quantité injectée (jjg)
3.9 DISCUSSION ET CONCLUSION;
Métabolisme "in vitro" de quelques dérivés coumariniques.
L'étude du métabolisme "in vitro" du clocoumarol, du phenprocou- mon et de la warfarine a été réalisée à partir de l'incubation de ces anticoagulants en présence de suspensions de microsomes de foie de rat, d'un système générateur de NADPH et d'oxygène. Le système de cofacteurs utilisé est composé de glucose-6-phos- phate, de glucose-6-phosphate déhydrogénase, de nicotinamide- adénine dinucléotide phosphate (forme oxydée) et de chlorure de magnésium.
Ce sont les conditions classiques décrites dans la littérature pour étudier les biotransformations (phase I) de substances exogènes subissant des oxydations.
Etant donné que l'oxydation est la voie majeure de métabolisation des anticoagulants coumariniques, l'étude du métabolisme "in
vitro" de ces anticoagulants a été réalisée dans ces mêmes condi tions dans le but de rechercher des métabolites qui seraient, contrairement à ce qui a été mis en évidence jusqu'ici,, moins polaires que les composés de départ.
Des méthodes analytiques nouvelles ont été mises au point pour détecter et doser les anticoagulants ainsi que leurs métabolites; notamment, des techniques de chromatographie liquide et sur couche mince haute performance ont été développées.
Les métabolites ont été isolés et purifiés par chromatographie sur couche mince après que les différents anticoagulants aient été incubés avec les microsomes de foie de rat.
L'identification de leur structure a été réalisée par spectrométrie d'absorption UV et IR, par spectrométrie de masse, par spectromé trie de RMN protonique et confirmés par synthèse chimique.
L'étude du métabolisme du clocoumarol par des microsomes de foie de différentes espèces animales (rat, souris, cobaye) a permis de détecter par chromatographie sur couche mince, trois métabolites de polarité plus faible que celle du clocoumarol. Un de ces métabolites (m^^) est quantitativement le plus impor tant et se caractérise par une forte fluorescence bleue sous UV à 350 nm. Les résultats obtenus mettent en évidence que le clocoumarol est métabolisé en métabolite m^^ par le système des "mixed function oxydase" des microsomes de foie de rat. En effet, la formation du métabolite m^ est dépendante de la présence d'oxygène, d'un système générateur de NADPH et de la fraction microsomiale, et est inhibée par le monoxyde de car bone .
De plus, le prétraitement des animaux par le phénobarbital
sodique provoque un phénomène d'induction enzymatique qui augmen te quantitativement la formation de métabolite m^^.
Le métabolite m^^ a été isolé et sa structure s'est révélée être tout à fait originale, (fig.'lg')
La formation du métabolite m^ peut s'expliquer par le fait qu'au pH physiologique, le clocoumarol se trouve sous forme d'hydroxy-2- chromone, tautomère de'1'hydroxy-4-c6uinarine (Vanhaelen et al. 1976) (fig.55)
Sous sa forme hydroxy-2-chromone, le clocoumarol est ensuite métabolisé par les "mixed functions oxydases" des microsomes hépatiques qui provoquent une ouverture du noyau coumarinique, une décarboxylation suivie d'une oxydation du carbone en posi
tion 3 de 1'hydroxycoumarine substituée.
Des études comparatives du métabolisme "in vitro" par les micro somes de foie de rat, ont été réalisées avec d'autres anticoagu lants coumariniques : le phenprocoumon et la warfarine.
Ces derniers sont utilisés depuis longtemps en thérapeutique et leur métabolisme a été beaucoup étudié.
Dans les conditions expérimentales décrites plus haut, les seuls métabolites connus jusqu'à présent pour ces anticoagulants sont des dérivés hydroxylés en différentes positions du neyau couma rinique .
101
’Fig. ;
Tautomérie entre la forme hydroxy-l*-coumarine hydroxy-2-chromone du clocoumarol
102
Des métabolites moins polaires ont été recherchés après in cubation du phenprocoumon avec des microsomes de foie de rat. La structure chimique du phenprocoumon, proche de celle du clocoumarol, laissait supposer qu'il pouvait être métabolisé selon la même voie que le clocoumarol.
Nos résultats confirment cette hypothèse, et montrent qu'il y a parallélisme évident entre la métabolisation "in vitro" du clocoumarol et celle du phenprocoumon.
Le métabolite m^^ du phenprocoumon a été isolé et identifié; sa structure est en tout point comparable à celle du métabolite m^ du clocoumarol. (fig.2{>^i
Par contre, la structure chimique de la warfarine suggère que cette molécule est stabilisée sous sa forme hydroxy-4-coumarine, ou hydroxy-2-chromone, grâce à la fonction hémi acétal liant le carbonyle en position 7 et la fonction hydroxyle en position 4 ou 2, suivant qu'elle est sous l'une ou l'autre forme tautoméri- que. (fig.
il )
Dès lors, il était hautement probable que la formation d'un méta bolite de type m^^, tel que celui observé pour le clocoumarol et le phenprocoumon, était une voie de métabolisation mineure pour la warfarine.
Les résultats obtenus par chromatographie liquide et sur couche mince haute performance et par chromatographie gazeuse, confir ment cette hypothèse.
L'ouverture du cycle coumarinique avait déjà été observée
par Link (1943-1944), qui la considérait comme une nouvelle voie de métabolisation des hydroxy-4-coumarines, menant à la forma tion de dérivés salicylés.
De même, certaines études réalisées avec la coumarine ont pu mettre en évidence ce même phénomène (voir chap. 1.5.6)
Cependant, pour aucun anticoagulant coumarinique connu, un métabolite de type m^^ n'a été décrit jusqu'à présent.
La plupart des méthodes utilisées pour extraire les anticoagu lants et leurs métabolites à partir de milieux biologiques, mettent en oeuvre des passages en milieu alcalin.
103
r'
ml (C)
CIS-ÉNOL
Fig.it :
Structure proposée pour le métabolite du phenprocoumon : m^ ( B ) trans-énol et ( C) cis-énol :
104
en milieu basique, caractérisée par l'apparition d'une colo ration jaune.
Dès lors, il est certain que la détection de ce type de composé a pu échapper aux investigations usuelles.
Les résultats obtenus "in vitro" avec le clocoumarol et le
phenprocoumon, mettent en évidence une nouvelle voie de métabo- lisation des anticoagulants coumariniques ayant une structure proche.
Pour le clocoumarol, cette voie de métabolisation a été parti culièrement étudiée.
Les conditions d ' incubation optimales pour la formation du métabolite m^^ ont été déterminées.
Les résultats obtenus indiquent que cette voie de métabolisa tion est importante puisque 10 à 15% de la quantité de clocou marol initial, sont métabolisés en métabolite m^.
105
Fig. 3>? :
Stabilisation de la warfarine sous la forme
Chapitre 4
107
4.1 INTRODUCTION.
La pharmacocinétique des anticoagulants coumariniques s'est développée depuis 1960, mais la plupart des études sur le méta bolisme étaient limitées à la détermination quantitative de la
substance inchangée. De plus, il existe une controverse (Lewis et al., 1970; Welling et al., 1970) quant à la validité de
certains essais; en effet, les méthodes utilisées il y a une dizaine d'années impliquaient une extraction du milieu biolo gique par des solvants et une détermination quantitative directe par spectrophotométrie UV sans séparation préalable.
Il est possible que ces conditions ne sont pas suffisamment spé cifiques et que notamment des métabolites interfèrent avec le dosage.
Depuis lors, les techniques de chromatographie liquide haute performance et de chromatographie en phase gazeuse ont été utilisées et se sont révélées très sensibles pour doser la warfarine (Fasco et al., 1977; Odam et Townsend 1976) et le phenprocoumon (Hen i et Glogner, 1976) sans toutefois être com plètement à l'abri de certains artefacts (Beckett et Mihailova,
1974) .
Toutefois, les méthodes décrites dans la littérature ne permet tent pas l'approche de l'étude du métabolisme du clocoumarol chez le rat.
Ceci tient peut-être du fait que les études récentes sont faites chez l'homme et utilisent des molécules marquées.
Ne disposant pas de clocoumarol marqué, nous avons développé une méthode qui, tout en utilisant les techniques de chromatogra phie liquide haute performance et de chromatographie en phase gazeuse, est originale et permet de doser le clocoumarol, le phen procoumon, la warfarine ainsi que certains de leurs métabolites moins polaires dans l'urine.
Cela nous a permis de vérifier si le métabolite original m^^ observé "in vitro" avec le clocoumarol et le phenprocoumon est détectable "in vivo" dans l'urine.
108
4.2 METHODE.
4.2.1 Animaux et échantillons d'urine.
Des rats Wistar albinos femelles, d'un poids moyen de 200 g . sont placés dans des cages individuelles en plexiglass; ces
cages sont conçues de façon à recueillir séparément les matières fécales et l'urine, en limitant au maximum leur contamination respective.
Les urines de chaque rat sont collectées pendant 24 heures avant l'injection de l'anticoagulant (i.v. 10 mg/kg), puis toutes les 24 heures après l'injection et ce pendant trois jours. Les urines sont conservées à -25°C.
Pendant les expériences, les animaux ont librement accès à l'eau et à la nourriture.
109
4.2.2 Appareillage. (Çi^ )
Description ;
1. Pompe (FMI; modèle RP-SYX) permettant un réglage micro métrique du débit et équipée d'un régulateur de pulsation
(puise dampener FMI)
2. Vanne d'injection qui permet de connecter et de déconnecter la boucle (3) à la colonne.
3. Boucle (teflon) (volume total de 15 ml)
4. Colonne en verre (diamètre intérieur 9 mm) équipée d'un piston comprimant le polymère retenu à l'autre extrémité par une pastille de verre poreux (G2) (7) .
5. Tenax GcP' : 3 gr; 80/60 mesh, ht = 19,5 cm. 6. Tuyaux en teflon (diamètre intérieur 1 mm) .
4.2.3 Colonne de Tenax GC
Le Tenax est un nouveau polymère poreux dérivé de l'oxyde-2,6- diphényl-p-phénylène (AKZO Research Laboratories) .
Ce polymère, stable à haute température (jusqu'à 350°C), fut
utilisé initialement comme phase dans des colonnes de chromatogra phie en phase gazeuse (Novotny et al., 1974; Van Rijk, 1970).
Il fut également utilisé avec succès pour préconcentrer des composés organiques volatils présents dans l'urine (Zlatkis et al., 1973a, 1973b).
Les caractéristiques du Tenax ont été étudiées (Sakodinskii et al., 1974) et ont conduit à des applications récentes telles que l'analyse des polluants atmosphériques (Micure et al. 1973;
Versino et al., 1974), ainsi que des composés volatils du vin (Bertucioli et al., 1975).
Récemment, des quantités infimes de phénols (concentration de l'ordre du ppm) en solution dans l'eau, ont pu être détectées par chromatographie en phase gazeuse (Bartle et Elstub, 1977) en utilisant des colonnes de Tenax identiques à celles qui
furent utilisées dans l'équipement de satellites (Novotny et al., 1975) .
L'intérêt majeur du Tenax réside dans sa faible affinité pour l'eau qui est éluée sans adsorption ni interférence avec l'ad- sorption de composés liposolubles (Janâk et al., 1974).
Cette propriété fut utilisée pour extraire à l'échelle micro analytique des polluants organiques, comme les pesticides pré sents dans l'eau (Léoni et al., 1975, 1976).
Nous avons exploité le caractère hydrophobe du Tenax pour fixer les anticoagulants coumariniques et leurs métabolites présents dans l'urine.
C'est la première fois que le Tenax est utilisé dans le but de détecter des médicaments (non volatils) dans l'urine.
111
4.2.4 Conditions expérimentales.
1) La colonne de Tenax est conditionnée par 100 ml d'eau bi-distillée; un débit constant de 2ml/minute est maintenu par une pompe.
2) Les échantillons d'urine sont amenés à un volume de
15,5 ml (eau distillée) et à un pH de 4,0 (acide acétique); à ce pH, les anticoagulants étudiés ne se présentent plus que sous leur forme hydroxy-4-coumarine.
La boucle calibrée contenant l'échantillon est mise en cir cuit sur la colonne par l'intermédiaire de la vanne.
3) L'échantillon est distribué sur la colonne (2ml/min.) qui est ensuite lavée par de l'eau bidistillée (voliame final recueil li = 50 ml) pour éliminer toutes les substances solubles dans l'eau et non fixées par le Tenax.
4) La boucle est mise hors circuit.
5) La désorption des produits fixés par le polymère se fait par l'éthanol (bidistillé; 50 ml, 2ml/min.)
6) La phase éthanolique (contenant un certain pourcentage d'eau) est recueillie et évaporée sous vide (30°C); la phase aqueuse persistante est acidifiée (pH 2,0; HCl concentré) et extraite
par 3 X 10 ml de chloroforme.
Cette phase organique est évaporée complètement sous vide (30°C). L'échantillon est prêt pour être analysé par chro matographie liquide haute performance et par chromatographie en phase gazeuze.
La colonne est reconditionnée par de l'eau bidistillée.
Métabolisme "in vivo" du clocoumarol, du phenprocoumon et de la warfarine.
La détection du métabolite m^^ du clocoxxmarol, du phenprocoiamon et de la warfarine dans les urines de rat est en cours d'ex périence.
Les résultats préliminaires que nous avons obtenus nous permet tent de dire que le métabolite de type m^^ est retrouvé suite
à l'administration intraveineuse de clocoiamarol et de phenprocou- coximon.
Le passage de l'urine sur Tenax (cf conditions expérimentales chap. 4.2.4), permet une détection nettement meilleure de ce métabolite, par rapport à l'extraction directe de l'urine, qui est généralement utilisée.
Chapitre 5
5.1 INTRODUCTION.
Les essais biologiques des médicaments sont fondés sur l'ap préciation des résultats de l'expérimentation pratiquée sur l'homme et sur l'animal.
Les essais cliniques ont de tout temps été utilisés; ils ont même constitué, jusqu'au siècle dernier, à peu près la seule
justification des divers traitements médicamenteux.
De nos jours, l'étude clinique des médicaments continue à s'imposer pour toutes les substances nouvellement préconisées et constitue la dernière épreuve précédant leur emploi en thé rapeutique .
Actuellement, les risques présentés par un nouveau médicament sont beaucoup moindres
I
étant donné les garanties apportées parles études préalables faites chez l'animal de laboratoire.
Cependant, l'action des médicaments chez l'homme peut être très différente de celle que l'on observe chez l'animal et cette constatation n'a rien qui puisse nous étonner quand on consi dère les variations parfois considérables des réponses fournies par différentes espèces animales à l'effet d'un même médicament. De plus, on n'ignore pas que l'action d'un agent thérapeutique sur un organisme sain peut s'éloigner notablement de celle qui apparaît sur un sujet malade. C'est évidemment à ce dernier aspect qu'il faut attacher le plus d'intérêt pour l'utilisation finale de la substance considérée.
La pratique d'essais thérapeutiques et cliniques des médicaments suppose la connaissance aussi précise que possible, de la toxi cité du produit et son effet pharmacologique chez l'animal. Pour réaliser ces études, il était indispensable d'établir une comparaison entre le clocoumarol, substance originale et! d'autres anticoagulants pris comme référence et connus depuis longtemps. Notre choix s'est porté sur le phenprocoumon dont la structure chimique se rapproche le plus de celle du clocoumarol (fig ainsi que sur la warfarine pour laquelle de nombreuses infor mations existent dans la littérature.