn-amidine s'insérait dans le site hydrophobe du MD-2. Dans ce modèle, deux molécules de diCi4-amidine sont insérées dans la poche du MD-2, à la place des quatre chaînes acylées du lipide IVa. Ensuite, la structure est équilibrée afin de minimiser les énergies d'interaction, montrant que la diCi4-amidine n'est pas expulsée de ce site hydrophobe. Par conséquent, il semblerait que les interactions entre la diCn-amidine et MD-2 soient favorables (communication personnelle de Michel Vandenbranden).

Ce travail se poursuit actuellement en utilisant les structures du complexe TLR4 / MD-2 cristallisé par l'équipe de Park [248]. Comme mentionné plus haut, ce dernier cristal montre l'insertion de six chaînes acylées dans le site actif du récepteur. De ce fait, il serait intéressant d'analyser le nombre de molécules de diCn-amidine (deux ou trois) qui peuvent entrer dans la poche hydrophobe du récepteur et d'étudier la stabilité de la structure en fonction de l'insertion de ces deux ou trois molécules. Cette perspective permettrait probablement de mieux comprendre la manière dont ce lipide cationique active le TLR4.

Bien que cette analyse théorique suggère l'interaction de la diCn-amidine avec le site actif du récepteur TLR4 / MD-2, nous ne pouvons exclure qu'elle se localise plutôt au niveau de la membrane cytoplasmique. En effet, plusieurs publications décrivent l'activation du TLR4 par l'éthanol. L'éthanol modifierait l'environnement lipidique de la membrane plasmique, et induirait par ce biais, l'activation du TLR4 [333]. Ce mécanisme pourrait également être envisagé lors de la stimulation par les liposomes de diCu-amidine, sachant que ces derniers ont la capacité de fusionner (la fusion étant le mélange des phases lipidiques) avec la plupart des bicouches lipidiques (liposomes ou membranes cellulaires). Les molécules de diCn-amidine pourraient donc se localiser dans l'enviroimement lipidique du TLR4, et modifier ainsi les propriétés de la membrane, à l'instar de l'éthanol, avec pour conséquence ultime l'activation du récepteur.

L'étude d'un autre lipide cationique proche de la diCu-amidine, nous permettrait, par comparaison de leurs effets, de mieux comprendre le mécanisme d'activation de TLR4. Ce second lipide cationique est la diCi6-amidine. Sa structure est semblable à la diCu-amidine, à l'exception des chaînes acylées qui contiennent 16 (et non plus 14) carbones. À l'instar de la diCn-amidine, la diCi6- amidine s'organise sous forme de liposomes en milieu aqueux. Elle possède également la propriété de fusionner avec la plupart des bicouches lipidiques. Cependant, les liposomes de diCi6-amidine n’activent pas le récepteur TLR4 comme le suggère l'absence de production du TNF-a par des cellules

RAW 264.7 (lignée cellulaire de macrophages murins) (communication personnelle de Michel Vandenbranden). Par conséquent, l'activation du TLR4 par la diCu-amidine de la membrane est donc un mécanisme moins vraisemblable.

Bien qu'aucune activation cellulaire n'a pu être observée, jusqu'à ce jour, lors de l'incubation de cellules en présence de liposomes de diCie-amidine, nous ne pouvons exclure que des molécules de diC|6-amidine ne puissent s'insérer dans le site actif du récepteur TLR4 / MD-2, sans toutefois, induire un signal. Par exemple, il semblerait que des ligands agonistes faibles possèdent également la fonction d'antagoniste vis-à-vis de ligands plus puissants [269]. Par conséquent, une perspective intéressante serait de tester le pouvoir antagoniste de ces deux amidines. En effet, si ces lipides cationiques (diC^- amidine et/ou diCie-amidine) peuvent inhiber les réponses induites par LPS, nous pourrions supposer qu'ils peuvent interagir avec la même région du récepteur que le LPS. Donc, de telles expériences nous permettraient peut-être de discriminer la localisation de la diCu-amidine lorsqu'elle active TLR4.

L'ensemble des observations discutées ci-dessus est basé sur des expériences in vitro,

cependant, toute une série de manipulations utilisant les liposomes de diCn-amidine ont également été menées in vivo.

Comme mentiormé dans la section introduction, chez la souris, la diCu-amidine induit des anticorps spécifiques de l'antigène (proDer pl) co-administré [323]. De plus, nous avons montré que l'immunisation de souris par un complexe diCn-amidine / OVA induit une faible réponse cellulaire spécifique de l'antigène (fîgure II). Pour cela, nous avons quantifié le taux de cytokines produites par des splénocytes, isolés des souris immunisées, puis stimulés par l'antigène. Dans ces expériences, il semblerait que la quantité de diCn-amidine utilisée lors de la formation du complexe avec l'OVA pourrait favoriser la présentation des antigènes associés au MHC I (5pg de diCu-amidine pour 5pg d'OVA) ou au MHC II (20|ig de diCu-amidine pour 5pg d'OVA) (figure II). Sachant que MHC I est associé à la présentation d'antigènes aux lymphocytes T CD8^ et MHC II aux lymphocytes T CD4^, nous pourrions supposer que la formulation de l'antigène dans ces liposomes pourrait favoriser l'une ou l'autre de ces réponses. Une explication possible serait qu'en fonction de la quantité de diCn- amidine utilisée, l'antigène est ségrégé dans l'endosome ou libéré dans le cytoplasme de l'APC. Ces localisations des antigènes sont supposées favoriser, respectivement, la présentation par le MHC II ou le MHC I [334;335]. Des expériences supplémentaires sont nécessaires pour conclure sur ce point qui met en évidence un avantage non négligeable de l'utilisation de ce lipide cationique dans des approches vaccinales.

-74-Quant au pouvoir immunostimulant relativement modéré de la diC14-amidine, il pourrait dans certains cas s'avérer utile. La quantification de cytokines dans le sérum de souris 3 heures après l'injection de liposomes de diCn-amidine suggère que ces derniers sont peu pyrogéniques (figure III). Cette propriété est recherchée pour le développement de nouveaux vaccins et plus particulièrement lorsqu'ils sont destinés aux enfants.

Le pouvoir immunostimulant de la diCu-amidine pourrait être augmenté, lorsque nécessaire, par l'insertion d'un second immunostimulant dans les liposomes, tel qu'un autre ligand des TLRs. Dans ce cas, la diCu-amidine servirait à la fois de support pour la formulation et d'immunostimulateur TLR4-spécifique. En effet, les liposomes de diCn-amidine peuvent former des complexes avec de nombreuses molécules, à savoir des acides nucléiques, des molécules lipidiques, et certaines protéines. De plus, ce type de formulation contenant l'adjuvant et l'antigène est de plus en plus considérée comme un élément crucial pour le développement de nouveaux vaccins.

À riMI (Institut Médical d'immunologie), des essais utilisant un complexe diCu-amidine / Alum sont réalisés par Stéphane Temmerman en collaboration avec le SFMB (communication personnelle de Stéphane Temmerman). Rappelons que des particules d'Alum constituent l'adjuvant principal utilisé dans des vaccins destinés à l'homme. Bien que cet adjuvant soit abondamment utilisé, son mode d'action reste mal caractérisé. Récemment, le groupe de Kool a démontré que l'Alum active un complexe intracytoplasmique : l'Inflammasome Nalp3 [336]. Ce type de récepteur qui appartient à la famille des NLRs est connu pour activer la caspase-1 qui mature la proIL-ip en IL-ip. Cependant, un premier signal en provenance par exemple d'un TLR est nécessaire à la synthèse du précurseur proIL-ip. C'est pourquoi un inducteur du précurseur comme LPS doit être ajouté lors d'une stimulation de cellules par l'Alum afin d'induire une sécrétion d'IL-ip. Par conséquent, Stéphane Temmerman a remplacé LPS par la diCn-amidine. Il a démontré qu'une stimulation par diCu-amidine / Alum induit la production d'IL-ip, mais en plus, que cette production est augmentée par la formation d'un complexe entre ces deux composés (synergie lorsqu'il y a association de la diCn-amidine avec l'Alum), contrairement au LPS avec l'Alum. Enfin, l'immunisation de souris par cette formulation à laquelle est ajouté l'antigène OVA (diCn-amidine / Alum / OVA) induit la production d'IgGl spécifiques de l'antigène. Comparé aux souris immunisées par de l'Alum / OVA, la formulation diC^- amidine / Alum / OVA induit des taux plus importants d'anticorps. Ce travail suggère de nombreuses perspectives au niveau du mode d'action de cette formulation qui augmente fortement les effets de l'Alum (communication personnelle de Stéphane Temmerman).

En conclusion, la diCu-amidine reste une molécule tout à fait particulière qui combine des effets immunologiques avec des propriétés physico-chimiques intéressantes. En effet, cette molécule est la seule décrite jusqu'à ce Jour dans la littérature qui active le TLR4, forme des liposomes, possède la capacité de fusionner très rapidement avec la membrane cellulaire, ainsi que de s'associer à de nombreuses molécules. Ces propriétés pourraient, par exemple, être utilisées dans des formulation d'adjuvants où l'on doit absolument cibler les APCs (TLR4^), les activer et faire rentrer rapidement l'antigène dans la cellule pour permettre sa présentation.

2/ Le CRX-527

Le CRX-527 est une molécule synthétique, appartenant à la famille des AGPs. Ces composés miment la structure générale du MPL. Comme sa molécule parente, le CRX-527 active le récepteur TLR4. Parmi la centaine d'AGP synthétisés, le CRX-527 est apparu comme l'un des plus puissants lors d'études reliant la structure et l'activité [281]. Ces AGPs, possèdent l'avantage d'être synthétiques, et pourraient être utilisés comme adjuvant de vaccin ou immunostimulant isolé [269].

Dans la seconde partie de notre section résultats, nous avons montré que le CRX-527 peut induire l'activation de facteurs de transcription et la production de taux importants de cytokines, et cela en absence totale de CD14 (Publication II). Ce résultat est plutôt surprenant car les ligands du TLR4, tels que LPS, MPL ou diCn-amidine, ont généralement besoin du CD14 (membranaire ou soluble) pour activer le récepteur.

Toutefois, nous devons nuancer cette observation. Premièrement, aux fortes doses, ces agonistes peuvent induire des réponses partiellement indépendantes du CD 14. Mais, l'ajout de la protéine recombinante sCD14 (la forme soluble) augmente toujours les réponses induites [328]. Ce résultat confirme que ce co-récepteur reste important même pour les fortes doses. Deuxièmement, du rLPS (rough LPS ; sous-type de LPS contenant une chaîne polysaccharidique particulièrement courte) injecté à des souris CD14'^‘ induit la production de cytokines décrites comme MyD88 dépendantes dans le sérum de ces souris; la production des cytokines associées à la voie TRIE / IRF3 est quant à elle abolie [202]. En conclusion, aucun de ces ligands, sauf à forte concentration, n'est capable d'activer, en complète absence de CD14, les voies de signalisation TRIE / IRE3 et MyD88 /NE-kB.

-76-La dépendance du récepteur TLR4 pour la molécule CD 14 dans l'induction des réponses lors d'une stimulation par CRX-527 est donc différente des autres agonistes de ce récepteur, comme nous l'avons démontré.

Le CRX-527 possède des chaînes acylées longues de 10 et 14 carbones. D'après les études reliant la structure et la fonction des LPS, MPL et AGPs, la longueur des chaînes du CRX-527 est plutôt favorable à une bonne activation du récepteur. De ce fait, nous avons envisagé que les doses utilisées de CRX-527 pourraient être trop importantes pour observer la dépendance du CD14. C'est pourquoi nous avons stimulé des Mo-DCs avec une dose de CRX-527 mille fois inférieure. Néanmoins, cette plus faible dose d'agoniste induit toujours des taux importants de cytokines

(Publication II - Fig. 2A), suggérant que le CD 14 n'est pas indispensable, même à faible dose, pour le CRX-527.

Afin de mieux caractériser l'implication du CD 14 dans les réponses induites par le CRX-527, nous avons ajouté du CD14 soit par la transfection d'un plasmide codant pour le mCD14, soit par l'addition de sCD14 recombinant dans la culture cellulaire (Publication II - Fig. IB-D, Fig. 2B & Fig. 3C ; figure VIII). Ces expériences montrent que dans la majorité des cas, l'addition de CD 14 ne modifie pas le niveau des réponses induites par CRX-527, comparé à la situation sans CD 14.

De fait, l'addition de sCD14 à des cellules CD 14' (HEK, Mo-DC et splénocytes CD 14'^ ) ne modifie pas le taux d'activation de molécules associées au facteur de transcription NF-kB (Publication II - Fig. IC-D, Fig.2B & Fig. 3C). De même, toujours en réponse au CRX-527, l'addition de mCD14 par transfection ne change pas le niveau d'activation des molécules dépendantes d'IRF3 (Publication II - Fig. ID). Par contre, certaines réponses sont malgré tout augmentées par un ajout de CD14. En effet, chacune des formes de CD 14 amplifie, respectivement, l'activation d'IRF3 / IFNp pour le sCD14

(Publication II - Fig.lC-D & Fig. 2B), et le facteur de transcription NF-kB pour le mCD14

(Publication II - Fig.lD).

Par conséquent, ces résultats suggèrent un lien particulier entre la voie de signalisation TRIF / IRF3 et le sCD14, et également entre le mCD14 et la voie de signalisation MyD88 / NF-kB.

Concernant les effets discriminatifs du CD14 décrits dans la littérature, retenons l'article écrit par Jiang qui démontre que le CD14 est particulièrement indispensable pour activer la voie de signalisation TRIF dépendante, en réponse au LPS [202]. Ce point renforce l'idée que le CRX-527 interagit différemment du LPS avec le co-récepteur CD 14 associé au TLR4. En effet, même en absence de CD 14, nous avons observé que le CRX-527 induit des réponses TRIF dépendantes.

contrairement au LPS [202]. Il faut souligner que dans leur étude, l'équipe de Jiang utilise des souris déficientes pour CD 14 et ne distingue pas les effets d'une forme de CD 14 (mCD14) par rapport à l'autre (sCD14). Ils comparent uniquement des situations avec CD14 (mCD14 & sCD14) et sans CD14.

Par contre, un autre groupe, celui de Asai étudie le rôle des deux formes de CD14 (mCD14 versus sCD14) dans les réponses induites par des agonistes du TLR4. Il attribue au sCD14, et non au mCD14, la capacité de déceler de petites différences de structure dans les ligands [203]. Il montre qu'en présence de mCD14, deux agonistes TLR4 induisent des réponses similaires, alors qu'en présence de sCD14, ceux-ci provoquent une activation cellulaire distincte. Dans notre cas, le sCD14 peut également moduler les réponses induites par le CRX-527, mais préférentiellement celles associées à la voie TRIF / IRF3.

En conclusion, le CD 14 (membranaire et/ou soluble) ne serait donc pas qu'un simple transporteur de ligands, comme il l'a été décrit par le passé, mais bien une protéine impliquée dans la