Les lipides cationicjues
5.3. La diCi 4 -amidine
Enfin, nous terminons cette introduction par la description de la diCu-amidine (N-t-butyl-N’- tétradécyl-3-tétradécylamino-propionamidine) (figure 34), un lipide cationique développé dans notre
-37-C(CH3)3
Figure 34 : Structure chimique de la molécule diCu-amidine. (Image provenant de la référence n°319)
laboratoire en collaboration avec une équipe de chimistes organiciens [317]. Les propriétés physico chimiques de ce lipide cationique ainsi que les complexes qu'il forme avec le matériel génétique ont été caractérisés [317-319] démontrant que la diCu-amidine forme des liposomes stables sans l'ajout d'un co-lipide. Ses propriétés de transfection ont été mises en évidence aussi bien in vitro que in vivo
[320] .
Toutefois, lors de sa caractérisation en tant qu'agent de transfection, une propriété intéressante a été observée : le prétraitement de souris par des liposomes contenant uniquement de la diCu- amidine, une heure avant l’injection de complexes de transfection, permet d’inhiber partiellement l’inflammation induite par les complexes et d’augmenter considérablement le niveau d’expression du transgène [320]. L’activité anti-inflammatoire de ces liposomes cationiques a été reproduite in vitro
[321] , démontrant que l’interaction des liposomes cationiques de diCu-amidine avec le sérum est indispensable afin d’inhiber la sécrétion de TNF-a induite par des séquences CpG. C'est en réalité la combinaison d'un phospholipide sérique avec les liposomes de diCu-amidine qui permet d'inhiber cette cytokine inflammatoire [322].
À l'opposé. Jacquet et ses collaborateurs ont étudié les réponses induites par une protéine recombinante, dérivée de l'un des allergène majeur de l'acarien (proDer pl), formulé avec des liposomes de diCi4-amidine [323]. Ils ont montré que des souris immunisées avec un complexe diCu- amidine / proDer pl sont moins susceptibles au développement d'une réponse allergique, lorsqu'elles sont ensuite exposées à des extraits d'acariens, comparé à des souris traitées par du tampon. L'immunisation des souris par le complexe diCn-amidine / proDer pl induit une réponse humorale avec la production d'IgG, et quasiment pas d'IgE spécifiques de l'antigène. Des splénocytes isolés de souris immunisées par le complexe diCn-amidine / proDer pl produisent de l'IFNy lors d'une stimulation par l'antigène. En conclusion, l'immunisation de souris avec des liposomes de diC^- amidine en tant qu'adjuvant induirait donc un profil de réponse de type Thl.
Cette propriété stimulatrice de la diCu-amidine a été également observée sur des cellules dendritiques murines dérivées de la moelle osseuse (BM-DCs ; Bone Marrow Dendritic Cells) de souris naïves [324]. De fait, en absence de sérum, la diCu-amidine active le facteur de transcription NF-kB et induit la production de l’IL-12p40 et du TNF-a, alors que d'autres lipides cationiques comme DOTAP et DDA ne le font pas [324]. Ce résultat suggère que la diCn-amidine pourrait exercer son effet stimulateur via le système des récepteurs TLRs.
-38-Cette propriété des liposomes cationiques de diCn-amidine est étudiée dans la première partie de cette thèse.
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5UT DU T RAVAI L
Le but général de ce travail de thèse est de contribuer à la compréhension du mode d'action de molécules synthétiques présentant des propriétés adjuvantes. Une meilleure caractérisation du mécanisme d'activation du récepteur ciblé par ces adjuvants permettrait en effet d'optimiser les réponses induites, et même de les orienter vers la production d'un profil de cytokines mieux adapté à l'application choisie.
Grâce à l'identification des récepteurs de type PRR (pattern récognition receptor), un effort général a été fourni afin de caractériser de nouveaux ligands induisant une réponse immune protectrice efficace. Au cours de notre thèse nous avons pu disposer successivement de deux molécules synthétiques, dont nous avons analysé les propriétés et le mode d'action au niveau des PRRs.
La première molécule est un lipide cationique, la diCu-amidine. Il avait été montré que cette molécule activait des cellules dendritiques ou des macrophages en culture à produire des cytokines telles que le TNF-a et l'IL-12p40, sans toutefois en connaître le mécanisme sous-jacent. De plus, l'activation du facteur de transcription NF-kB et des cascades de signalisation MAPKs suggérait l'implication des PRRs de la famille des TLRs (Toll-like Receptors). Nous avons donc cherché à identifier le TLR pouvant être impliqué. Et de fait, nous avons montré que le TLR4 est nécessaire à la propriété stimulatrice de la diCu-amidine induisant l'activation et la maturation de cellules dendritiques en culture. Ces cellules dendritiques sont, rappelons-le, associées à l'induction des réponses innées, mais aussi des réponses adaptatives spécifiques d’un antigène. Nous avons donc voulu tester le pouvoir adjuvant de la diCu-amidine in vivo en la formulant avec de l'ovalbumine (OVA) à titre d'antigène. Nous avons notamment montré qu'un complexe diCn-amidine / OVA induit la production spécifique dTNFy par des splénocytes isolés de souris immunisées.
La seconde partie de ce travail porte sur un second adjuvant potentiel, agoniste du TLR4, le CRX-527. Cette molécule synthétique est dérivée du LPS, l'agoniste "naturel" du TLR4 [9]. Nous avons voulu caractériser l'implication du CD 14, un co-récepteur du TLR4 dont le rôle n'est pas encore clairement établi, dans les réponses induites par le CRX-527. Nous avons ainsi observé que la nécessité du CD 14 dans ces réponses était nettement moindre que dans le cas du LPS. De manière plus approfondie, nous avons mis en évidence un rôle discriminatif de la molécule CD 14, suivant sa forme.
-40-membranaire ou soluble, sur le choix de l’induction des 2 cascades de signalisation en aval du TLR4 aboutissant à l’activation du facteur NF-kB d’une part, et d'IRFS d’autre part.