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Discussion et conclusions

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5.4.4 Discussion et conclusions

Les résultats des expériences.d'équilibre de dialyse, inter­ prétés par la méthode de Scatchard, indiquent la présence de plus d'une classe de sites de liaison du clocoumarol à l'albu­ mine bovine.

L'existence de deux classes de sites, ayant des affinités dif­ férentes, a été mise en évidence pour l'acénocoiamarine et la warfarine par ultrafiltration (Tillement et al., 1974), pour la bishydroxycoumarine et 1'éthylbiscoumacétate par équilibre de dialyse (Garten et Wosilait, 1972) et pour le phenprocoumon par équilibre de dialyse (Niedner et al., 1975).

Nos résultats suggèrent qu'à faible concentration de clocou­ marol, il y a un nombre limité de sites de liaison à la molé­ cule d'albiimine; l'occupation de ceux-ci provoque un changement de conformation, ce qui expose des sites de liaison supplémen­ taires. L'inaccessibilité de ces derniers sites pourrait être due au fait qu'ils sont cachés à l'intérieur de la protéine, ou bien qu'ils sont en surface, mais dans une mauvaise posi­ tion par rapport aux premiers.

Une telle possibilité est déduite des études de dispersion rota­ toire optique de Markus et Karusch (1957; 1958), qui ont obser­ vé des variations dans la configuration de l'albumine pendant sa liaison à des colorants et à des détergents.

Le nombre de sites (n ) de liaison de la classe I est de 2,5 pour 3

le clocoumarol, avec une constante d'affinité de 297 10

1/M

(t“ = 37° C)

Des valeurs similaires ont été obtenues pour le phenprocoumon

(à t° ordinaire) : n^^=2,4 et kj^=396 10^ 1/M (Hüthwohl et Jahnchen, 1972).

L'acénocoumarine et la bishydroxycoumarine ont également des va­ leurs de proches de 2 (O'Reilly, 1970; Garten et Wosilait, 1971). Cependant, il y a une controverse dans la littérature quant à la valeur de n^^ pour la warfarine.

Certains travaux indiquent une valeur de n^^ proche de 1 (O'Reilly et Kowitz, 1966a; 1967; Aggeler et al., 1967), tandis que

d'autres suggèrent qu'il y a deux sites maximum dans la classe I (O'Reilly, 1969; Garten et Wosilait, 1971; O'Reilly, 1973). Les raisons de ces différences ne sont pas connues.

Les différents travaux réalisés avec les anticoagulants cou- mariniques indiquent tous que l'affinité de liaison pour les sites de la classe I est beaucoup plus forte que pour ceux de la classe II.

Nos résultats avec le clocoumarol le mettent également en évi­ dence. Par ailleurs, nous montrons qu'à faible température

(4°C), l'affinité de liaison est plus grande qu'à haute température (37°C). Des résultats identiques ont été trouvés avec certains colorants (Karusch, 1950), la thyroxine (Sterling et al., 1962) et la warfarine (O'Reilly et Kowitz, 1967).

Cette diminution de l'affinité de liaison quand la température augmente est caractéristique de réactions exothermiques(Daniels et Alberty, 1961).

Les valeurs de

ù

F°^pour l'interaction entre le clocoumarol et l'albumine, varient entre -7,1 et -7,8 kcal/mole de clocou­ marol .

Ces résultats sont comparables à ceux obtenus au même pH de 7,4 pour le phenprocoumon, à température ambiante

(A

-/7^56 kcal/mole) Hüthwohl' et Jâhnchen ( 1972), pour l'acénocou- marine et la bishydroxycoumarine à 27°C (AF°^=-7,09 kcal/mole. et-7,37 kcal/mole) (0'Reilly,1973) et pour la warfarine à 37°C

('AF°^=-7,01 kcal/mole) (O'Reilly et Kowitz, 1967).

Les résultats des différentes études concernant l'interaction entre l'albumine et les anticoagulants, mettent en évidence la variation du degré de liaison d'après les concentrations en substance et en protéine.

L'expression de cette interaction par des constantes d'affinité et des énergies de liaison est donc plus correcte que par un

Chapitre 6

131

Les dérivés de 1 ' hydroxy-4-covunarine sont des substances

qui agissent

in vivo

sur la coagulation sanguine en déprimant la synthèse de quatre facteurs de coagulation : la prothrombine

(facteur II), la proconvertine (facteur VII)/ le facteur antihémophilique B (facteur IX) et le facteur de Stuart

(facteur X).

Etant donné que la vitamine K est indispensable pour la synthèse de ces facteurs, ces composés ont été appelés anti­ vitamines K.

En thérapeutique, les antivitamines K sont utilisées pour traiter les maladies thromboemboliques. Cependant, leur mode d'action n'est pas encore tout à fait élucidé.

Les antivitamines K sont administrées exclusivement par voie orale et les anticoagulants oraux les plus couramment utilisés sont le phenprocoumon, le sintrom, le tromexan et la v/arfarine. Ces composés ont en commun la structure de l'hydroxy-4-coumarine, appelée noyau coumarinique, et diffèrent par les radicaux

de substitution en position 3.

L'étude du métabolisme de ces anticoagulants chez l'homme et chez l'animal a mis en évidence que la voie majeure de

biotransformation est l'oxydation.

Les métabolites formés sont des composés hydroxylês en

différentes positions du noyau coumarinique, plus polaires que la substance de départ, et de ce fait, rapidement éliminés par le rein, tels quels ou sous forme de conjugués.

Disposant d'un nouveau dérivé coumarinique de synthèse de structure originale, le clocoumarol, nous avons étudié sa métabolisation

in vitro

et

in vivo

chez le rat.

Parallèlement, nous avons entrepris l'étude comparative de la biotransformation du phenprocoumon, dont la structure est la plus proche de celle du clocoumarol et de la warfarine.

L'étude du métabolisme

in vitro

a été réalisée en présence de microsomes hépatiques dans des conditions expérimentales classiquement utilisées pour étudier les oxydations

(c'est-à-dire, en présence d'un système générateur de NADPH et d'oxygène ) .

Les études réalisées avec le phenprocoumon et la warfarine ont montré que le système des "mixed functions oxidases" est impliqué dans la formation des métabolites hydroxylés.

Les méthodes généralement utilisées pour isoler ces' métabolites à partir de mileux biologiques, mettent en oeuvre des passages en milieu alcalin.

Nous avons choisi d'autres conditions d'extraction et avons mis au point des techniques analytiques nouvelles à savoir

la chromatographie liquide et sur couche mince haute performance.

Dans ces conditions expérimentales, nous avons tenté de découvrir de nouveaux métabolites du phenprocoumon et de la warfarine et recherché des métabolites du clocoumarol autres que les composés hydroxylés.

Nous avons étudié la métabolisation

in vitro

du clocoumarol en présence de microsomes de foie de rat, de souris et de cobaye.

Trois métabolites (mj^,m2,m2), moins polaires que le clocoumarol, ont été détectés sur couche mince.

Il semble donc qu'il n'y ait pac de différences qualitatives entre ces espèces animales quant à la formation de ces

métabolites.

yj

Les expériences réalisées chez le rat montrent que, parmi les métabolites formés, le métabolite semblait être quantitati­ vement le plus important (nette fluorescence bleue sous ÜV à 350 nm). Cette constatation fut confirmée en isolant les métabolites sur couche mince.

Etant donné que le taux de récupération des métabolites m2 et m^, à partir des incubations, était très faible, nous nous

sommes dès lors attachés à étudier la formation du métabolite mj^

in vitro

et à déterminer sa structure.

Nous avons montré que, chez le rat, le clocoumarol est métabo­ lisé en composé m^^ par le système des "mixed functions oxidases" des microsomes hépatiques.

Un système générateur de NADPH, l'oxygène et les microsomes sont absolument nécessaires à la formation de ce métabolite. Une preuve supplémentaire est apportée par le fait qu'en

présence de monoxyde de carbone, la formation de ce métabolite est complètement inhibée.

Nous avons déterminé les conditions optimales de formation du métabolite m^. Pour chaque série d'expériences, des incubations

contrôle ont été réalisées. Les chromatogrammes obtenus par chromatographie liquide haute performance montrent qu'en

l'absence de microsomes, le clocoumarol ne subit aucune modifi­ cation et que le milieu d'incubation (système générateur de NADPH et tampon phosphate) et les microsomes, n'interfèrent pas avec la détection du clocoumarol et de son métabolite.

La chromatographie liquide haute performance s'est révélée être une méthode rapide et sensible, particulièrement adaptée pour étudier la métabolisation

in vitro.

Cela nous a permis, d'une part, d'aborder l'étude quantitative du métabolisme du clocoumarol et d'autre part, de réaliser une étude cinétique.

Les paramètres cinétiques (vitesse maximale de formation du métabolite m^^ et l'affinité du complexe enzyme-substrat), ont été déterminés en mesurant la quantité de métabolite m^ formée en présence de quantités croissantes de substrat.

Dans ce but, nous avons comparé le métabolisme du clocoumarol par les microsomes de foie de rat soit traités au

phénobarbital (37,5 mg/kg; deux injections par jour pendant 3 jours), soit non traités.

La représentation graphique de Lineweaver-Burk (1934) des relations substrat-activité, met en évidence d'une part, que dans les deux cas, une relation linéaire est obtenue

indiquant la présence d'un seul système enzymatique; d'autre part, le phénomène d'induction enzymatique provoqué par le phénobarbital est nettement mis en évidence, étant donné que la vitesse de formation du métabolite m^^ est augmentée.

Ce phénomène est uniquement qualitatif puisque l'affinité

du complexe enzyme-substrat reste la même, que les rats soient traités ou non au phénobarbital.

Ces résultats sont à rapprocher des cas observés en clinique, lorsque des antivitamines K et des barbituriques sont

administrés simultanément.

Par ailleurs, nous avons mis en évidence que chez le rat

n'ayant subi aucun prétraitement, le clocoumarol est métabolisé en métabolite m^^ à raison de 10 à 15 % de la quantité initiale de clocoumarol présent dans le milieu d'incubation.

Ces résultats indiquent que la métabolisation du clocoumarol en métabolite m^^ est importante.

Nous avons isolé le métabolite m^^ sur couche mince et déterminé sa structure d'après les résultats obtenus en spectrométrie

d'absorption UV,IR, spectrométrie de masse et de RMN protonique. Ces méthodes ont pu être réalisées d'autant plus facilement que nous avons trouvé un moyen d'obtenir de plus grandes quantités de métabolite m^ en traitant le clocoumarol par un système oxydant (solution de dichromate de potassium et d'acide acétique 1 %).

U

L'identité du métabolité iti^^ obtenu après incubation avec les raicrosoraes de foie de rat et du composé obtenu directement à partir du clocoumarol, a été mise en évidence par

co-chromatographie ainsi que par la similitude des spectres UV,IR et de masse.

Il en résulte que le métabolite m^ a une structure tout à fait particulière et originale, qui n'a jamais été décrite jusqu'à présent pour aucun anticoagulant (fig.dS ).

En effet, l'ensemble des résultats obtenus montrent notamment que le poids moléculaire du métabolite m est inférieur (m"^;344) a celui du clocoumarol (M :356), que le radical en position 3 de 1'hydroxy-4-coumarine reste inchangé et que le noyau

coumarinique a été ouvert.

L'ouverture du cycle coumarinique par métabolisation n'est pas un phénomène nouveau. Link (1943-1944) l'avait déjà observé pour certains dérivés de 1'hydroxy-4-coumarine, et avait suggéré que c'était une nouvelle voie de métabolisation menant à la

formation de dérivés salicylés.

Cependant, depuis lors seules quelques études réalisées avec la coiimarine mentionnent cette ouverture du cycle, mais aucune étude récente ne la met en évidence.

De plus, la présence de dérivés salicylés est fort controversée et nous n'avons jamais pu mettre en évidence de tels composés en étudiant le métabolisme du clocoumarol.

La structure du métabolite m^ est donc tout à fait originale. Les différentes étapes qui président à sa formation sont le fait qu'au pH physiologique, le clocoumarol se trouve principalement sous sa forme d'hydroxy-2-chromone (tautomère de

1'hydroxy-4-coumarine) (fig.35 ), et que sous cette forme il est aisément métabolisé par les enzymes microsomiaux qui provoquent une décarboxylation suivie d'une oxydation du carbone en position 3 de 1'hydroxycoumarine substituée.

156

Nous avons vérifié si le métabolite m^ possédait une action anticoagulante chez le rat.

L'administration intrapéritonéale unique de 100 fois la dose minimale active du clocoumarol, ne provoque aucun effet

anticoagulant.

Ces résultats rejoignent les constatations généralement observées que toute modification du noyau coumarinique entraîne la perte de l'activité anticoagulante.

Nous nous sommes demandés si la formation du métabolite m^^ était propre au clocoumarol et si cette nouvelle voie de métabolisation pouvait être généralisée à d'autres anticoagulants.

Dans ce but, nous avons étudié le métabolisme

in vivo,

dans les mêmes conditions, du phenprocoumon et de la warfarine.

De ce fait, nous avons pu vérifier l'hypothèse que nous avions faite, à savoir que la forme hydroxy-2-chromone non stabilisée est facilement métabolisée par les enzymes microsomiaux hépatiques.

Après incubation du phenprocoumon avec des microsomes de foie de rat, un métabolite a pu être détecté sous UV à 3 50 nm, présentant une forte fluorescence bleue et de polarité inférieure à celle du phenprocoumon (trois phases mobiles différentes).

Ce métabolite a été isolé sur couche mince et sa structure a été identifiée.

Il en résulte que ce métabolite est en tous points comparable au métabolite m^^ du clocoumarol (fig.3i6 ).

Les spectres d'absorption UV et IR ainsi que les spectres de masse et de RMN protonique sont semblables à ceux obtenus avec le

métabolite m. du clocoumarol; la spectrométrie de masse indique

également une diminution du poids moléculaire de 12 unités (M :268) , sans modification du radical substitué en position 3.

Nous en concluons qu'il y a donc un parallélisme de comportement tout à fait évident entre le clocoumarol et le phenprocoumon.

1

Par contre, nous nous attendions à ce que la warfarine ait un comportement un peu différent. En effet, grâce à sa fonction cétone, la warfarine peut être stabilisée sous sa forme

hydroxy-2-chromone ou hydroxy-4-coumarine (fig.3? )•

Dès lors, la formation d'un métabolite de type m^^ devenait beaucoup moins probable.

Les résultats que nous avons obtenus

in vitro

par chromatographie liquide et sur couche mince haute performance ainsi que par

chromatographie gazeuse, confirment que cette voie de métabolisa- tion est très mineure.

Pour explorer cette nouvelle voie de métabolisation et confirmer les résultats obtenus

in vitro,

nous avons étudié la

biotransformation du clocoumarol, du phenprocoumon et de la warfarine

in vivo

chez le rat.

Dans ce but nous avons mis au point une technique nouvelle dans le doraaine de l'étude des biotransformations.

Elle consiste à capter les anticoagulants et leurs métabolites présents dans l'urine, par un polymère poreux (Tenax GC^) . Ce dernier est connu depuis quelques années seulement et a été principalement utilisé pour capter des composés volatils

jy, B. ;

Les expériences concernant la biotransformation

"in vivo" sont sur le point d'être terminées^

(explications voir chap.4)

Nous avons tenté de mettre en relation le parallélisme de compor­ tement observé pour la biotransformation du clocoumarol et du phenproco\imon avec l'activité pharmacologique de ces substances. D'autre part, nous avons essayé de voir si le comportement

différent de la warfarine avait une répercussion sur la durée de son activité anticoagulante.

Nous avons choisi la méthode du thrombotest d'Owren pour étudier l'activité anticoagulante. Cette méthode, rapide et facile, explore globalement les quatre facteurs dont la synthèse est déprimée par les antivitamines K et permet d'avoir rapidement des renseignements sur l'effet anticoagulant.

De plus, nous avons exprimé les résultats en fonction de l'activi­ té du complexe prothrombinique (PCA %) plutôt qu'en temps de

coagulation. Cette expression nous a paru meilleure car, au

maximiim d'activité anticoagulante, des temps de coagulation longs (> 2 min), apparamment très différents, correspondent en fait à ' une activité prothrombinique très proche (entre 3 et 7 %) .

L'activité anticoagulante du clocoumarol et du phenprocoumon a été comparée chez deux espèces animales, le rat et le lapin; des doses uniques ont été administrées selon deux voies ;

intrapéritonéale et orale.

Les résultats obtenus montrent qu'il y a un certain délai dans la manifestation de l'effet anticoagulant, ce qui rend compte de

l'action indirecte de ces anticoagulants sur la coagulation sanguine.

Le maximum d'activité est atteint aux alentours de la 24e h., et un retour à la normale est observé vers le 4e jour, pour les deux anticoagulants testés.

Il n'y a pas de différences essentielles entre l'activité anti­ coagulante du clocoumarol et du phenprocoumon, mais le clocoumarol semble être un anticoagulant plus puissant que le phenprocoumon

(même effet observé avec des doses inférieures).

Par ailleurs, les études de toxicité aiguë que nous avons réalisées indiquent que le clocoumarol est de 1,09 à 1,32 fois plus toxique que le phenprocoumon.

Il faut faire remarquer que nous avons étudié la réelle toxicité aiguë du clocoumarol et du phenprocoumon, indépendamment de

En effet, de fortes doses de ces anticoagulants (15 mg/kg) provoquent des hémorragies entraînant la mort des animaux à partir du 3e jour.

En thérapeutique, l'administration d'antivitamines K peut, dans certains cas, provoquer des hémorragies. Il est alors nécessaire d'administrer la vitamine K pour contrecarrer cette

hypoprothrombinémie.

Nous nous sommes assurés que l'effet anticoagulant du clocoumarol et du phenprocoumon était réversible par l'administration de

vitamine K.

Parmi les différentes préparations disponibles, nous avons choisi la vitamine synthétique (Konakion ® ) car, d'après les données trouvées dans la littérature, c'est la préparation la plus

couramment utilisée.

Les études réalisées chez le rat montrent qu'une seule administra­ tion de vitamine (à la dose utilisée en thérapeutique) suffit pour antagoniser pendant 12 h au moins l'effet anticoagulant maximal du clocoumarol et du phenprocoumon. De plus, des

administrations répétées de vitamine peuvent inhiber tout effet anticoagulant.

Nous avons étudié la cinétique de l'effet anticoagulant du clocoumarol et de la warfarine chez le rat.

L'effet anticoagulant peut être exprimé en fonction de la vitesse de synthèse et de dégradation des facteurs de coagulation, selon la méthode de Nagashima (1969).

L'analyse mathématique de résultats indique que la vitesse de

disparition de l'effet anticoagulant du clocoumarol est de 3,99 %/h, et celle de la warfarine de 2,97 %/h (PX 0,001; test t de Student). Il en résulte que, à dose égale, la durée de l'effet anticoagulant de la warfarine est plus longue.

160

Cette constatation peut être mise en relation avec le métabolisme de ces substances. En effet, une substance agit d’autant plus

longtemps qu'elle est moins bien métabolisée,si du moins ses métabolites sont inactifs.

Avant de tirer une conclusion, il restait à étudier un paramètre qui joue un rôle important dans le métabolisme, à savoir la

liaison à la serum-albumine.

Etant donné que la plupart des médicaments se lient principalement à la serum-alb\imine et que seule la fraction libre est pharmacolo­ giquement active et métabolisée, il était important d'étudier le comportement du clocoumarol vis-à-vis de l'albumine.

Dans ce but, des expériences d'équilibre de dialyse ont été réali­ sées et analysées par la méthode de Schatchard (1949).

Les résultats obtenus indiquent que le clocoumarol se lie à au moins deux classes de sites distintts sur 1 'albiiriine bovine. Les constantes d'affinité et les énergies de liaison sont du même ordre de grandeur que celles décrites pour le phenprocoumon et la

warfarine.

Nous pensons que caractériser la liaison d'une substance à l'albu­ mine par ces paramètres est plus juste que par un "pourcentage de

liaison", car elle dépend de plusieurs facteurs dont la température, le pH et la force ionique.

Cependant, pour rester cohérents avec les informations généralement données quant à la liaison du phenprocoumon et de la warfarine, nous pouvons dire que, dans les conditions expérimentales étudiées, le clocoumarol est également fortement lié à l'albumine (> 90 %) .

Nous pouvons donc conclure qu'il y a une similitude évidente entre le clocoumarol et le phenprocoumon, aussi bien au point de vue de leur biotransformation que de leur activité anticoagulante.

Par contre, la warfarine se comporte différemment.

Nous savons que les dérivés de 1'hydroxy-4-coumarine sont métabolisés principalement en dérivés hydroxylés en différentes positions du

noyau coumarinique par les "mixed functions oxidases" des microsomes hépatiques.

Nous pouvons donc conclure qu'il y a une similitude évidente entre le clocoumarol et le phenprocoumon, aussi bien au point de vue de leur biotransformation que de leur activité anticoagulante. Par contre, la warfarine se coraporte différemment.

Nous savons que les dérivés de 1'hydroxy-4-coumarine sont

métabolisés principalement en dérivés hydroxylés en différentes positions du noyau coumarinique par les "mixed functions oxidases" des microsomes hépatiques.

Cela fut démontré pour le phenprocoumon et la v;arfarine, et tout porte à croire que c'est également une voie de métabolisation pour le clocoumarol.

D'autre part, nous pouvons considérer que le clocoumarol, le phenprocoumon et la v/arfarine sont tous trois fortement liés à

l'albumine, et que ce paramètre n'intervient pas dans les répercussions possibles sur le métabolisme.

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