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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Thonnart, N. (1978). Contribution à l'étude de la biotransformation et de la pharmacologie des anticoagulants dérivés de l'hydroxy-4-coumarine (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/214177/3/d5b3b4f6-361b-4b52-a3bf-bafa6b10d22f.txt
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UNIVERSITE LI&RE DE BRUXELLES
FACULTE DE MEDECINE
LABORATOIRE DE PHARMACODYNAMIE ET DE THERAPEUTIQUE (Dir. Prof. J. REUSE)
CONTRIBUTION A L’ETUDE
DE LA BIOTRANSFORI-5ATION ET DE LA PHARMACOLOGIE DES ANTICOAGULANTS
DERIVES DE L'.HyDROXy-4-COUMARINE j
.
1
I
Nadine THONNART
Thèse présentée en vue de l'ohtention du grade de
Docteur en Sciences zoologiques.
TABLE DES MATIERES
Pages
Chapitre 1 ; INTRODUCTION GENERALE. 1
1.1 Importance de l'étude du métabolisme. 2
1.2 Voies de métabolisation.
4
1.2.1 Réactions de la phase I.
5
1.2.2 Réactions de la phase II. ^
1.3 Mécanismes des processus d'oxydation dans les microsomes
hépatiques.
13
1.4 Composants du système microsomial d'oxydation des
médicaments. 17
1.5 Facteurs influençant le métabolisme. 20
1.6 Les antivitamines K. 22
1.6.1 Hémostase et coagulation. "
1.6.2 Chimie des antivitamines K. 25 1.6.3 Propriétés pharmacologiques des antivitamines K. 27 1.6.4 Structure et action de la vitamine K. 30 1.6.5 Mécanismes d'action de la vitamine K et des
antivitamines K. 33
1.6.6 Métabolisme des antivitamines K. 38
Chapitre 2 : BUT DU TRAVAIL.
47 31S22
41
Chapitre 3 : ETUDE DU METABOLISME "IN VITRO" DE QUELQUES 44
DERIVES COUMARINIQUES.3.1 INTRODUCTION. 45
3.2 MATERIEL. 47
3.2.1 Espèces animales. „
3.2.2 Anticoagulants étudiés. "
3.3 METHODES EXPERIMENTALES.
ff
3.3.1 Préparation des tissus.
3.3.2 Dosage des protéines microsomiales. 50 3.3.3 Milieu d'incubation standard. 51
3.3.4 Processus d'extraction. "
3.3.5 Processus d'isolement par chromatographie sur 52 couche mince.
3.4 METHODES ANALYTIQUES. 53
3.4.1 Appareils. "
3.4.2 Chromatographie liquide haute performance. "
3.4.3 Chromatographie sur couche mince haute performance. "
3.4.4 Chromatographie en phase gazeuse.
3.5 ASPECT QUALITATIF DU METABOLISME DU CLOCOUMAROL. 55 3.5.1 Métabolisme "in vitro" par les microsomes hépatiques."
3.5.2 Etudes réalisées sur foie de rat.
3.5.3 Méthode de préparation du métabolite m^. 58 3.5.4 Détermination de la structure du métabolite m^. 59 3.5.5 Discussion et conclusions.
3.6 ASPECT QUANTITATIF DU METABOLISME DU CLOCOUMAROL. 74 3.6.1 Méthode : chromatographie liquide sous haute pression.' 3.6.2 Résultats.
3.6.3 Effet de la durée de l'incubation sur la formation
du métabolite m^^. -
7
g3.6.4 Effet de la variation de la concentration en pro
téines microsomiales.
3.6.5 Effet de la concentration en substrat. 79
3.6.6 Discussion et conclusions. 83
3.7 ASPECT QUALITATIF DU METABOLISME DU PHENPROCOUMON. 84 3.7.1 Métabolisme "in vitro" par les microsomes de
foie de rat.
3.7.2 Méthode de préparation du métabolite m^.
3.7.3 Détermination de la structure du métabolite m^. 85 3.7.4 Chromatographie sur couche mince haute performance. 90 3.7.5 Chromatographie liquide haute performance. 91 3.7.6 Chromatographie en phase gazeuse.
3.8 ASPECT QUALITATIF DU METABOLISME DE LA WARFARINE. 94 3.8.1 Métabolisme "in vitro" par les microsomes de foie
de rat.
3.8.2 Résultats. "
3.9 Discussion et conclusions du chapitre: METABOLISME "IN VITRO"
DE QUELQUES DERIVES COUMARINIQUES.
99
Chapitre 4 : METABOLISME "IN VIVO" DE QUELQUES DERIVES 106
COUMARINIQUES.4.1 INTRODUCTION. 107
4.2 METHODE.
4.2.1 Animaux et échantillons d'urine.
4.2.2 Appareillage.
4.2.3 Colonne de Tenax GC
4.2.4 Conditions expérimentales.
108
109 110 111
4.3 RESULTATS.
4.3.1 Courbes de référence en chromatographie liquide haute performance.
4.3.2 Améliorations dues au Tenax GC . 4.3.3 Métabolisme "in vivo" du cloco\imarol.
4.3.4 Métabolisme "in vivo" du phenprocoumon.
4.3.5 Métabolisme "in vivo" de la warfarine.
4.4 Discussion et conclusions du chapitre : METABOLISME "IN VIVO"
DE QUELQUES DERIVES COUMARINIQUES.
Chapitre 5 : PHARMACOLOGIE DU CLOCOUMAROL. 113
5.1 INTRODUCTION. 114
5.2 TOXICITE AIGUE. 115
5.3 ACTIVITE ANTICOAGULANTE. 119
5.3.1 Choix d'un test biologique. II
5.3.2 Courbe d'étalonnage. 120
5.3.3 Comparaison de l'activité anticoagulante du clocouraarol et du phenprocoumon chez deux espè
ces animales. 125
5.3.4 Effet de la vitamine synthétique. 129 5.3.5 Cinétique de l'effet anticoagulant du clocoumarol
et de la warfarine chez le rat. 131
5.4 LIAISON DU CLOCOUMAROL A L'ALBUMINE BOVINE. 136
5.4.1 Introduction. II
5.4.2 Méthodes.
138
5.4.3 Résultats. 140
5.4.4 Discussion et conclusions. 148
Chapitre 6 : CONCLUSIONS GENERALES ET DISCUSSION.
150
BIBLIOGRAPHIE 162
Chapitre 1
INTRODUCTION GENERALE
2
1.1 IMPORTANCE DE L'ETUDE DU METABOLISME.
Aujourd'hui, nous vivons dans une société qui est fortement sensibilisée aux dangers présentés par les médicaments, les polluants, les additifs alimentaires, l'alcool et les agents cancérigènes.
Un des buts de la recherche biomédicale est de mieux compren
dre le devenir des médicaments et agents chimiques introduits dans l'organisme ainsi que les conséquences de leur métabolisa- tion.
C'est en 1947 qu'apparaît la première publication concernant le métabolisme des médicaments (R.T. Williams), qui a marqué le commencement des études sur la biotransformation et leur dé
veloppement en une discipline importante de la pharmacologie.
Depuis lors, la littérature sur le métabolisme des médicaments s'est fortement développée.
Actuellement, les informations concernant le métabolisme d'une nouvelle substance sont exigées pour donner plus ou moins de poids aux études de toxicologie chronique réalisées chez une espèce animale déterminée, et pour son utilisation en thérapeu
tique.
La connaissance des facteurs influençant l'absorption, la distri
bution et le métabolisme des médicaments peut, par ailleurs, être utilisée dans le but de synthétiser une substance ayant des propriétés pharmacologiques et toxicologiques déterminées.
De même, grâce à la connaissance du métabolisme, il est possible d'administrer une substance qui sera transformée par les enzymes en une forme pharmacologiquement active.
Au cours de l'étude du métabolisme d'un médicament, un certain nombre de points doivent être pris en considération.
Un des plus importants est que l'état physiologique peut influ
encer l'activité des enzymes de métabolisation, et qu'un mauvais fonctionnement de ces méchanismes peut affecter la distribution, le métabolisme et l'excrétion du médicament prescrit.
Le métabolisme d'un médicament est également influencé par la voie selon laquelle il est administré.
Outre les phénomènes d'absorption qui interviennent lors d'une administration orale, il y a des grandes différences entre les voies d'administration parentérale quant à la vitesse d'absorption et la distribution du médicament (appa
rition plus ou moins rapide dans la circulation systémique).
De plus, certaines études récentes ont montré que la forme sous laquelle un médicament est conditionné influence sa dis
tribution dans l'organisme, et de ce fait peut affecter son métabolisme.
L'étude du métabolisme des médicaments acquiert toute son importance en thérapeutique où l'administration concomitante de plusieurs médicaments est très courante.
L'observation de cas cliniques a mis en évidence des
phénomènes d'induction enzymatique, c'est-à-dire que l'acti
vité pharmacologique d'un médicament peut être diminuée par stimulation de son métabolisme par un autre médicament.
Par contre, dans certains cas, l'association de certains médicaments peut provoquer des effets indésirables toxiques suite à l'inhibition du métabolisme d'un des médicaments.
4
La plupart des médicaments sont métabolisés dans le foie.
Les réactions subies par les médicaments peuvent être classées en oxydations, réductions, hydrolyses et conjugaisons. Vu la nature de ces réactions, et l'activité biologique des substan
ces, il est commode d'envisager le métabolisme des médicaments comme ayant lieu en deux phases (Williams, 1959). Les oxyda
tions, réductions et hydrolyses ont lieu dans la première pha
se et résultent en
1
. une inactivation d'un médicament,2
. la transformation d'un composé initialement inactif en une substance active,3. la conversion d'une substance active en une autre substan
ce active.
La seconde phase du métabolisme consiste en des réactions de synthèse transformant des composés actifs en des produits inac
tifs qui sont excrétés.
1.2. VOIES DE METABOLISATION.
Le concept du métabolisme peut être représenté comme suit :
Phase I Phase II
Médicament ---s- activation
ou
inactivation
oxydation réduction hydrolyse
---^
inactivation
produits de
conjugaison
Les réactions de la phase I conduisent généralement à l'intro
duction sur la molécule de départ, de groupements tels que-OH, -COOH et-NH
2
ce qui peinmet aux produits de la phase I de subirdes conjugaisons. Si la substance contient déjà certaines de ces fonctionsf(par e».un phénol), elle peut subir directement une conjugaison, sans passer par les réactions de la phase I, comme c'est le cas de l'éthanol qui est oxydé principalement en CO
2
. Les médicaments sont métabolisés dans le corps humain selon des voies qui mènent à la formation de composés plus hydro-solubles et plus polaires qui. soiit rapidement excrétés.
1 . 2 . 1 .
Réactions de la phase I. (Biotransformations)Les enzymes responsables des biotransformations peuvent se trouver dans les fractions mitochondriale, microsomiale ou soluble du foie et dans une moindre mesure, le poumon, les sur
rénales et le sang. La plupart de ces réactions sont dues à des enzymes localisés dans le réticulum endoplasmique des cel
lules hépatiques (voir chapitre 3.1 )(Brodie et al., 1955;
Gillette, 1963).
a) Oxydations.
De nombreuses études (Gillette 1963, 1966) ont été faites sur les réactions oxydatives dues aux enzymes microsomiaux. On a démontré que le système oxydant contient au moins deux cataly
seurs, à savoir une f lavoprotéineda NADPH-cytochromeî. c réduc- tase, et une haemoprotéine;le cytochrome P-4 50 (voir chapitre 1.3) .
L'oxydation microsomiale des substances requiert de la nico- tinamide-adénine dinucléotide phosphate (forme réduite)(NADPH) et de l'oxygène moléculaire. Un tel système est celui des oxy
dases à fonctions mixtes (Voir chapitre 1.3)
b) Réductions.
Les enzymes localisés dans le réticulum endoplasmique des hépa
tocytes et, en plus petite quantité, dans le rein et le poumon, peuvent réduire les groupes azoïques (azoréductases) ainsi que les composés aromatiques azotés (nitroréductases). Mac Mahon
(1971) a publié des études sur la déhydrogénase hépatique de l'alcool, impliquée dans le métabolisme des fonctions alcool et carbonyle,cet enzyme se trouve dans la fraction soluble du
foie des mammifères.
Les azoréductases nécessitent NADPH comme co-facteur tandis que les nitroréductases semblent pouvoir utiliser NADPH ou NADH.
PHASE I : BIOTRANSFORMATIONS
Oxydation de la chaîne latérale:
R-CH2-CH3 R-CHOH-CH3
exemple : Pentobarbital ---^ Pentobarbital alcool
Hydroxylation aromatique:
R ROH
exemple ; Acétanilide ---^ p -Hydroxyacétanilide
N-oxydation;
R3N —(R3 NOH)"^--- ^R3 NO+H'*'
exemple : Triméthylamine ---> Triméthylamine N-oxyde
Sulfoxydation:
(OH) n
R-S-R'' --- >■ (R-S0H-R')+--->R-S-R'+ H'*'
exemple : Chlorpromazine ---> Chlorpromazine sulfoxyde
N-dêalkylation;
R-NH-CH3 > (R-NH-CH2 OH)—Î.R-NH2 + HCHO
exemple ; Aminopyrine ---> 4-Méthylaminoantipyrine
0
-dêalkylation;R-O-CH 3 - > (R-O-CH 2 OH) ---yR-OH + HCHO
exemple : Acêtophénétidine ---p-Hydroxyacétanilide
S-dëalkylation;
R-S-CH 3 --- (R-S-CH (OH) 2 OH)--- >R-SH+HCHO
exemple ;
6
-Méthylthiopurine >6
-Mercaptopurine7
Désamination ;
OH 0
R-CH(NH2 )-R' ■ ° - » R-C (NH2)-R'--->R-C-R'+NH3
exemple : Amphétamine ---y Phénylacétone
Désulfuration:
exemple
R= 5 -
Thiobarbital
(OH)
--->
--->
R = 0
Barbital
Nitroréduction:
R-NO2--- >R-N 0 --- > RNHOH--- 5 -RNH 2
exemple : Chloramphénicol --->■ 2-Dichloroacétamido-l-p- aminophénylpropane-
1
:3 diolAzoréduction t
R-N = N-R'---> R-NH-NH-R'’—»R-NH2 + R-NH2
exemple : Sulfachrysoîdine ---> Sulfanilamide
Déhydrogénase hépatique de l'alcool:
r -CHO R-CH2OH
exemple : Hydrate de chloral ---> Trichloroéthanol
Déhalogënation réductive:
R-CH2-X --->R-CH3--- Î.R-COOH
exemple : Halothane—Trif luoroéthane—s- A.cide trifluoro - acétique
N-oxyde réduction:
R3 N---> 0 --- > R3N + H2O
exemple : Triméthylamine N-oxyde > Trimethylamine
8
Hydrolyse ;
1) R-C-O-R'---5. R-C-OH + R'-OH
Il II
0 0
exemple : Procaïne -> Acide p--“ aminobenzoïque + Diéthvlaminoéthanol
R-CO-NH-R'--->R'-NH o + R-C-OH
2) ^ I]
0
exemple : Procainamide —^ Diéthyl-aminoéthylamine h
p-aminobenzoïque
acide
c) Hydrolyses.
Des enzymes catalysant l'hydrolyse des esters ont été mis en évidence dans le plasma sanguin; ceux qui catalysent l'hydro
lyse des amides ont été trouvés dans les microsomes hépatiques (Krisch, 1963) .
Les enzymes d'hydrolyse ne nécessitent aucun cofacteur. Dans certains cas ils sont activés par la présence de certains ions métalliques comme le manganèse (Franklin et al., 1971).
1.2.2. Réactions de la phase II. (Conjugaison)
Des composés contenant des groupements -
0
H,-NH2
et-COOII, les produits de la phase I ainsi que les métabolites des substances naturelles^ peuvent subir des conjugaisons (Williams, 1967 a) qui résultent habituellement en une détoxification.
Les réactions de conjugaison ont été appelées réactions de dé
toxification parce qu'elles font perdre leur activité à de nom
breux toxiques.
Ce sont des réactions biosynthétiques où les médicaments, ou leurs produits obtenus dans les réactions précédentes, sont condensés à des molécules fortement polaires (par exemple l'acide glucuronique, la cystéine etc...)
a) Glucuronoconjugaison.
C'est une des voies de métabolisation la plus répandue pour de nombreux médicaments.
Une voie principale, et probablement la seule, de la biosyn
thèse de glucurono-conjugués est le transfert de la fonction acide glucuronique de l'acide UDP-glucuronique au substrat
(aglycone) par l'enzyme UDP glucuronyl transférase. (Dutton et Storey, 1954; Storey et Dutton, 1955).
Plusieurs types de substances forment des glucuronides.Les exem
ples les plus souvent rencoitrés sont les alcools et les phénols qui forment les glucuronides de "type éther".
Les acides carboxyliques (surtout aromatiques) forment des glu
curonides de "type ester".
Différentes amines, spécialement les composés aromatiques, for
ment des N-glucuronides (Boyland et al., 1957; Axelrod et
al., 1958). Certains composés thiols forment des S-glucuroni- des (Dutton, 1966) .
b) Sulfoconjugaison.
La formation d'esters sulfatés a lieu en deux parties : d'abord, l'activation du sulfate, elle même un processus en deux étapes, puis le transfert du groupe sulfate à la substance acceptrice par l'action d'une sulfotransférase. Cet enzyme se trouve dans la fraction soluble du foie, le rein et l'intestin.
Les substrats des sulfotransférases sont des phénols, certains alcools aliphatiques et des amines aromatiques. Les alcools et les phénols forment des sulfates éthérés, tandis que les amines forment des suifamates:
c) Glycylconjugaison.
Ce processus de conjugaison implique l'interaction d'un acide avec une amine pour former une amide; (par exemple, la condensa
tion de l'acide benzoïque avec la glycine endogène pour former l'acide hippurique).
L'acide doit être transformé en une forme active , ce qui im
plique l'aryl coenzyme A.
Les substrats sont des acides carboxyliques (aromatiques et hé
térocycliques) et certains acides aliphatiques.
Les enzymes responsables de ces réactions sont des acyl transfé- rases. Les réactions ont lieu dans la fraction mitochondriale des cellules du foie et du rein.
d) Acétylations.
Ces réactions impliquent la condensation d'une amine avec un acide carboxylique, tel l'acide acétique..
Encore une fois, l'acide doit être transformé en une forme active, ce qui implique l'acétyl coenzyme A.
Ces réactions ont lieu dans de nombreux tissus et les substrats
sont des amines primaires aromatiques, certaines amines ali
phatiques endogènes, des acides aminés non physiologiques, des hydrazines, des hydrazides et des sulfonamides.
Les enzymes responsables de ces réactions sont des acétyl trans férases.
e) Formation de l'acide mercapturique.
Cette voie de conjugaison a été étudiée en détail chez l'animal (revue de Boyland et Chasseaud, 1969; et Wood, 1970), mais che l'homme, c'est une voie assez rare (Williams, 1963) .
Cependant, on sait maintenant que la formation d'acide mercap
turique a lieu avec une variété de composés, par exemple des phénols, des hydrocarbures aromatiques, des esters etc.
Dans la plupart des cas, ces composés réagissent avec le glu
tathion, en présence de glutathion-S-transférase, pour donner un conjugué. Celui-ci est transformé par une série de réac
tions enzymatiques en un dérivé de la cystéine. L'étape
finale implique l'acétylation de ce dérivé pour former l'acide mercapturique.
f) Méthylations.
Ce sont des voies mineures de conjugaison. Les produits ainsi formés ont parfois une activité biologique intense.
Les réactions ont lieu via la formation de S —adénosyl méthio
nine. Le groupe méthyl activé réagit alors avec différents accepteurs en présence de méthyltransférases.
La norépinéphrine, une aminase aliphatique endogène, peut subir une N-méthylation, mais il y a peu d'exemples de ce type. Des méthylations de phénols (
0
-méthylation) et de groupes thiols(S-méthylations) peuvent également avoir lieu.
12
PHASE II : CONJUGAISON
Réaction de conjugaison Types de composés Coenzyme conjugués
Glucuronoconjugaison Alcools, phénols, thiols, acide uridine acides carboxyliques, diphosphate glu-
amines curonique (UDPGA)
ex : Méprobamate ---^ Méprobamate-N-glucuronide
Sulfoconjugaison Phénols, alcools alipha- 3'-Phosphoadénosi tiques, amines aromatiques ne-5-phosphosul-
fate (PAPS)
ex ; Chlorpromazine ---^ 7-Hydroxychlorpromazine sulfate
Glycylconjugaison Acide carboxylique, quel- Aryl ou Aroyl ques acides aliphatiques coenzymes A
ex ; Acide benzoïque ---Acide hippurique
Acétylation Amines aromatiques pri- Acétyl Coenzyme A maires, hydrazines, hydra-
zides, sulfonamides
ex : Aniline ---Acétanilide
Formation d'acide mercapturique
Epoxydes, substances ha- Glutathion logénées, et groupes sul- (G S H) fonamides
ex ; Chlorure de Benzyle ---► Mercapturate de benzyle
Méthylation Amines, phénols, composés S-adénosylméthio-
thioliques nine
ex ; Histamine --- Méthylhistamine
13
1.3 MECANISMES DES PROCESSUS D'OXYDATION DANS LES MICROSOMES HEPATIQUES.
Le réticulum endoplasmique des cellules hépatiques comporte des enzymes de métabolisation liés à la membrane, qui sont
responsables de la biotransformation d'un ensemble de substrats endogènes (comme les stéroïdes, les enzymes gras, les acides biliaires) et de substances exogènes (comme les médicaments, les cancérigènes, les insecticides ainsi que de nombreux autres composés). (Orrenius et Ernster, 1974; Gillette et al., 1972;
Miller et al., 1974).
Ce système enzymatique nécessite absolument la présence de NADPH et d'oxygène moléculaire; il est connu sous le nom de monooxygénase ou "mixed function oxjdase".
La vitesse à laquelle différents composés sont métabolisés par ce système peut varier fortement et dépend de l'espèce, de l'âge, du tissus considéré, de l'état alimentaire et du prétraitement éventuel.
Les premières études réalisées avec des microsomes hépatiques ont montré que le système enzymatique microsomial de métabo
lisation contient au moins deux constituants protéiniques:
une haemgiprotéine appelée cytochrome P-450 et une flavoprotéi- ne appelée NADPH-cytochrome c réductase (ou NADPH cytochrome P-450 réductase)
Le cytochrome P-450 est le substrat et le site de liaison à l'oxygène du système enzymatique, tandis que les réductases jouent le rôle de transporteur d'électrons de NADPH au cyto
chrome p-450.
C'est en 1968 que les enzymes microsomiaux hépatiques d'hy
droxylation ont été solubilisés avec des détergents et résolus par chromatographie (Lu et Coon, 1968) en trois constituants identifiés comme étant le cytochrome P-450, la NADPH-cytochro
me ç réductase et un lipide (la phosphatidylcholine) (Lu et al., 1969a; Strobel et al., 1970).
14
Ces trois constituants sont nécessaires au métabolisme des acides gras et de différentes substances (Lu et al., 1972;
Lu et al., 1969b; Lu et al., 1970). Récemment,la purifica
tion du cytochrome P-450 et de la NADPH-cytochrome c réduc- tase (Dignam et al., 1975; lyanagi et Mason, 1973; Ryan et al., 1975a;Vermillion et Coon, 1974), a permis de démontrer que le métabolisme d'une série de médicaments, de stéroïdes, d'alkanes et d'hydrocarbones polycycliques (Lu et Levin, 1974;
Levin et al. 1974; Van der Hoeven et Coon, 1974) est tout à fait dépendant du cytochrome P“450 et de la NADPH cytochrome c réductase.
Le schéma proposé par Jansson et Schenkman (1977) (Figure 1) indique les trois voies principales du transfert des électrons
dans le système microsomial.
La voie impliquant les étapes 5-11 (14) et 12 est la "mixed function oxjdase"; celle qui implique les étapes
1
,2
et4
, la désaturase et celle des étapes 5 et8
, la neroxydase lipidique;une autre voie majeure impliquant les étapes 5,7 et 4 est la
"NADPH-supported yv 9 fatty acid"desaturase.
"Mixed function oxidase".
On a montré que la NADPH*«-cytochrome c réductase accepte les équi
valents réducteurs NADPH (étape 5) , réduisant dès lors sa fla- vine (Williams et Kamin, 1962) et transfère directement les .
électrons au cytochrome c (étape
6
) (Strittmater et Velick, 1956).L'implication de la NADPH-cytochrome c réductase dans les oxyda
tions dépendantes de NADPH, fut suggérée par Krisch et Staudin- ger (1961) et plus tard par Orrenius (1965). L'implication du cytochrome P-450 dans ce système hépatique fut mis en évidence par Cooper et al. (1965) en utilisant la réactivation photochi
mique de la réaction inhibée par le monoxyde de carbone.
L'implication de la NADPH-cytochrome c réductase dans l'étape 11 fut mise en évidence par une réaction d'anticorps provoquant une diminution de l'activité de la cytochrome P-450 réductase
et des "mixed function oxidations" (Glazer et al., 1971;
Masters et al., 1971a, indiquant que les étapes 5 et 11 sont impliquées dans les voies d'oxydation des substances.
L'étape 14 est la voie de transfert du second électron dans ces oxydations (Jansson et Schenkmann, 1977). Une autre hy
pothèse (Guengerich et al., 1975) est que le cytochrome P“450 accepte deux électrons au niveau de l'étape
11
.Pig. 1 :
Voies de transfert des électrons dans les microsomes (selon Jansson et Schenkman 19TT)
étapes 5“11~(1^~12 = mixed function oxidase"
étapes 1-2-1+ = désaturase étapes 5~8 = peroxidase
E-Fe-PPi = enzyme lié au pyrophosphate de fer;
LP = lipides non saturés; MA = malonyl aldéhyde
CSF = facteur sensible au cyanure; S = substrat de la
"mixed function oxidase".
17
1.4 COMPOSANTS DU SYSTEME MICROSOMIAL D'OXYDATION DES MEDICAMENTS.
a) Cytochrome P-450.
L'histoire du cytochrome P-450 a commencé en 1958 quand
Klingenberg et Garfinkel ont observé la présence d'un nouveau pigment dans les microsomes de foie de mammifères. Ce pigment montre^sous sa forme réduite, une différence d’absorption anor
male avec un pic à 450 nm en présence de monoxyde de carbone.
De 1961 à 1964, Omura et Sato (1962, 1964 a et b) ont prouvé sa nature d'haemoprotéine et l'ont appelée P-450 (pigment 450).
La plupart de ces protéines sont liées à la membrane, comme c'est le cas pour les microsomes de/foie, de rein (Ellin et al.
1972; Ichikara et al., 1971), du cortex des surrénales (Esta- brook et al., 1963) pour la muqueuse intestinale (Takesue et Sato, 1968), et pour les mitochondries de différentes glandes
endocrines (Harding et al., l964;Yohro et Horie,1967;Omura et al.1965 Parmi les composés impliqués dans le système microsomial d'oxy
dation, le cytochrome P-450 est certainement le plus important à cause de son rôle capital dans l'activation de l'oxygène et de la liaison au substrat.
Ces dernières années de nombreuses études ont suggéré que le cytochrome P-450 existe sous différentes formes dans les micro
somes de foie et ont montré que le prétraitement des animaux avec différents inducteurs provoquait des changements dans l'ac
tivité catalytique en présence de différents substrats et dans les propriétés spectrales du cytochrome P-450 (Conney 1967; Gil
lette et al., 1972; Kuntzman, 1969; Mannering, 1971).
Récemment, plusieurs laboratoires ont purifié les cytochromes P-450 (d'animaux prétraités au phénobarbital) et P-448 (d'ani
maux prétraités au 3 méthyl-cholanthrène) à partir des micro
somes hépatiques (Imai et Sato, 1974; Levin et al., 1974;
Van der Hoeven et al., 1974). Plusieurs formes de cytochrome P-450 et P-448, différents par leur poids moléculaire et leurs propriétés spectrales et catalytiques, ont été séparées
18
à partir de microsomes de foie de rat (Ryan et al., 1975b)et de lapin (Haugner et al. 1975). De plus, on a pu montrer qu'il y a plusieurs formes de cytochromes P-450 dans le foie d'un même animal. Cornai et Gaylor (1973) ont identifié trois formes de cytochrome P-450 qui ont des affinités de liaison différentes pour l’anion cyanure.
La présence de plusieurs formes de cytochrome P-450 chez des animaux non traités et traités par des inducteurs est un con
cept important puisqu'il pourrait modifier l'interprétation des mécanismes de la métabolisation par les microsomes hépati
ques .
Les différentes formes de cytochrome P-450 et P-448 peuvent avoir des spécificités tout à fait différentes pour les subs
trats .
Ainsi des proportions variables de ces formes dans une prépara
tion microsomiale pourraient peut-être expliquer les différences dues à l'espèce, l'âge et le sexe observées dans le métabolis
me des substances.
Le prétraitement des animaux avec un inducteur pourrait provo
quer l'induction d'une ou de plusieurs formes de cytochromes P-450 présents chez l'animal non traité, et changer la propor
tion entre les différentes formes.
Le nombre exact de cytochromes P-450 qui peuvent exister dans les microsomes hépatiques n'est pas encore connu.
b) NADPH-cytochrome c( P-450) réductase.
Des études par techniques immunologiques ont été réalisées sur le transfert des électrons dans les microsomes de foie, impliquant la NADPH-cytochrome c réductase (Omura 1969, Masters et al., 1971 a et b; Glazer et al., 1971). Cela a permis
d'établir le rôle de cette flavoprotéine dans la réduction du cytochrome P-450 des microsomes et de là, dans le métabolisme des médicaments.
La NADPH-cytochrome c réductase est présente dans de nombreux tissus comprenant le rein, la rate, les surrénales, le coeur
les poumons et le foie.
Elle est inductible par prétraitement des animaux avec des in
ducteurs comme le phénobarbital.
Elle est l'unique enzyme de transfert d'électrons de NADPH au cytochrome P-450 présente dans les microsomes de foie.
Elle est impliquée à la fois dans les "mixed function oxida- tions" et les peroxydations lipidiques qui se font par l'inter
médiaire de NADPH. Son rôle n'est pas encore clairement établi dans les désaturations des acides gras.
c) Cytochrome b.^.
Des études récentes ont mis en évidence que le cytochrome b.^
intervient dans les hydroxylations dépendant du cytochrome
P“450 des microsomes (Archakov et al., 1975; Correia et Manne- ring, 1973; Hildebrandt et Estabrook, 1971).
Actuellement, on peut faire plusieurs hypothèses.
1) Le cytochrome b.^ pourrait être impliqué dans certaines réactions dépendant de NADPH vu que des anticorps contre le cy
tochrome b^ inhibent en partie certaines réactions d'hydroxyla
tion (Sasame et al., 1974 a,b). Cependant, l'implication du cy
tochrome b^ peut dépendre du substrat et de la forme ,du cytochro me P-450 présent.
2) Le cytochrome b^ est nécessaire aux réactions dépendant de NADH, à savoir la réduction du cytochrome c, la désaturase et la peroxydation lipidique
3) Le cytochrome b^ joue un rôle important dans l'interaction entre les voies de transfert d'électrons entre NADPH et NADH.
20
1.5 FACTEURS INFLUENÇANT LE METABOLISME.
De nombreux facteurs peuvent affecter le métabolisme d'une substance par les microsomes :
a) L'espèce.
Les différences entre les espèces quant au métabolisme par les microsomes sont dues principalement à des différences dans la nature des enzymes responsables de ces biotransfor
mations. Les variations dans la biotransformation peuvent être qualitatives ou quantitatives. Les différences quali
tatives peuvent êtres dues à un enzyme présent chez une espè
ce et non l'autre, ce qui a pour conséquence l'absence d'une voie de métabolisation dont l'enzyme est responsable.
Les différences quantitatives peuvent être dues à des concen
trations différentes d'enzymes.
Une mise au point concernant les différences entre espèces dans le métabolisme fut décrite par Hucker (1970).
b) Le milieu.
Des facteurs extérieurs influencent le métabolisme et compren
nent: le régime alimentaire, l'irradiation aux rayons X, les changements hormonaux de l'organisme ainsi que l'ingestion de substances chimiques telles que les insecticides (Conney et Burns, 1962 ; Gillette, 1963; Fouts, 1963; Nair et Dubois,
1968); ces derniers, comme par exemple le DDT et le chlordane se sont révélés être de puissants inducteurs enzymatiques du métabolisme (Hardt et Fouts, 1963).
Certains médicaments comme les barbituriques, stimulent de la même façon le métabolisme d'autres médicaments, par exem
ple, les antivitamines K : ceci a pour conséquence de diminuer leur activité anticoagulante.
Par contre, une substance peut inhiber le métabolisme d'une autre et par conséquent, augmenter et prolonger son action pharmacologique (Gillette, 1963).
Parmi ces inhibiteurs se trouvent un certain nombre de médica-
ments qui ont été et sont encore utilisés en thérapeutique (par exemple
1
'iproniazide et le choramphénicol).c) Facteurs génétiques.
Les facteurs génétiques rendent compte des différences d'une personne à l'autre dans le métabolisme des médicaments.
La pharmacogénétique étudie ces facteurs et leur influence sur le métabolisme.
Un exemple fut décrit par O'Reilly et al. (1964).
Ces auteurs ont observé qu'un patient avait besoin de 20 fois la dose normale de warfarine pour obtenir un effet thérapeuti que.
L'explication donnée par O'Reilly et al. (1968) est la sui
vante : une mutation du site récepteur a modifié son affinité pour les anticoagulants et/ou la vitamine K.
d) Facteurs physiologiques.
L'influence du sexe sur la biotransformation fut démontrée dans de nombreux cas. (Kato et Gillette, 1965a, b; Beckett et al. , 1971).
Le métabolisme change avec l'âge: il décline chez le rat âgé et, pendant une courte période suivant la naissance, il est négligeable chez la souris, le cobaye, le rat et l'homme
(Jondorf et al., 1958; Kato et al., 1964; Berte et al., 1970;
Short et Davis, 1970).
Des variations dans le régime alimentaire peuvent également affecter l'activité enzymatique des microsomes hépatiques.
L'inanition des animaux diminue l'activité des voies d'oxy
dation métaboliques (Dixon, Shultice, Fouts, 1960; Laliberté, 1977).
La grossesse, ou l'administration de certains contraceptifs oraux stéroïdiens, inhibe un certain nombre de réactions méta boliques ( par exemple,
1
'hydroxylation de la coumarine, Creaven et Parke, 1965).22
1.5 LES ANTIVITAMINES K-.
Bien que les anticoagulants soient connus depuis plus d'un demi siècle, leur mode d'action sur la coagulation et la for
mation de thromboses n'a été compris qu'assez récemment.
L'utilisation appropriée de ces agents nécessite la compré
hension des processus d'hémostase et de coagulation.
1.6.1 Hémostase et coagulation.
L'hémostase physiologique commence par la libération locale, au niveau d'un vaisseau lésé^d'adénosine diphosphate (ADP) à partir de la paroi du vaisseau sanguin.'(Wéiss> 1975).
Cette libération d'ADP provoque l'adhérence des plaquettes au collagène et aux autres structures subendothéliales, mises à nu lors de la lésion. Le contact des plaquettes avec ces structures stimule la libération d'ADP supplémentaire (Gaar- der et al., 1961), ainsi que l'attraction d'un grand nombre de plaquettes ce qui a pour conséquence de former un clou hémostatique (thrombus blanc).
L'agrégation plaquettaire produit la libération d'un facteur lipidique 3 plaquettaire (Marcus, 1969) qui joue un rôle dans la coagulation plasmatique.
La coagulation consiste en une série de réactions enzymatiques en cascade, aboutissant, quand elle est endovasculaire, à la formation du thrombus rouge, dû à la transformation du fibri
nogène en fibrine (Barnhart, 1965; Ratnoff, 1966) . On distingue deux voies de coagulation.
La coagulation "intrinsèque" est initiée à la suite de l'ac
tivation du facteur de Hageman (XII) lors d'un contact du sang avec une surface mouillable (Wilner, 1968) . Ce contact déter
mine l'activation du facteur de Rosenthal (XI) qui lui-même active le facteur antihémophilique B (IX). Ce facteur IX,
en présence du facteur antihémophilique A (VIII) et de phospholi
pides, active le facteur de Stuart (X). Ce facteur X est également activé suivant une voie extravasculaire dite "coagu
lation intrinsèque". (Nemerson et Pitlack, 1972).
23
Lorsque la cause initiale de la coagulation consiste en une plaie vasculaire^la paroi lésée libère une thromboplastine tissulaire qui active en présence de Ca , la proconvertine
2+
(VII). Celle-ci active à son tour le facteur X.
Le facteur X occupe dès lors une position clef entre les coa
gulations intrinsèque et extrinsèque.
La coagulation continue selon une voie commune d'activation enzymatique.
Le facteur de Stuart (X), en présence d'un autre cofacteur pro
téinique labile, la proaccélérine (V) et du facteur 3 plaquet
taire, transforme la prothrombine (II) en thrombine (lia).
La thrombine, ainsi que tous les enzymes de coagulation activés, est une protéinase dont le site actif contient l'acide aminé sérine. C'est cet acide aminé qui est responsable de l'activité protéolytique (Gladner and Laki, 1958); (Magnusson, 1968).
la thrombine a plusieurs rôles dans l'hémostase : 1) Transformation du fibrinogène en fibrine.
Cette étape finale de la formation du caillot est initiée lorsque la thrombine coupe de façon sélective une paire de peptides aci
des de chaque chaîne polypeptidique de la molécule de fibri
nogène (Blombâck et al., 1967; Finlayson, 1974).
Les monomères de fibrine ainsi détachés, se polymérisent pour constituer la fibrine soluble (liens hydrogène). La fibrine est bientôt transformée en fibrine insoluble grâce à l'inter
vention du facteur de stabilisation de la fibrine (XIII) (Fin
layson, 1974) , qui renforce la cohésion des filaments de fibri
ne (liaisons convalentes).
Le polymère insoluble de fibrine résiste mieux aux phénomènes de lyse (Henderson and Nussbaum, 1969).
2) Effet sur les plaquettes.
En présence de thrombine, les plaquettes subissent une réorgani
sation interne et un changement de la forme disque en sphère.
La thrombine est également capable de favoriser l'agrégation des plaquettes ainsi que la libération de leurs constituants, à , savoir l'ADP , 1’atp , la sérotonine, d§3 catécholamines et des électrolytes (Weiss, 1975).
24
Lorsque de fortes concentrations de thrombine sont présentes, le fibrinogène des plaquettes est transformé en fibrine, de la même façon que celle décrite pour le plasma.
Ainsi, l'effet produit par la thrombine sur les plaquettes est de former un agrégat plaquettaire localisé, fortement connecté par la fibrine.
3) Effet sur les protéines de coagulation.
La thrombine favorise l'activation du facteur de stabilisa
tion de la fibrine (XIII) et, de plus, potentialise l'activité des facteurs V, VII, VIII et X. (Johnston Jr. and Hjort, 1961; Prentice et al., 1967; Weiss and Kochwa, 1970; Yin et al., 1971).
La thrombine, vu ses rôles multiples, occupe donc une position ca
pitale dans le processus de coagulation. On peut penser que l'inhibition de la coagulation pourrait se faire de façon ef
ficace en neutralisant la thrombine ou en empêchant sa forma
tion. Une telle neutralisation est provoquée par une alpha
2
globuline physiologique, appelée antithrombine III (Abildgaard,
1975). Cette protéine est probablement synthétisée dans le foie et largement distribuée dans l'organisme. Elle joue le rôle de tampon contre une activation excessive des processus de coa
gulation.
En plus, elle neutralise les autres protéines, à savoir les facteurs XII, XI, IX, X et VII, en modifiant le résidu sérine au site actif de ces molécules.
Avant que débute le processus inverse de lyse du caillot qui permet la reperméabilisation vasculaire, le thrombus se rétrac
te. La fibrinolyse commence tardivement sous l'action de la plasmine, enzyme protéolytique (neutralisée en partie par l'anti
thrombine III) (Rosenberg, 1974). Le fonctionnement harmo
nieux de tous ces systèmes enzymatiques interdépendants néces
site une fonction hépatique correcte puisque les hépatocytes synthétisent les facteurs V, X et le plasminogène.
Il nécessite aussi un apport suffisant en vitamine K, sans laquelle la synthèse des facteurs VII, IX et X est déficiente.
25
1-5.2 Chimie des antivitamines K.
L'histoire des antivitamines K remonte aux années 1920, quand Schofield (1922, 1924) décrivit une maladie hémorragique du bétail. Le "sweet clover disease" fut attribué à l'ingestion de trèfle doux avarié contenant un agent toxique interférant avec la coagulation sanguine.
Roderick (1929, 1931) établit le premier que cette maladie était accompagnée d'une diminution du taux de prothrombine
chez les animaux. L'effet n'était pas irréversible et la coagu
lation redevenait normale lorsque l'alimentation par le fourra
ge avarié était arrêtée.
En 1934, Link et Campbell identifièrent dans ce fourrage’la
substance responsable de la pathologie : la méthylène-3,3'-bis- hydroxy^
4
-coumàeîhe'3
(Link 1943, 1944).Depuis cette découverte, des centaines de dérivés furent étudiés mais seulement un petit nombre d'entre eux sont utilisés en thé
rapeutique. Ils diffèrent principalement par le délai d'ap
parition, la durée de leur activité anticoagulante et leurs effets secondaires.
Comme la voie orale est la seule voie d'administration (contrai
rement à l'héparine, injectable)^ les antivitamines K sont connues sous le nom d'anticoagulants oraux. Les structures chimiques des principaux anticoagulants sont reprises dans la figure
2
Ce sont des dérivés soit de 1'hydroxy-4-coumarine ou de 1 ' indane1
, 3-dione.Malgré la relative simplicité de la structure de ces substances, il est très difficile d'établir les caractéristiques chimiques essentielles requises pour avoir un effet anticoagulante
HYDROXY-4- COUMARINE
PHENPROCOUMON
OH ÇH2-CH2-CH3
-0'"'*0 CH2-CH2CI CLOCOUMAROL
OH .C.
O-CH2-CH3
BISHYDROXYCOUMARiNE ETHYLBISCOUMACETATE
lNDIANE-1,3- OIONE
PHENINDIONE
OCH3
■ Fig. 2 :
Structure des principaux anticoagulants dérives de
1 ’ hydroxy-ii-coumarine et de l'indane 1,3-dione.
1.6.3 Propriétés pharmacologiques des antivitainines K.
La thérapeutique par les anticoagulants oraux est basée sur l’hypothèse que leur interférence avec l'hémostase diminue
la mortalité due à des troubles thromboemboliques (Biggs, 1955) Les dérivés coumariniques et de 1'indane-dione ont tous essen
tiellement la même action dans l'organisme, leurs différences étant surtout quantitatives.
Effet sur la coagulation sanguine, (f
3
)L'effet pharmacologique des anticoagulants oraux est l'inhibi
tion du processus de coagulation sanguine par interférence avec la synthèse hépatique des facteurs de coagulation dépen
dant de la vitamine K (facteurs II, VII, IX, X) (Meunier et al.
1945; Quick, 1966).
Contrairement à l'héparine, ils ne sont pas actifs "in vitro"
et agissent "in vivo" après une période de latence d'au moins 12 à 24 heures. Cette période de latence rend compte de la disparition naturelle des facteurs de coagulation circulants.
Dans l'organisme, les facteurs de coagulation sont libérés à des vitesses qui maintiennent des concentrations normales en compensant les pertes dues à leur catabolisme. Ce catabo
lisme est rapide vu que la demi-vie plasmatique des facteurs VII, IX, X et II est respectivement de
6
, 20, 40 et 60 heures(Kazmier et al., 1965; Loeliger et Hemker, 1968; O'Reilly, 1974).
Même quand le catabolisme est accéléré (fièvre) ou ralenti (hypothyroïdisme, Loeliger et al., 1964) les concentrations de ces facteurs restent constantes.
Probablement, les vitesses de synthèse et de libération des facteurs sont modulées par un processus de rétrocontrôle.
Les anticoagulants oraux diminuent les concentrations plasma
tiques des facteurs dépendant de la vitamine K (facteurs II, VII, IX, X) (O'Reilly , 1972) et provoquent ce qu'on appelle
1'hypoprothrombinémie (Van der Meer et al. 1968).
Le ralentissement de la vitesse de synthèse de ces facteurs dépend de la concentration plasmatique de l'anticoagulant.
(O'Reilly et al., 1963, 1964; O'Reilly et Levy^ 1970),
Les anticoagulants oraux affectent uniquement la vitesse de synthèse des facteurs dépendant de la vitamine K, ils n'ont pas d'action sur leur catabolisme.
L'administration de fortes doses peut bloquer toute apparition ultérieure des facteurs dépendant de la vitamine K dans la
circulation. (O'Reilly et al., 1963; O'Reilly et Aggeler, 1968) Cependant, la réponse hypoprothrombinémique reste lente à s'éta
blir car elle dépend des vitesses normales du catabolisme des facteurs protéiques de la coagulation.
La concentration plasmatique en facteur VII va diminuer la pre
mière, suivie par celle des facteurs IX, X et II (Kazmier et al.
1965; Loeliger et al., 1968).
Des doses uniques, plus fortes que celles requises pour bloquer la synthèse des facteurs de coagulation, ne vont pas activer le développement de la réponse anticoagulante mais plutôt prolonger sa durée.
29
Fig. 3 :
Représentation schématiq.ue des mécanismes de la coagulation sanguine et du lieu d'action des anticoagulants.
(selon Goodman et Gilman 1975)
30
1.6.4 Structure et action de la vitanilne K.
En 1929, Dam observa que des poussins soiimis à un régime ren
fermant toutes les vitamines connues à
1
'époque succombaient en présentant des phénomènes d'hémorragies, apparemment dues à une diminution du taux de prothrombine dans le sang.Il a été possible de démontrer qu'une telle hypoprothrombiné
mie est le résultat d'une carence alimentaire. En effet, en administrant aux poussins atteints de la maladie hémorragique, certains végétaux verts,(luzerne, feuille d'épinard), le taux de prothrombine remonte et les épanchements sanguins s'arrê
tent.
Avant même d'avoir été isolée, la substance responsable de la synthèse de la prothrombine a été appelée vitamine K (Koagula- tion vitamih) . Les recherches de Dam et Almquist (1935) venaient à un moment où différents groupes de chercheurs étudiaient la cause des tendances hémorragipares observées chez des patients souffrant d'ictères par obstruction et de maladies hépatiques.
Par exemple, Quick et ses collaborateurs (1935) ont observé que les troubles de la coagulation dans des cas de jaunisse étaient dus à une diminution de la concentration en prothrom
bine du sang.
Dans la même année, Hawkins et Wijle ont montré que des ani
maux avec fistule biliaire pouvaient développer des hémorra
gies. Hawkins et Brinkhous (1936) montrèrent que c'était dû à une déficience en prothrombine et que l'administration de sels biliaires permettait un retour à la normale.
Le fait culminant de ces recherches expérimentales fut démon
tré par Butt et al. (1938) et Warner et
alu ('
(1938), à savoir qu'une thérapeutique associant la vitamine K aux sels biliaires était efficace dans le traitement des hémorragies survenant dans des cas de jaunisse. En effet, la bile est nécessaire à l'absorption de la vitamine K.
Ainsi fut établie la relation entre la vitamine K, une fonction hépatique normale et les mécanismes physiologiques de la coagula
tion sanguine.
Les premiers travaux ont montré que la vitamine K est une substance liposoluble présente dans le foie et l'alfafa.
Plus tard, on a montré que cette vitamine est concentrée dans les chloroplastes des feuilles et dans de nombreuses huiles végétales. Les selles de la plupart des animaux contiennent de grandes quantités de vitamine qui est synthétisée par la flore bactérienne dans le tractus intestinal (Pennock, 1966) . L'isolement et l'identification de la structure de la vitamine K furent réalisés., parallèlement par différents groupes de chercheurs. Rapidement il fut mis en évidence que l'activité de la vitamine K était associée à au moins 2 substances distinctes, appelées la vitamine et la vitamine K
2
-La vitamine ou phylloquinone (figure 4) se trouve dans les plantes. C'est la seule vitamine K disponible en thérapeu
tique. La vitamine K
2
représente une série de composés appelés les ménaquinones (figure 4); elles sont synthétisées par les bactéries gram-positives.
Un grand nombre de dérivés quinoniques naturels et synthéti
ques ont été testés pour leur activité de type vitamine K (Isler et Wiss, 1959). Parmi les substances synthétiques
qui ont une activité proche de celle de la vitamine naturelle, se trouve la ménadione (aiéthyl-2-naphto-l, 4-quinone^ ou vitamine
qui est au moins aussi active que la phylloquinone.
32
PHYLLOQUINONE (VITAMINE Ki )
O
MENAQUINONE (VITAMINE K2)
Fig, k :
Structure des vitamines K.
■CH3 3
•CH3
n = l-12
33
1.6.5 Mécanismes d'action de la vitamine K et des antivita- mines K.
Les anticoagulants oraux sont utilisés avec précaution vu les irrégularités dans le degré de l'effet anticoagulant.
Par exemple, on ne connaît pas encore les raisons fondamentales pour lesquelles la dose quotidienne d'entretien de warfarine est si variable dans une population (Coon et Willis, 1970); de même, les mécanismes des interactions entre les anticoagulants et d'autres substances, ne sont pas encore élucidés (Koch-Weser et Sellers, 1971).
Actuellement, on ne connaît de façon précise, ni le mode d'action par lequel la vitamine K participe dans la synthèse des facteurs de coagulation II, VII, IX et X^ni le mécanisme exact par lequel les antivitamines K interfèrent avec cette synthèse.
Des études réalisées chez le rat ont montré que la vitamine K agit après la synthèse du noyau protéinique de la prothrombine
(Pereira et Couri, 1971; Johnson et al., 1971; Shah et Sutter, 1971) et que la warfarine provoque l'accumulation de la vitamine
2,3-époxyde (Matschiner et al., 1970; Bell et al., 1972).
Nous allons envisager plus en détail ces deux constatations.
a) En 1963, Hemker et ses collaborateurs ont montré que le trai
tement par les anticoagulants ne provoque pas seulement une
diminution des facteurs dépendant de la vitamine K (facteurs II, VII, IX et X); ils ont démontré la présence d'une protéine anor
male dans le plasma des patients soumis à cette thérapeutique, et ont suggéré qu'elle était un précurseur inactif de la pro
thrombine (facteur II). Cette protéine anormale fut appelée fi
P I V K A de l'abréviation Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist/, (Hemker et Muller, 1968; Hemker et al., 1968).
Plus tard, de nombreux chercheurs ont confirmé, par des tech
niques immunologiques, la présence de prothrombine anormale et de facteurs VII, IX et X anormaux (PIVKA II VII IX X) dans le plasma de tous les patients sous anticoagulant (Ganrot et Niléhn, 1968; Larrieu et Meyer, 1970; Denson, 1971).
34
Des études réalisées chez des rats déficients en vitamine K ont mis en évidence qu'un précurseur protéinique est impli
qué dans la formation de la prothrombine (Bell et Matschiner, X969; Suttie, 1967, 1970).
L'administration de vitamine K à ces rats permet une restaura
tion très rapide de la concentration en prothrombine et même en présence de cycloheximide, un inhibiteur de la synthèse pro
téinique. (Shah et Suttie, 1971).
Ces observations suggèrent que la vitamine K n'est pas néces
saire à la synthèse de la chaîne polypeptidique de la prothrom
bine et qu'elle agit en transformant un précurseur inactif en un facteur de coagulation biologiquement actif.
L'administration d'anticoagulants au bétail provoque l'appa
rition de prothrombine inactive dans le plasma (Stenflo, 1970).
La comparaison de la prothrombine bovine normale avec cette prothrombine anormale montre que cette dernière n'a pas d'acti
vité biologique, n'a pas d'affinité de liaison pour les ions calcium et ne s'adsorbe pas quantitativement sur les sels de baryum (Stenflo et Ganrot,l972;Nelséstuen et Suttie, 1972;Josso et al.1970).
Nelsestuen en Suttie (1973) ont suggéré que la prothrombine normale et anormale sont une même protéine et que les différen
ces observées sont dues à l'action de la vitamine K.
La liaison au calcium est essentielle pour l'activation de la prothrombine en thrombine et les sites de liaison au calcium sont également responsables de
1
'aüsorption quantitative de lai prothrombine sur le citrate de baryum.
Pereira et Couri (1971) ont émis l'hypothèse que le site d'ac
tion de la vitamine et de la bishydroxycoumarine, tout en respectant la synthèse de la prothrombine, se trouve après l'incorporation
des acides aminés dans la protéine et au niveau ou avant la fi
xation de la glucosamine. Etant donné qu'elle est le premier ose de la chaîne de polysaccharides^ il est possible que le site d'ac
tion soit au niveau de la glucosamyltransférase.
b) Depuis un certain nombre d'années, de nombreux chercheurs ont émis l'hypothèse que l'interférence des anticoagulants, de type coumarine et indane-dione avec la synthèse des facteurs de
35
coagulation dépendant de la vitamine K, est liée à l'inhibition d'une étape enzymatique spécifique dans le métabolisme de la vitamine K elle-même.
L'hypothèse fut émise que la vitamine K s'équilibre entre sa forme naturelle biologiquement active et un métabolite inactif
(2,3 époxyde) (Bell et Matschiner, 1972) ceci pendant la syn
thèse normale des facteurs II (prothrombine), VII, IX et X.
Etant donné que dans les travaux concernant cet aspect du méta
bolisme de la vitamine K, c'est la vitamine qui a été utilisée, cet équilibre cyclique entre la vitamine et son métabolite 2,3 époxyde, fut appelé le cycle vitamine K^-époxyde.
Ce cycle dépend d'au moins 2 enzymes qui ont été en partie caractérisés comme étant la phylloquinone époxydase (Willing- ham et Matschiner,1974) et la phylloquinone époxyde réductase
(Matschiner, Zimmerman et Bell, 1974; Zimmerman et Matschi
ner, 1974).
Matschiner et al.,(1974), ont montré que la warfarine inhibe la phylloquinone époxyde réductase in vitro, ce qui explique que, in vivo, la phylloquinone-
2
,3-époxyde s'accumule dans lefoie des rats traités par la warfarine (Matschiner et al., 1970).
Ils ont dès lors suggéré que l'étape dépendant de la vitamine K dans la synthèse des facteurs de coagulation est liée à l'épo
xydation de la vitamine (Willingham efrMàts'chiner, 1974) et que le rôle de la réductase est de régénérer la vitamine K
(Zimmerman, Matschiner, 1974) .
Les anticoagulants de type coumarine et indane-dione provo
quent l'accumulation de la phylloquinone-
2
,3-époxyde dans le foie des rats en inhibant la réduction de l'époxyde en vitamine (Ren, Laliberté et Bell, 1974; Sadowski et Suttie, 1974).
Chez l'homme, la phylloquinone-2,3-époxyde s'accumule égale
ment dans le plasma de patients traités par la warfarine
(Shearer et al., 1973). Ces résultats suggèrent que tous les anticoagulants oraux courants sont des inhibiteurs du cycle vitamine K^-époxyde.
L'identification de la phylloquinone gpoxyde comme métabolite principal qui s'accumule dans le plasma de patients sous warfa
36
rine, suggère que la warfarine interfère avec un récepteur qui serait la phylloquinone époxyde réductase.
Un schéma métabolique qui montre comment l'inhibition de la phylloquinone époxyde réductase rend compte de ces hypothè
ses est montré dans la figure 5.
Le schéma est basé sur le cycle vitamine K^^-époxyde proposé par Matschiner et ses collaborateurs (Bell et Matschiner, 1972;
Matschiner et al., 1974; Willingham et Matschiner, 1974), mais il tient compte aussi des résultats concernant le métabo
lisme normal de la phylloquinone (Shearer et al., 1974).
En 1972, Bell et Matschiner ont émis l'hypothèse que la vita
mine époxyde est un inhibiteur compétitif de la vitamine et que la warfarine inhibe la synthèse des facteurs de coagulation en provoquant l'accumulation de cet époxyde.
Actuellement, cette hypothèse n'est plus valable.
En effet, Caldwell et al. , (1974), ont montré que suite à l'administration de vitamine K^d'une part et de vitcimine avec son époxyde (rapport 1:4) d'autre part, à des rats traités par la warfarine, on obtenait la même inhibition de la synthèse de la prothrombine alors que les rapports entre la vitamine et son époxyde étaient respectivement de 1:3 et 11:4.
Ceci suggère que des proportions élevées d'époxyde / vitamine ne sont pas en corrélation avec une inhibition de la synthèse de la prothrombine.
Il est très probable que le cycle vitamine K^^-époxyde est impli
qué dans le mécanisme d'action de la warfarine.
Shearer et al., (1977) ont suggéré qu'il y a une relation étroite entre l'action pharmacologique de la warfarine et l'inhibi
tion du métabolisme de la vitamine K et que le site de cette inhibition est la phylloquinone époxyde réductase. Cependant, une corrélation directe et sans équivoque entre le degré de cette inhibition et l'inhibition de la synthèse de la prothrom
bine, n'a pas encore été établie.
37
Fig. 5 :
Relation entre le cycle vitamine K-époxyde et la synthèse des facteurs de coagulation dépendant de la vitamine K
(selon Shearer et al. 19TT)*
38
1.6.6 METABOLISME DES ANTIVITAMINES K.
Les premières études faites par Link ont suggéré que les anti
coagulants coumariniques sont métabolisés en acide salicylique (Link, 1945; Link et al., 1943). La molécule subirait une ou
verture du cycle coumarinique, suivie d'une décarboxylation.
Une dizaine d'années plus tard, le métabolisme de la coumarine a été étudié chez le lapin et aucune ouverture du cycle ni la présence d'acide salicylique n'ont pu être mis en évidence.
(Mead et al., 1958; Furuya, 1958).
Par contre, des études réalisées avec la coumarine marquée ont suggéré que chez le lapin et le rat, la coumarine est surtout métabolisée via une ouverture du cycle (Kaighen et Williams,
1961) .
Des études sur le rôle de la microflore intestinale sur le métabolisme de la coumarine chez le rat, ont montré également qu'elle pouvait subir une ouverture du cycle (Scheline, 1968).
Depuis lors, de nombreux travaux concernant le métabolisme des anticoagulants coumariniques ont été réalisés; aucun ne mention
ne cette voie de biotransformation.
Parmi les différents anticoagulants coumariniques, la warfarine a été la plus étudiée tant au point de vue de sa pharmacocinétique que du point de vue de son métabolisme chez l'homme et chez
1
'animal.La warfarine existe sous deux formes isomères R (+) et S (-) . La forme utilisée en thérapeutique est un mélange racémique en quantités égales de chaque isomère.
Les isomères diffèrent par l'intensité de leur action anticoa
gulante; chez l'homme et chez le rat, la warfarine S(-) est cinq fois plus puissante que la warfarine R(+) (O'Reilly, 1971;
Eble et al., 1966; Brekenridge et Orme, 1972; Hewick, 1972;
Hewick et al., 1973).
Deux voies majeures de métabolisation sont connues jusqu'à pré
sent pour la warfarine : l'oxydation par le système des "mixed function oxîdases" des microsomes hépatiques (Ikeda Conney et Burns, 1968) , qui aboutit à la formation de métabolites hydroxylés
39
en différentes positions sur le noyau coumarinique et la réduc
tion par une réductase non inicrosomiale, NADPH dépendante (More- land et al., 1975), qui aboutit à la formation de deux alcools
(R,S) et (S,S).
Les études réalisées avec chaque isomère R {+) et S (-) de la warfarine montrent qu'ils sont métabolisés différemment.
Chez l'homme, la warfarine R (+) est métabolisée principalement en alcool (R,S), tandis que son isomère S (-) est métabolisé en hydroxy-7-warfarine et alcool (S,S); les deux isomères donnent lieu à la formation, en quantités égales, d'hydroxy-
6
-warfarine(Lewis et al., 1974; Chan et al., 1972).
Des expériences réalisées "in vitro" avec des microsomes de foie de rat montrent que la warfarine R (+) est métabolisée princi
palement en hydroxy-7-warfarine et la warfarine S (-) en alcool (S,S); chaque isomère est métabolisé dans les mêmes proportions en hydroxy-
6
-warfarine et hydroxy-4'-warfarine. (Pohl et al., 1976) .Des expériences réalisées "in vivo" chez le rat et le cobaye mettent en évidence que la warfarine (mélange racémique) est métabolisée en quatre composés hydroxylés en position 6,7 et
8
du noyau coumarinique, ainsi qu'en position 4' du cycle benzé- nique. (Deckert, 1973; Barker et al., 1970; Townsend et al., 1975).Une étude récente du métabolisme de 1'acénocoumarine chez l'homme (Dieterle et al., 1977) montre qu'elle est également métabolisée par deux voies majeures différentes : la réduction du groupe aromatique azoté (formation d'un amino-et d'un acéta- mino-métabolite) ainsi que celle de la fonction cétone (forma
tion de deux alcools diastéréoisomères), et l'oxydation du noyau coumarinique (formation d'hydroxy
-6
et 7-acénocoumarine).Le phenprocoumon est un mélange racémique de deux isomères R (+) et S (-).
L'isomère S (-) a une activité anticoagulante beaucoup plus forte que le R (+) chez le rat (Schmidt et Jahnchen, 1977) et
chez l'homme (Jâhnchen et al. 1976).
Le phenprocoumon est biotransformé chez le rat en composés
hydroxylés en positions
6
, 7 et8
et 4' (Haddock et Trager, 1975).Beaucoup moins d'études ont été réalisées avec les anticoagulants à double cycle coumarinique.
L'éthylbiscoumacétate est métabolisé chez l'homme, principale
ment en dérivé hydroxylé en position 7 (Burns et al., 1953a) cependant, chez le lapin, une dé-estérification est observée.
(Burns et al., 1953b).
■ N
Des études réalisées sur la bile de rat ont montré la présence de glucuronides de la bishydroxycoumarine ainsi que de l'hydroxy- 7-bishydroxycoumarine. (Conway et al., 1975).
En conclusion, la voie métabolique majeure pour les anticoagu
lants de type coumarinique implique l'oxydation du noyau couma
rinique en différentes positions
(6
et 7 chez l'homme).C'est un phénomène de détoxification puisque ces métabolites sont plus polaires et de cette façon, beaucoup plus rapidement excrétés; de plus, ils sont beaucoup moins actifs ou totalement inactifs.
Des études pharmacologiques réalisées avec les différents métaboli
tes hydroxylés de la warfarine n'ont pas permis de démontrer une quelconque activité. (Lewis et Trager, 1971 ; Ôeckert, 1973;
Lewis et al., 1973).
De même, il fut démontré que 1'hydroxy-7-acénocoumarine était inactive.(Dieterle et al., 1977).
Le seul métabolite hydroxylé actif de la warfarine fut isolé chez le rat; il s'agit de 1'hydroxy-4 '-warfarine dont l'activité est approximativement quatre fois moindre que celle de la war
farine. (Barker et al., 1970).
Quant aux métabolites alcool (R,S) et (S,S) de la warfarine, ils ont une certaine activité anticoagulante; cependant, ils sont présents en quantités trop petites pour avoir une influence sur l'action pharmacologique de la warfarine.(Lewis et al., 1973).
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Chapitre 2
BUT DU TRAVAIL
