METABOLISME DES ANTIVITAMINES K

Les premières études faites par Link ont suggéré que les anti­ coagulants coumariniques sont métabolisés en acide salicylique

(Link, 1945; Link et al., 1943). La molécule subirait une ou­ verture du cycle coumarinique, suivie d'une décarboxylation. Une dizaine d'années plus tard, le métabolisme de la coumarine a été étudié chez le lapin et aucune ouverture du cycle ni la présence d'acide salicylique n'ont pu être mis en évidence.

(Mead et al., 1958; Furuya, 1958).

Par contre, des études réalisées avec la coumarine marquée ont suggéré que chez le lapin et le rat, la coumarine est surtout métabolisée via une ouverture du cycle (Kaighen et Williams,

1961) .

Des études sur le rôle de la microflore intestinale sur le métabolisme de la coumarine chez le rat, ont montré également qu'elle pouvait subir une ouverture du cycle (Scheline, 1968). Depuis lors, de nombreux travaux concernant le métabolisme des anticoagulants coumariniques ont été réalisés; aucun ne mention­ ne cette voie de biotransformation.

Parmi les différents anticoagulants coumariniques, la warfarine a été la plus étudiée tant au point de vue de sa pharmacocinétique que du point de vue de son métabolisme chez l'homme et chez

1

'animal.

La warfarine existe sous deux formes isomères R (+) et S (-) . La forme utilisée en thérapeutique est un mélange racémique en quantités égales de chaque isomère.

Les isomères diffèrent par l'intensité de leur action anticoa­ gulante; chez l'homme et chez le rat, la warfarine S(-) est cinq fois plus puissante que la warfarine R(+) (O'Reilly, 1971;

Eble et al., 1966; Brekenridge et Orme, 1972; Hewick, 1972; Hewick et al., 1973).

Deux voies majeures de métabolisation sont connues jusqu'à pré­ sent pour la warfarine : l'oxydation par le système des "mixed function oxîdases" des microsomes hépatiques (Ikeda Conney et Burns, 1968) , qui aboutit à la formation de métabolites hydroxylés

39

en différentes positions sur le noyau coumarinique et la réduc­ tion par une réductase non inicrosomiale, NADPH dépendante (More- land et al., 1975), qui aboutit à la formation de deux alcools

(R,S) et (S,S).

Les études réalisées avec chaque isomère R {+) et S (-) de la warfarine montrent qu'ils sont métabolisés différemment.

Chez l'homme, la warfarine R (+) est métabolisée principalement en alcool (R,S), tandis que son isomère S (-) est métabolisé en hydroxy-7-warfarine et alcool (S,S); les deux isomères donnent lieu à la formation, en quantités égales, d'hydroxy-

6

-warfarine

(Lewis et al., 1974; Chan et al., 1972).

Des expériences réalisées "in vitro" avec des microsomes de foie de rat montrent que la warfarine R (+) est métabolisée princi­ palement en hydroxy-7-warfarine et la warfarine S (-) en alcool

(S,S); chaque isomère est métabolisé dans les mêmes proportions en hydroxy-

6

-warfarine et hydroxy-4'-warfarine. (Pohl et al., 1976) .

Des expériences réalisées "in vivo" chez le rat et le cobaye mettent en évidence que la warfarine (mélange racémique) est métabolisée en quatre composés hydroxylés en position 6,7 et

8

du noyau coumarinique, ainsi qu'en position 4' du cycle benzé- nique. (Deckert, 1973; Barker et al., 1970; Townsend et al., 1975).

Une étude récente du métabolisme de 1'acénocoumarine chez l'homme (Dieterle et al., 1977) montre qu'elle est également métabolisée par deux voies majeures différentes : la réduction du groupe aromatique azoté (formation d'un amino-et d'un acéta- mino-métabolite) ainsi que celle de la fonction cétone (forma­ tion de deux alcools diastéréoisomères), et l'oxydation du noyau coumarinique (formation d'hydroxy

-6

et 7-acénocoumarine).

Le phenprocoumon est un mélange racémique de deux isomères R (+) et S (-).

L'isomère S (-) a une activité anticoagulante beaucoup plus forte que le R (+) chez le rat (Schmidt et Jahnchen, 1977) et

chez l'homme (Jâhnchen et al. 1976).

Le phenprocoumon est biotransformé chez le rat en composés

hydroxylés en positions

6

, 7 et

8

et 4' (Haddock et Trager, 1975).

Beaucoup moins d'études ont été réalisées avec les anticoagulants à double cycle coumarinique.

L'éthylbiscoumacétate est métabolisé chez l'homme, principale­ ment en dérivé hydroxylé en position 7 (Burns et al., 1953a)

cependant, chez le lapin, une dé-estérification est observée. (Burns et al., 1953b).

■ N

Des études réalisées sur la bile de rat ont montré la présence de glucuronides de la bishydroxycoumarine ainsi que de l'hydroxy- 7-bishydroxycoumarine. (Conway et al., 1975).

En conclusion, la voie métabolique majeure pour les anticoagu­ lants de type coumarinique implique l'oxydation du noyau couma­ rinique en différentes positions

(6

et 7 chez l'homme).

C'est un phénomène de détoxification puisque ces métabolites sont plus polaires et de cette façon, beaucoup plus rapidement excrétés; de plus, ils sont beaucoup moins actifs ou totalement inactifs.

Des études pharmacologiques réalisées avec les différents métaboli­ tes hydroxylés de la warfarine n'ont pas permis de démontrer une quelconque activité. (Lewis et Trager, 1971 ; Ôeckert, 1973; Lewis et al., 1973).

De même, il fut démontré que 1'hydroxy-7-acénocoumarine était inactive.(Dieterle et al., 1977).

Le seul métabolite hydroxylé actif de la warfarine fut isolé chez le rat; il s'agit de 1'hydroxy-4 '-warfarine dont l'activité est approximativement quatre fois moindre que celle de la war­ farine. (Barker et al., 1970).

Quant aux métabolites alcool (R,S) et (S,S) de la warfarine, ils ont une certaine activité anticoagulante; cependant, ils sont présents en quantités trop petites pour avoir une influence sur l'action pharmacologique de la warfarine.(Lewis et al., 1973).

Chapitre 2

-^2

Nous nous sommes proposé d'étudier la biotransformation de différents dérivés de 1'hydroxy-4-coumarine, le phenprocoumon, la warfarine et le clocoumarol, dérivé original de synthèse. Dans ce but, nous nous sommes délibérément écartés de la voie de métabolisation généralement admise pour ce type de composés, à savoir

1

'hydroxylation.

Dans l'espoir de mettre en évidence une voie de biotransforma­ tion impliquant une ouverture du cycle coumarinique, nous avons développé de nouvelles techniques analytiques ainsi qu'une mé­ thodologie propre à l'extraction de milieux biologiques.

L'étude de la métabolisation de ces dérivés coumariniques a été réalisée "in vitro" en présence de microsomes de foie de rat.

Nous avons étudié l'aspect qualitatif de ce métabolisme et tenté de localiser et de définir le système enzymatique impliqué dans cette voie de métabolisation.

La structure du métabolite principal que nous avons isolé a été identifiée par les méthodes analytiques courantes ainsi que par préparation chimique de ce composé.

Nous nous sommes particulièrement intéressés â l'aspedt; quanti,tatif du métabolisme du clocoumarol et avons déterminé certains para­

mètres cinétiques de sa métabolisation.

De plus, nous avons mis en évidence le phénomène d'induction enzy­ matique provoqué par le phénobarbital.

Nous avons abordé l'étude de la biotransformation de ces dérivés "in vivo" chez le rat.

Dans ce but, nous avons développé une nouvelle méthodologie

dans ce domaine et réalisé une étude quantitative de l'excrétion urinaire de ces anticoagulants et de leur.s métabolites.

43

Nous avons tenté d'établir une relation entre la biotransforma­ tion de ces anticoagulants et leur activité pharmacologique.

f

I

Les anticoagulants dérivés de 1'hydroxy-4-coumarine sont connus depuis 1940 et utilisés en thérapeutique pour traiter les mala­ dies thromboemboliques. Cependant, nous avons été frappé par le manque d'informations dans la littérature concernctnt certains aspects de leur pharmacologie et par la variété des conditions expérimentales utilisées pour les étudier.

Nous avons entrepris l'étude comparative du clocoumarol et du phenprocoumon, dont les structures sont proches, et déterminé leur toxicité aiguë réelle.

Nous avons testé l'activité anticoagulante de ces deux composés chez le rat et le lapin, après administration orale et intrapérito­ néale ainsi que la réversibilité de leur action par la vitamine

synthétique.

De plus, nous avons exprimé l'activité et la durée d'action du clocoumarol et de la warfarine par une relation mathématique per­ mettant une analyse quantitative.

Pour terminer, nous avons tenté d'établir une corrélation entre la structure, l'activité et la biotransformation des dérivés que nous avons étudiés.

Chapitre 3

45

3.1 INTRODUCTION.

!

Les enzymes qui catalisent le métabolisme de nombreuses substances étrangères sont localisés principalement dans le foie, bien qu'une certaine activité métabolique existe également dans d'autres tissus comme le rein, l'intestin et dans une moindre mesure les poumons, les surrénales et le sang.

Dans les cellules hépatiques, les enzymes responsables des biotransformations sont associés au réticulum endoplasmique. Ce dernier se présente sous forme d'un réseau de tubules de lipoprotéines qui s'étend sur le cytoplasme de la plupart des cellules eucaryotes.

Chez de nombreux types de cellules, incluant les hépatocy­ tes, le réticulum endoplasmique est le lieu de fixation de la plus grande partie des ribosomes du cytoplasme. On distingue deux types de réticulum endoplasmiques : le réticulum endo­ plasmique rugueux et le réticulum endoplasmique lisse, libre de tout ribosome.

Etant donné la concentration de l'activité enzymatique au niveau du réticulum endoplasmique hépatique, des techniques ont été mises au point pour l'isoler dans le but d'étudier

"in vitro" le métabolisme.

Suite à l'homogénéisation du foie, le réticulum endoplasmique est rompu et donne lieu à de petites vésicules; elles peuvent être séparées de l'homogénat par centrifugation à grande vi­ tesse et forment de cette façon la fraction microsomiale.

La métabolisation de nombreuses substances peut être étudiée "in vitro" en présence de microsomes et de cofacteurs appro­ priés, notamment la nicotinamide-adénine dinucléotide phos­ phate sous sa forme réduite. (Brodie et al., 1958; Conney et Burns 1962).

Une étude des relations entre le réticulum endoplasmique et les microsomes dans différents types de cellules a été faite par Claude (1969).

A6

Il en résulte que :

1) Les microsomes proviennent de la fragmentation des réti­ culum endoplasmiques lisse et rugueux ainsi que d'autres struc­ tures qui y sont associées; ils constituent dès lors une frac­ tion très hétérogène et contiennent des fragments de membrane de taille et de nature différentes.

2) Le rendement et la composition de "microsomes" à partir d'un poids de foie déteminé dépend des techniques d'homogénéi­ sation, de centrifugation, de lavage,etc., ainsi que de l'état fonctionnel du réticulum endoplasmique des cellules hépatiques avant homogénéisation (cas de l'hyper ou d'hypoplasie).

3) Les réticulum endoplasmiques lisse et rugueux sont souvent localisés dans une cellule hépatique intacte, à différents en­ droits du cytoplasme; par contre, dans la fraction microso- miale obtenue par centrifugation, les microsomes à surface

lisse et rugueuse se trouvent sous forme vésiculaire et en rela­ tion inhabituelle.

En conclusion, il faut noter que l'activité enzymatique des microsomes peut être quelque peu différente de celle observée dans une cellule intacte.

48

fugé à 140000 g. pendant 1 heure (ultra centrifugeuse Beckman; modèle L2-65b), dans le but de faire sédimenter les microsomes. La "fraction soluble hépatique" est le surnageant de cette centrifugation. Le culot de microsomes est suspendu dans du tcimpon isotonique Tris/KCl dans un volume équivalent à 1 g. de foie pour

2

ml de suspension.

La préparation de "microsomes lavés" est obtenue en centrifugeant le culot de microsomes remis en suspension, à 140000 g. pendant

1

heure.

Les fractions nucléaires et mitochondriales sont préparées en centrifugeant les homogénats de foie à des vitesses appropriées

49

Tableau é.

animal décapité prélèvement du foie homogénéisation

centrifugation à

1000

g. pendant

20

min.

culot suspendu = fraction nucléaire

surnageant décanté

surnageant centrifugé à

10000

g. pendant

20

min.

culot suspendu = surnageant décanté

fraction mitochondriale contient les microsomes et la fraction soluble surnageant centrifugé à 140000 g. pendant

60 min. culot suspendu =

fraction microsomiale

surnageant décanté = fraction soluble

Centrifugé à 140000g. pendant 60 min. culot suspendu =

50

3.3.2 Dosage des protéines microsomiales.

Le dosage des protéines contenues dans les suspensions micro­ somiales est réalisé d'après la méthode de Lowry et al. (1951), modifiée par Miller (1959).

La suspension de microsomes est diluée 100, 200 et 400 fois avec de l'eau distillée.

Avant chaque détermination, une solution composée de 10 ml d'hy­ droxyde de sodium (0,5N), contenant 10% de carbonate de sodium et

0

,

1

% de tartrate de sodium est mélangée à

1

ml de sulfate de cuivre (0,5%) et préparée le jour du dosage.

On mélange 1 ml de cette solution â 1 ml de solution protéinique à tester et on laisse reposer ce mélange pendant

10

minutes à température ambiante.

Ensuite, on ajoute rapidement 3 ml de réactif de Folin Ciocal- teau (Merck) dilué 10 fois. Ce mélange est chauffé au bain-marie à 60°C pendant 10 min. Les tubes sont plongés dans l'eau froi­ de et ensuite, l'absorption de chaque échantillon est lue à 730 nm (spectrophotomètre Zeiss DMR 21); un blanc est réalisé en remplaçant la solution protéinique par de l'eau distillée. Des solutions standard contenant 25, 50, 75, 100 et 125 yg/ml de sérum albumine de boeuf (fatty acid poor; B grade; Calbio- chem) sont préparées en même temps.

La concentration en protéines est calculée à l'aide de la for­ mule suivante ; protéines yg/ml = aP aP aP aP aP d= 0,025

—+

0,050 —+ 0,075 ~+ 0,100 ~+ 0,125 ~

£>1 ^2 ^3 ^4

où aP, aSj^, aS

2

--. sont respectivement les absorptions de la solution à tester et des solutions standard de protéines et d est le facteur de dilution de la solution de protéines microso­ miales .

51

3.3.3 Milieu d'incubation standard.

Les incubations sont réalisées à 37°C dans des Erlenmeyer de 25 ml. ouverts, subissant une agitation constante pendant 1/2 h. Les réactifs sont ajoutés à 0°C dans l’ordre suivant j

- 2,5 ml d'une solution de cofacteurs (système générateur de NADPH) dans du tampon phosphate 0,1M à pH ; 7,4

-

1

ml. d'une suspension de microsomes.

- 0,5 ml. d'une solution aqueuse isotonique de substrat. La solution de cofacteurs contient du glucose-

6

-phosphate, de la glucose-

6

-phosphate déhydrogénase, de la nicotinamide- adénine dinucléotide phosphate et du chlorure de magnésium. La concentration de ces composés est adaptée pour chaque espè­ ce animale selon Colin (1974) (tableau ?)

G-

6

-P G-

6

-Pd N A D P Mg CI

2

y mole unité y mole y mole

rat 15

1 2

60

cobaye 15

1

3 60

souris 15

1 2

60

Le volume final est toujours maintenu à 4 ml.

Pour les incubations contrôles, le substrat ou les microsomes sont remplacés par un volume équivalent de tampon phosphate

(pH 7,4) .

3.3.4 Processus d'extraction.

Les incubations sont arrêtées en plongeant les récipients dans la glace.

Le contenu de chaque Erlenmeyer est transféré dans un tube bou­ ché (Kimax) contenant un volume double de chloroforme.

Les tubes sont ensuite agités mécaniquement pendant 5 minutes puis centrifugés à 6000 g. pendant 10 minutes (Christ Universal

52

Junior III ks) dans le but de casser l'émulsion.

La phase organique est prélevée et l'opération recommencée encore

2

fois.

Les phases organiques de chaque Erlenmeyer sont réunies et évaporées sous vide. ( Rotavapor Büchi; bain à 30°C).

Le résidu huileux est ensuite dissout dans l'acétone.

3.3.5 Processus d'isolement par chromatographie sur couche mince.

Les chromato plaques (20 x 20 cm) sont recouvertes de gel de silice

^^254

- Type 60 - épaisseur 0,25 mm.) et acti­

vées à 110°C pendant 15 min. avant leur utilisation. Elles sont placées dans des cuves, à température ambiante, saturées avec les phases mobiles suivantes ;

phase mobile I Benzène - acétate d'éthyle 9:1 Xv/v) " II dichloro-1,2 éthane-acétone 9:1 (v/v)

53

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