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Texte intégral

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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Reuse, S. (2009). Etude de la réactivation de l'expression des provirus HIV-1 latents par la prostratine en synergie avec des inhibiteurs de

désacétylases: mécanismes moléculaires impliqués et potentiel thérapeutique (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.

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(2)

F

DGtM 00721

Université utev de Bruxelles

Faculté des Sciences

Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires (IBMM) Laboratoire de Virologie Moléculaire

Promoteur

: Pr. Carine Van Lint

Etude de la réactivation de

l’expression des provirus HIV-1 latents par la prostratine en synergie avec des

inhibiteurs de désacétylases:

mécanismes moléculaires impliqués et potentiel thérapeutique

BtBLlOTHEQUE

Thèse présentée en vue de

Composition du Jury : l’obtention du grade légal de

Docteur en sciences Pr Etienne Pays (Président)

Pr Anna-Maria Marini Sophie Reuse

Pr Bruno André

Pr Denis Lafontaine Année académique

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Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires (EBMM) Laboratoire de Virologie Moléculaire

Promoteur : Pr. Carine Van Lint

Etude de la réactivation de

l’expression des provirus HIV-1 latents par la prostratine en synergie avec des

inhibiteurs de désacétylases:

mécanismes moléculaires impliqués et potentiel thérapeutique

Composition du Jury :

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de

Docteur en sciences Pr Etienne Pays (Président)

Pr Anna-Maria Marini Pr Bruno André Pr Denis Lafontaine Pr Stéphane Emiliani

Sophie Reuse

Année académique 2009-2010

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Now this is not the end.

It is not even the beginning of the end.

But it is, perhaps, the end of the beginning.

Winston Churchill.

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REMERCIEMENTS

Ce travail de thèse marque, pour moi, la fin du commencement. Une page se tourne. Une page noircie, pleine de ratures et de corrections, tachetée d’un soupçon de stress et remplie de souvenirs, de quelques déceptions et surtout de nombreuses joies sautillantes. Je tiens à remercier toutes les personnes qui, de près ou de loin, ont participé à l’écriture de cette page :

Carine Van Lint, mon promoteur, qui, à travers ses cours, m’a communiqué sa passion de la virologie. Elle m’a ensuite accueillie dans son laboratoire. Je vous remercie pour l’intérêt porté à ce travail et pour m’avoir permis de réaliser cette thèse.

Arsène Bumy, un homme passionné et passionnant. Je vous remercie pour toutes ces discussions partagées, parfois au-delà de nos frontières.

Miriam, mon australo-belgo-italienne préférée. Nous avons partagé tellement de choses dans ce laboratoire... Merci pour ton entrain, ta Joie de vivre et ton optimisme à toute épreuve. Tu as su me redonner confiance et me remonter le moral dans toutes les situations. Ca a été un réel plaisir de travailler avec toi et ça va sûrement beaucoup me manquer ! Je te souhaite tout le bonheur du monde à l’autre bout de ce monde.

Caroline, la guérisseuse. Caroline soigne tout, des blessures physiques aux blessures du cœur, rien ne lui résiste ! Je te remercie tout simplement pour ce que tu es, pour tout ce que tu as pu faire pour moi. Tu m’as appris énormément de choses, certaines scientifiques et d’autres totalement non- scientifiques !

Valérie M, la reine des protéines. Nous avons partagé de nombreux bons moments, notamment sous le flash des photographes ! Je te remercie pour ta bonne humeur et ta sympathie.

Marylin, merci pour le millier de « petits services » que tu m’as rendu, toujours avec le sourire !

Benoît, toujours de bonne humeur. Je te remercie pour ta disponibilité et pour tes nombreux coups de mains (en aurais-je abusé parfois ?).

Allan, le maître du ChIP. Je te remercie pour ta patience, ta persévérance et pour tout ce que tu m’as appris.

Jean-Stéphane, la force tranquille. Je te remercie pour ta gentillesse, ta disponibilité et pour ton implication dans ce travail.

Laurence, la timide extraterrestre. Je te remercie pour tes encouragements et ta sympathie. Je te souhaite une très belle thèse et beaucoup de succès dans ta vie future.

Christelle, lm69 de joie de vivre. Merci pour ta bonne humeur et surtout merci d’avoir trouvé un travail dans ce laboratoire !

Vincent M, merci pour tout !

Merci également à Catherine, Gwenaëlle et Johann.

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Je n’oublie pas les anciens :

Vincent Q, qui m’a ouvert les portes de la biologie moléculaire. Merci pour tout ce que tu m’as appris.

Emmanuelle, qui pour moi restera toujours Manou, la Mac Gyver du labo. Je me souviendrai toujours de ma première visite du P3 avec toi !

Merci également à Ann, Caroline S, Claire, Dominique, Gaëlle, Nancy, Valérie P, Valérie V, Stéphane pour avoir partagé, pendant un moment, ce laboratoire avec moi.

Je tiens également à remercier tout particulièrement les personnes auxquelles je tiens le plus : Marc, mon p’tit homme. Je te remercie pour ta compréhension, ta patience et pour toute l’aide que tu m’as apportée au cours de ces quatre années. Merci d’être toujours là.

Mes parents et mon frère, qui se sont montrés encourageants et compréhensifs. Je vous remercie pour votre soutien.

Ma belle-famille, Marie-Claire, Bernard, Merina, Benoît pour leurs encouragements et pour la correction de ce manuscrit.

Et tous ceux qui auraient aimé être là.

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LISTE DES ABREVIATIONS

5-Aza-CdR: 5-aza-2’ -déoxycytidine

ADNc: ADN complémentaire

API: Activator Protein 1

AP4: Activator Protein 4

APOBEC3G: Apolipoprotein B mRNA-Editing enzyme Catalytic polypeptide-like 3G

ARA: AIDS Research Alliance

ARNm: ARN messager

ARNPII: ARN Polymérase II

ARV: AIDS-associated Retrovirus

ATF-3: Activating Transcription Factor-3

ATP: Adénosine Triphosphate

Brd4: Bromodomain protein 4

Brgl:

Brm:

Brahma-related protein 1 Brahma protein

CBF-1: C-promoter Binding Factor-1

CCR5: Chemokine CC motif Receptor 5

CD4: Cluster Désignation 4

CD8: Cluster Désignation 8

Cdk7: Cyclin-dependent kinase 7

Cdk9: Cyclin-dependent kinase 9

ChIP: Chromatin Immunoprécipitation

c-Myc:

COUP-TF:

v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog

Chicken Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor

CRF: Circulating Recombinant Form

CTD: Carboxy-Terminal Domain

CTIP-2: COUP-TF Interacting Protein 2

CXCR4: Chemokine CXC Motif Receptor 4

DAG: 1,2-diacylglycérol

DNMT: DNA Methyltransferase

DSIF: DRB-Sensitivity Inducing Factor

FDA: Food and Drug Administration

F0X03a: Forkhead Box O 3a

GFP: Green Ruorescent Protein

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GRID: Gay-Related Immune Deficiency syndrome H3K9me3: Histone H3 triméthylée sur la lysine 9 HAART: Highly Active Antirétroviral Therapy

HAT: Histone-Acétyltransférase

HDAC: Histone-Désacétylase

HDACI: Inhibiteur d’Histone-Désacétylases

HEXMl: HMBA Inducible protein 1

HIV-1: Human Immunodeficiency Virus type 1

HMGAl: High Mobiüty Group protein Al

HMT: Histone-Méthyltransférase

HPl: Heterochromatin Protein 1

HSV; Herpes Simplex Virus

HTLV: Human T-cell Leukemia Virus

IAT: Immune Activation Therapy

IkB: Inhibitor of NF-kB

IKK: IkB Kinase

IL: Interleukine

INI-1: Integrase Interactor 1

INR: Initiator élément

IRF: Interferon (inSl)-Responsive Factor

kb: kilobase

LAV: Lymphadenopathy-Associated Virus

LEDGF: Lens Epithelial Derived Growth Factor

LSF: Late SV40 Factor

LTNP: Long-Term Nonprogressor

LTR: Long Terminal Repeat

MBD: Methyl-CpG Binding Domain protein

miRNA: microRNA

M-tropic:

NaBut:

Tropisme Monocyte/Macrophage Butyrate de sodium

Nef: Négative factor

NELF: Négative Elongation Factor

NFAT: Nuclear Factor of Activated T cells

NF-kB: Nuclear Factor Kappa B

NNRTI: Non Nucléotide analogue Reverse Transcriptase Inhibitor

NRE: Négative Regulatory Elément

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nt: Nucléotide

N-TEFb: Negative-Transcription Elongation Factor b

OKT3: Orthoclone K T-cell Receptor 3 antibody

PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell

p/CAF:

PI3K:

p300/CBP-Associated Factor Phosphatidylinositol 3-Kinase

PIC: Complexe de pré-intégration

PKA: Protein Kinase A

PKC: Protein Kinase C

PMA: Phorbol 12-Myristate 13-Acétate

PPl: Protein Phosphatase 1

PTB: Polypyrimidine Tract Binding protein

P-TEFb: Positive-Transcription Elongation Factor b

R: Repeat

Rev: Régulation of virion protein

RHD: Rel Homology Domain

RRE: Rev Responsive Elément

RSV: Rous Sarcoma Virus

RT-PCR: Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

SAHA: Suberoylanilide Hydroxamic Acid

SAM: S - Adénosyl-L-Méthionine

SCID: Severe Combined Immunodeficiency Syndrome

SIDA: Syndrome d’immunodéficience Acquise

srv:

Simien Immunodeficiency Virus

SNC: Système Nerveux Central

Spl:

STAT5a:

Stimulating Protein 1

Signal Transducer and Activator of Transcription 5a

STI: Structured Treatment Intermption

Suv39HI: Suppressor of Variegation 3-9 Homolog 1

SWI/SNF: Switching/Sucrose Non Fermenting

TAD: Trans-Activation Domain

TAF: TBP-Associated Factor

TAR; Trans-Activation Response élément

Tat: Trans-activator of transcription

TBP: TATA-Binding Protein

Tip:

TK:

Tat-interactive protein Thymidine Kinase

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TNFa: Tumor Necrosis Factor a

TRM5a: Tripaitite Motif protein 5 a

TSA : Trichostatine A

T-tropic: Tropisme T-lymphoïde

U3: Unique en 3’

U5: Unique en 5’

Vif: Viral infectivity factor

VPA: Acide Valproïque

Vpr: Viral protein R

Vpu: Viral protein U

YYl: Ying Yang Protein 1

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RESUME

L’infection par HTV-1 représente un des problèmes de santé publique majeurs de notre société actuelle. Le traitement HAART (Highly Active AntiRetroviral Therapy) inhibe le cycle réplicatif viral mais ne permet pas l’éradication du HIV-l. La principale cause de cet échec thérapeutique est la persistance de réservoirs cellulaires infectés de manière latente par HTV-1, qui, lors de l’arrêt du traitement HAART, sont à l’origine d’un rebond de la charge plasmatique virale. Le défi actuel est donc de découvrir de nouvelles méthodes d’élimination des cellules réservoirs. Une des stratégies envisagées est de forcer l’expression virale dans les cellules infectées de manière latente afin d’entraîner leur destruction suite à leur détection par le système immunitaire ou suite aux effets cytopathiques viraux. Parallèlement, le traitement HAART serait maintenu afin de limiter la propagation des virions néo-synthétisés. Plusieurs éléments sont impliqués dans la répression transcriptionnelle associée à la latence post-intégrationnelle du virus HTV-1 : la nature du site d’intégration ; l’absence de facteurs cellulaires inductibles tels que NF-kB ; la structure chromatinienne du provirus et les modifications post-traductionnelles des histones ; l’absence de niveaux suffisants de la protéine trans-activatrice Tat. De plus, notre laboratoire a précédemment mis en évidence un lien entre deux de ces éléments, en démontrant, dans une lignée modèle de latence post-intégrationnelle, que la cytokine pro-inflammatoire TNFa, un activateur de la voie de signalisation NF-kB, permet une réactivation synergique de l’expression virale combinée à l’inhibiteur d’histone-désacétylases (îTDACI) TSA. Cependant, l’utilisation thérapeutique du TNFa et de la TSA est inenvisageable en raison de leurs toxicités.

Au cours de notre thèse, nous avons montré que la prostratine, un ester de phorbol non- tumorigène qui active la cascade NF-kB, combinée à des HDACIs déjà utilisés en thérapie humaine, réactive en synergie l’expression virale dans des cellules modèles de latence post-intégrationnelle (Ul, J-Lat 8.4 et 15.4). Nous avons également constaté que des cellules dont l’expression virale n’est pas réactivée par un traitement individuel (prostratine ou HDACIs) peuvent être réactivées par la combinaison prostratine-i-HDACI. Au niveau moléculaire, nous avons montré que le VPA intensifie la cascade NF-kB induite par la prostratine, et permet, combiné à cette dernière, un remodelage plus efficace du nucléosome répresseur nuc-1 et une activation synergique de la transcription. Nous avons testé les combinaisons prostratine-i-HDACls sur des cultures ex vivo de PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) provenant de patients HTV-U avirémiques et traités par la HAART. Les combinaisons prostratine-i-HDACIs réactivent l’expression virale de 25/42 cultures de PBMCs testées avec une réactivation synergique dans 17/25 cas. De plus, la combinaison prostratine-i-SAHA réactive l’expression virale de 7/9 cultures testées de lymphocytes T CD4^ HLA DR'.

Cette étude suggère que des traitements combinant deux types différents d’activateurs de l’expression du HTV-1 pourraient être utilisés comme adjuvant de la thérapie HAART afin d’accélérer la purge des réservoirs cellulaires infectés de manière latente.

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TABLE DES MATIERES

I-INTRODUCTION... 1

1.1. Syndromedimmunodeficienceacquiseetvirushtv-i : généralités...1

1.1.1. Découverte du SIDA et du virus HIV-1...1

1.1.2. Pathogénèse du virus HIV-1... 2

1.1.3. Les différents sous-types du virus HlV-1... 3

1.1.4. Structure de la particule virale du HlV-1... 3

1.1.5. Génome du virus HFV-1... 4

1.1.5.1. Les protéines de régulation...4

1.1.5.2. Les protéines accessoires... 5

1.1.6. Cycle réplicatif du virus HlV-1...5

1.2. Régulationtranscriptionnelleduvirushtv-i... 7

1.2.1. Organisation structurale et fonctionnelle du LTR5’... 7

1.2.2. La machinerie transcriptionnelle...8

1.3. La THERAPIE ANTIRETROVIRALE HAUTEMENT ACTIVE OU TRAITEMENT HAART....10

1.3.1. Généralités... 10

1.3.2. Les limites de la HAART...12

1.4. Latenceduvirushtv-i...15

1.4.1. Latence pré-intégrationnelle...15

1.4.2. Latence post-intégrationnelle...15

1.4.3. Eradication du virus HlV-1... 16

1.5. Lalatence POST-INTEGRATIONNELLE duvirushtv-iestun PHENOMENE MULTIFACTORIEL... 18

1.5.1. Le site d’intégration du virus HlV-1...19

1.5.2. La protéine virale trans-activatrice Tat...21

1.5.3. La structure chromatinienne... 21

1.5.3.1. Généralités...21

1.5.3.2. Les modifications post-traductionnelles des histones... 22

1.5.3.3. L’acétylation des histones...23

1.5.3.4. Rôle de la structure chromatinienne et des modifications épigénétiques dans la régulation transcriptionnelle du virus HTV-1...24

1.5.4. Le facteur de transcription inductible NF-kB...27

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II- BUT...31

III- RESULTATS... 32

111.1. Introduction...32

III. 1.1. Intérêt de l’utilisation des inhibiteurs de HDACs dans la thérapie anti-HIV-1 ... 33

III. 1.2. La signalisation NF-kB et la prostratine... 34

III. 1.2.1. Découverte et caractéristiques de la prostratine... 34

III. 1.2.2. Propriétés antivirales de la prostratine... 35

III. 1.2.3. Réactivation de l’expression virale parla prostratine...35

111.2. RESUME DES RESULTATS... 36

IV- DISCUSSION... 42

V- BIBLIOGRAPHIE...57

(14)

I-INTRODUCTION

(15)

I-Introduction

I-INTRODUCTION

I.l. Syndrome dMmmunodéfidence acquise et virus HIV-1 : généralités

Le virus HIV (Human Immunodeficiency Virus) est un rétrovirus complexe faisant partie du genre des lentivirus. Il est l’agent responsable du Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise (SIDA), caractérisé par une importante diminution du nombre de lymphocytes T €04"^ entraînant une déficience du système immunitaire et par conséquent une susceptibilité accrue aux infections opportunistes. Deux types de virus HIV existent, HIV-1 cause principale du SIDA à travers le monde, et HIV-2, moins agressif et présent surtout dans l’ouest de l’Afrique [1].

I.l.l. Découverte du SIDA et du virus HIV-1

Le syndrome d’immunodéficience acquise ou SIDA est, au moment de son apparition à San Francisco, défini comme le « Gay-Related Immune Deficiency syndrome » (GRID) [2], suite au diagnostic, chez 5 jeunes hommes homosexuels, d’infections très rares telles que la pneumonie à Pneumocystis carinii [3]. En 1981, il est renommé SIDA et un journal de Los Angeles publie une description des 7 symptômes mortels y étant associés. De nombreuses questions se soulèvent déjà autour de la cause de ce syndrome d’immunodéficience, est-ce un nouvel agent infectieux non encore identifié ou un nouveau variant d’un agent infectieux déjà connu tel que le virus de l’hépatite B ou le cytomégalovirus ? Certains émettent même l’hypothèse que le SIDA ne soit pas causé par un agent infectieux mais par une overdose de drogues ou un stress important du système immunitaire [2]. Deux ans après la mise en évidence du SIDA, les Docteurs Luc Montagner et Françoise Barré-Sinoussi isolent, chez une personne présentant une lymphoadénopathie, un virus ayant la capacité d’infecter les PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) et causant des effets cytopathiques en 6 ou 7 jours [4].

Examiné par microscopie électronique, le virus présente les caractéristiques des lentivirus [5]. Après la description de ce Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV) par le laboratoire de Luc Montagnier, deux autres. groupes rapportent l’isolation de rétrovirus à partir de patients présentant les caractéristiques du SIDA. Les premiers décrivent un virus qu’ils appellent HTLV-III [6], croyant qu’il appartient à la famille des rétrovirus oncogènes HTLV (Human T-cell Leukemia Virus). Les seconds notent la présence d’un rétrovirus ayant les caractéristiques d’un agent cytopathique qu’ils nomment

« AIDS-associated Rétrovirus » (ARV) [7]. Il s'est avéré que ces virus étaient identiques au LAV et il a finalement été décidé au niveau international, en 1986, d'appeler ce virus HIV (Human Immunodeficiency Virus) [8]. Peu après, un autre rétrovirus humain est mis en évidence chez des patients dans l’ouest de l’Afrique présentant le SIDA [9]. Ce virus, bien que morphologiquement et biologiquement similaire au HIV, est génétiquement différent et est donc nommé HIV-2, le virus HIV

1

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Total: 33.2 (30.6 - 36.1) million

Figure I.l; Répartition mondiale des personnes infectées par HIV-1 en 2007.

Adapté du site internet UNAIDS (Joint United Nations Programme on HFV/AIDS) (http://www.unaids.org).

Temps après l’infection semaines années

Figure 1.2; Caractéristiques (nombre de lymphocytes T CD4'^ et charge virale plasmatique) de l’évolution de l’infection par HIV-1.

Adapté de http://msl.cs.uiuc.edu/~yershova/bcb495/bcbProject-3_files/image015.gif.

Copiesd

ARNHIV-1/ml deplasma

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I-Introduction

étant rebaptisé HIV-1. En 2008, l’équipe de Luc Montagnier et de Françoise Barré-Sinoussi reçoit le Prix Nobel de Médecine pour la découverte du virus HIV.

Inconnu il y a 27 ans, HIV a déjà causé la mort de 25 millions de personnes à travers le monde. De nombreux efforts ont été perpétrés afin de lutter contre la propagation et les effets mortels de ce virus si bien que les chiffres du dernier rapport sur l’épidémie mondiale du SIDA montrent que, globalement, l’épidémie se stabilise (Report on the global AIDS épidémie 2(X)8, UNAIDS). Le nombre de nouvelles infections annuelles a chuté de 10% entre 2001 et 2007. Néanmoins, en 2007, 33 millions de personnes vivant avec le SIDA sont recensées à travers le monde et le nombre de décès par an se porte à 2 millions de personnes (Fig.I.l). Le sud de l’Afrique est toujours très concerné par l’infection puisque en 2007, cette région compte 35 % des infections et 38% des décès. L’Afrique sub­

saharienne, abritant 67% des personnes vivant avec HIV, est particulièrement touchée.

1.1.2. Pathogénèse du virus HIV-1

Il existe trois modes principaux de transmission du HIV-1 ; la transmission sanguine (aiguilles, transfusion), la transmission de la mère à l’enfant (grossesse, accouchement, allaitement) et la transmission sexuelle, cette dernière représentant plus de 80% des infections [10]. L’infection de l’organisme par HIV-1 se déroule en trois phases successives : la primo-infection, la phase asymptomatique et la phase symptomatique ou SIDA (Fig.1.2).

La primo-infection prend place quelques semaines après l’infection initiale et est caractérisée par une forte réplication virale (la charge virale pouvant atteindre 10* copies d’ARN du HIV-1/ml de plasma) et par une diminution importante du nombre de lymphocytes T CD4^ [11, 12]. Dans plus ou moins 50% des cas, la primo-infection est asymptomatique [12]. Des études menées sur des modèles macaques ont montré que c’est au cours de la primo-infection que l’infection se propage aux différents sites anatomiques tels que le cerveau et les tractus génitaux [13, 14]. C’est également au cours de cette période que se crée le réservoir de lymphocytes T CD4'^ infectés de manière latente (voir section 1.4.2) [15]. L’organisme réagit à l’infection et la réponse immunitaire cellulaire commence à se mettre en place, notamment les lymphocytes T cytotoxiques CD8^, permettant le contrôle de la charge virale [16, 17].

La phase asymptomatique, ou latence clinique, se caractérise par une faible réplication virale continue et une diminution du nombre de lymphocytes T CD4^ circulants [18]. Elle peut durer de quelques semaines à plusieurs années. La charge virale atteint un plateau, marqueur prédictif de la vitesse d’évolution de la maladie [19].

Au stade SIDA, l’ensemble du système immunitaire s’écroule et la virémie plasmatique augmente fortement. Le patient est fortement immunodéprimé et tend à développer une multitude de maladies opportunistes (infections mycobactériennes, toxoplasmose, infections fongiques, lymphome non Hodgkinien) [20]. Outre les infections opportunistes, les autres grandes manifestations du SIDA

2

(18)

5’LTR

1__ ||_|--- tat -U

3’ LTR 1 Qag 1 1 vif 1 U--- rev —|__ |

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P7

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gpi20 gp4l p32 p66/p51

Protéine membranaire ceilulaire

.... Membrane ceiluiaire

.. ARN, amorce

' ARN génomique

Figure 1.3; Représentation schématique du génome et de la particule infectieuse mature du virus HIV-1.

Les protéines codées par les différents gènes et leur localisation respective sont indiquées par les pointillés. La nucléoprotéine p7 (orange) est fortement associée à TARN génomique viral (rouge).

(19)

I-Introduction

sont le développement de certains cancers et une profonde dégénérescence du système nerveux central. La progression de l’infection primaire au stade terminal du SIDA peut prendre de 1 an (fast progressors) à plus de 20 ans (long-term nonprogressors, LTNP), avec une moyenne de 10 ans [21].

Sans traitement, les personnes infectées meurent en quelques années.

1.1.3. Les différents sous-tvpes du virus HIV-1

Une transmission zoonotique du virus de l’immunodéficience simien SIVcpz du chimpanzé Pan troglodytes troglodytes à l’homme semble être à l’origine de l’infection humaine par le virus HIV-l [22]. Cette transmission entre espèces a pu prendre place dans l’ouest de l’Afrique équatoriale par exposition directe au sang de l’animal suite à un acte de chasse, d’abattage ou encore après avoir consommé de la viande crue.

Le virus du HIV-l est caractérisé par une grande diversité génétique illustrée par l’existence de différents variants du virus. Ceux-ci sont repartis en 3 groupes : le groupe M (Major), le groupe O (Outlier) et le groupe N (Non-M/Non-O) [22]. Les virus du groupe M, responsables de plus de 99%

des infections à travers le monde, sont ensuite répartis selon leur séquence génomique en 9 sous-types (A, B, C, D, F, G, H, J, K) [23]. Le sous-type C est le sous-type prédominant puisqu’il est responsable de plus de 50% des infections à travers le monde, tandis que le sous-type B est la forme la plus répandue en Europe [22, 23]. Au sein d’un sous-type, il est possible d’identifier des souches très proches les unes des autres qui sont identifiées comme étant des sous-sous-types, comme c’est le cas pour les sous-types A, C et F [1]. De plus, des virus HIV-l de sous-types différents infectant un même individu peuvent se recombiner et former une nouvelle forme recombinante circulante (CRF ou Circulating Recombinant Form). Actuellement, plus de 30 CRFs ont été recensées à travers le monde [21], les deux dominantes étant le CRF01_AE et le CRF02_AG [23].

1.1.4. Structure de la particule virale du HIV-l

Le virion (ou particule virale) HTV-l présente une stmcture icosaédrique complexe d’environ 110 nm de diamètre [24]. D est constitué d’une enveloppe externe, d’une matrice et d’une capside conique (Fig.1.3). L’enveloppe virale est composée d’une bicouche lipidique d’origine cellulaire dans laquelle est insérée la glycoprotéine transmembranaire gp41, attachée de manière non covalente à la glycoprotéine de surface gpl20. Toutes les deux sont produites à partir d’un précurseur glycoprotéique, la gpl60, codée par le gène env. Directement sous l’enveloppe, se trouve la matrice formée par la protéine pl7, Tun des produits du gène viral gag. Au centre de la particule est localisée la capside conique, constituée par la protéine p24, également produite à partir du gène gag. Au sein de cette capside, se trouvent deux molécules d’ARN génomique viral, stabilisées par la formation d’un complexe ribonucléoprotéique avec approximativement 2000 copies de la protéine de nucléocapside p7. La capside renferme également diverses protéines ayant un rôle catalytique prédominant dans le

3

(20)

1-Introduction

cycle réplicatif du virus : la protéase pl 1 responsable de la maturation des précurseurs polyprotéiques viraux, la transcriptase inverse p66/p51, et l’intégrase p32, toutes trois encodées par le gène viral pol.

La transcriptase inverse et l’intégrase interviennent respectivement lors de deux étapes précoces et caractéristiques du cycle réplicatif des rétrovirus : la transcription inverse de TARN génomique viral en ADN bicaténaire et l’intégration subséquente de cet ADN dans le génome de la cellule hôte. Les protéines accessoires Nef (négative factor), Vif (viral infectivity factor) et Vpr (viral protein R) sont également présentes dans la capside, tandis que les protéines de régulation et accessoires Tat (trans- activator of transcription), Rev (régulation of virion protein) et Vpu (viral protein U) ne le sont pas.

1.1.5. Génome du virus HIV-1

Le génome du HIV-1 est diploïde, constitué de deux molécules identiques d’ARN monocaténaire de même polarité que les ARNs messagers (ARNms) et d’une longueur approximative de 9,5 kilobases (kb) (Fig.1.3). Dans chaque particule virale, ces deux molécules d’ARN génomique sont liées l’une à l’autre de manière non covalente et présentent les modifications post- transcriptionnelles classiques des ARNms cellulaires, c’est-à-dire une structure CAP à l’extrémité 5’

et une extrémité 3’ polyadénylée. Les régions codantes de cet ARN génomique sont bordées par des extrémités non codantes : une courte répétition présente aux deux extrémités du génome et nommée R (Repeat) ainsi que les régions U5 (Unique en 5’) et U3 (Unique en 3’) aux extrémités 5’ et 3’ de l’ARN, respectivement [25].

Le génome du HIV-1 code pour les gènes de structure classiques des rétrovirus {gag, pol et env) qui encodent des polyprotéines structurales ou enzymatiques, mais aussi pour des gènes de régulation {tat et rev) et accessoires {nef, vpr, vpu et vif). Un processus complexe d’épissage alternatif et l’utilisation de plusieurs cadres ouverts de lecture lors de la traduction protéique sont utilisés pour produire l’ensemble de ces protéines à partir d’un génome de taille réduite [26].

1.1.5.1. Les protéines de régulation

La protéine Tat du HIV-1 joue un rôle très important dans la transcription des gènes viraux, notamment au niveau de l’efficacité de l’élongation de la transcription ARN polymérase Il-dépendante [25]. L’action détaillée de Tat est décrite dans la section 1.2.2.

Rev, une des premières protéines du HIV-1 produite, se lie à une séquence d’ARN de 250 nt formant une structure en tige-boucle, le RRE (Rev Responsive Elément), présente uniquement au niveau du gène env sur les ARNms non ou simplement épissés [27]. Rev participe, en association avec des protéines cellulaires, à l’export nucléaire de ces ARNms afin qu’ils soient traduits ou utilisés comme ARN génomique [28]. Cette protéine, essentielle à la réplication virale, permet la transition de la phase précoce de l’infection, durant laquelle les protéines de régulation sont exprimées, à la phase

(21)

Nef

Initialement décrit comme un élément négatif pour la réplication virale, des recherches plus approfondies révèlent que Nef stimule la réplication du HIV-1 et son infectivité [21], Nef diminue l’action des lymphocytes T CD8^ cytotoxiques à l’égard des cellules infectées tout d’abord en induisant l’apoptose de ces cellules CD8^ et également en diminuant l’expression du MHC de classe I à la surface des cellules infectées. Nef induit également une diminution de l’expression à la surface cellulaire du récepteur (CD4) et des co-récepteurs (CXCR4 et CCR5) du HIV-1. A l’opposé, Nef augmente l’expression cellulaire duDC-SIGN (CD209) à la surface des cellules dendritiques ce qui contribue à la propagation du HIV-1. La protéine Nef améliore la synthèse de l’ADN proviral lors de l’étape de la transcription inverse et crée un environnement optimal pour la réplication virale par activation cellulaire des lymphocytes T CD4^.

Vpr

Petit polypeptide qui a de nombreux effets sur l’infectivité virale [362]. Cette protéine facilite et améliore la transcrçtion inverse en diminuant le nombre de mutations. Elle induit l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2 ce qui augmente la réplication virale et induit l’apoptose. Vpr est également capable d’induire l’apoptose de cellules non infectées situées à proximité des cellules infectées. D’autre part, Vpr participe à l’importation nucléaire du complexe de pré­

intégration du HIV-1 (PIC), particulièrement dans les cellules ne se divisant pas. Vpr module également la transcription du génome viral, sans doute en recrutant p300/CBP au niveau du LTR. Vpr supprime également l’activation immune, en limitant l’action des lymphocytes T CD8^ cytotoxiques et les réponses inflammatoires de l’hôte.

Vpu

Protéine virale membranaire qui joue deux rôles dans le cycle viral : promouvoir un relargage efficace des particules virales de la surface cellulaire et induire la dégradation du CD4 [363].

L’amélioration, par Vpu, du relargage des particules virales des cellules infectées semble corrélée à la capacité de Vpu de former des pores, perméables aux ions, dans la membrane plasmique. Ce mécanisme n’est pas encore totalement élucidé.

Vif

Joue un rôle important pour le virus en déjouant un des mécanismes de défense cellulaire contre les infections virales [78, 363]. APOBEC3G (Apolipoprotein B mRNA-Editing enzyme Catalytic polypeptide-like 3G), protéine de la famille des désaminases de cytidines, est incluse dans les particules virales en l’absence de Vif, ce qui mène à la désamination des cytidines en uridines lors de la réplication suivante entraînant la production de virus non fonctionnels. Vif inhibe l’incorporation de APOBEC3Gdans les particules virales, provoque son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome. Il a aussi été suggéré que Vif diminue l’expression au niveau transcriptionnel de APOBEC3G.

Tableau 1.4; Les protéines accessoires du HIV-1.

(22)

I-Introduction

tardive de l’infection, pendant laquelle les protéines enzymatiques, de structure et accessoires sont produites et les virions assemblés.

1.1.5.2. Les protéines accessoires

Les protéines accessoires ont des effets multiples décrits dans le tableau 1.4. Parmi ceux-ci, citons la participation à certaines étapes du cycle viral, la limitation des réponses immunitaires de l’hôte de différentes manières, la propagation du virus.

1.1.6. Cycle réplicatif du virus HIV-1

Le cycle réplicatif du virus HIV-1 commence par l’interaction du virus avec une de ses cellules cibles (Fig.1.5) [26]. Dans un premier temps, la glycoprotéine virale de surface gpl20 se lie au récepteur cellulaire CD4, présent notamment à la surface des lymphocytes T et des monocytes/macrophages. Néanmoins, le virus peut infecter de nombreuses autres cellules du corps humain, telles que des cellules du cerveau, de la peau, du cœur et de nombreux autres organes [2].

Suite à cette interaction, la gpl20 change de conformation et interagit avec un récepteur aux chimiokines spécifique. Cette double reconnaissance libère le peptide de fusion N-terminal de la gp41, induisant la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire et l’internalisation de la capside dans le cytoplasme de la cellule cible [26]. L’entrée du virus nécessite donc non seulement un récepteur principal, mais également un co-récepteur. HIV-1 utilise deux co-récepteurs principaux, des récepteurs aux chimiokines, qui en plus de jouer un rôle dans l’entrée du virus dans la cellule, vont déterminer le tropisme cellulaire du virus. Le co-récepteur CXCR4 (chemokine CXC motif receptor 4) est associé au tropisme T-lymphoïde (T-tropic), induit des syncitium et est assimilé à une évolution plus rapide de la maladie [1]. Le co-récepteur CCR5 (chemokine CC motif receptor 5), quant à lui, est associé au tropisme monocyte/macrophage (M-tropic), n’induit pas de syncitium et est assimilé à une évolution plus lente du syndrome. Il existe également des virus bi-tropiques capables d’utiliser à la fois le CXCR4 et le CCR5 [1]. Etant donné que des cellules CD4‘ peuvent être infectées par HIV-1, des études suggèrent que le virus peut utiliser d’autres récepteurs que le CD4 afin de pénétrer dans les cellules, notamment les galactosylcéramides dans le cerveau par exemple [29].

Une fois internalisée dans le cytoplasme, la capside virale migre jusqu’au noyau, étape pendant laquelle s’effectue la transcription inverse de l’ARN monocaténaire en un ADN bicaténaire, comportant à ses extrémités deux Longues Répétitions Terminales (LTRs) identiques, composées des régions U3, R et U5 [26]. La transcriptase inverse est une enzyme présentant un taux d’erreur important, elle incorpore un mauvais nucléotide tous les deux à cinq milles nucléotides insérés [30].

L’introduction de mutations durant l’étape de transcription inverse est à l’origine de l’évolution du HIV-1, notamment face au système immunitaire et aux traitements antiviraux. La capside est ensuite clivée par la protéase virale. Après la rétrotranscription, l’ADN génomique bicaténaire linéaire

(23)

traduction des protéines régulatrices

____________

ARN génomique

traduction des protéines 'de structure

assemblage et encapsidation

bourgeonnement relargage et

maturation

Figure 1.5; Cycle de réplication du HIV-1.

Tout d’abord, le virus se lie au récepteur cellulaire CD4 et ensuite à un co-récepteur spécifique, ce qui provoque la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire et l’internalisation de la capside virale dans le cytoplasme. L’ARN génomique monocaténaire viral est rétrotranscrit en un ADN bicaténaire qui, suite au clivage de la capside, s’associe à des protéines virales et cellulaires pour former le complexe de pré-intégration. Ce dernier transloque l’ADN viral dans le noyau où il sera intégré à l’ADN cellulaire par l’intégrase virale. Après la transcription de l’ADN viral par TARN polymérase II, les ARNms sont traduits par les ribosomes cellulaires. Les précurseurs polypeptidiques viraux et TARN génomique viral se concentrent à la membrane cellulaire. Les particules virales immatures bourgeonnent et la protéase virale catalyse le clivage des précurseurs polypeptidiques entraînant la formation de particules virales matures et infectieuses.

Adapté de la thèse de V. Quivy (2002-ULB).

(24)

I-Introduction

s’associe à des protéines virales et cellulaires pour former le complexe de pré-intégration (PIC) qui assure la translocation de l’ADN viral dans le noyau où il est intégré à l’ADN chromosomique de la cellule hôte par l’intégrase virale. Différents facteurs cellulaires interagissent avec l’intégrase virale dont INI-1 (Integrase Interactor 1), un composant des complexes de remodelage de la chromatine dépendant de l’ATP, et LEDGF/p75 (Lens Epithelial Derived Growth Factor) [31]. Ce dernier joue plusieurs rôles puisqu’en plus d’augmenter l’affinité de l’intégrase pour l’ADN et la stabilité des tétramères de l’intégrase, il joue un rôle important dans le positionnement et l’ancrage de l’intégrase à l’ADN cible. Avant l’intégration, l’ADN viral existe sous trois formes dans le noyau : linéaire, circulaire avec 1 LTR ou circulaire avec 2 LTRs [24]. La forme intégrée du génome rétroviral, appelée provirus, restera associée de manière permanente au matériel génétique de la cellule hôte jusqu’à ce qu’elle meure. Le provirus intégré peut alors être exprimé et répliqué par la machinerie enzymatique cellulaire comme tous les gènes de l’hôte.

La transcription par l’ARN polymérase II commence au premier nucléotide de la région R du LTR5’ et se termine au dernier nucléotide de la région R du LTR3’. Donc, malgré leur séquence nucléotidique identique, les deux LTRs ont des rôles fonctionnels différents. Le LTR5’ se comporte comme un promoteur transcriptionnel et le LTR3’ comme un site de polyadénylation. Une quarantaine d’ARNms distincts ont été identifiés à ce jour dans les cellules infectées par HIV-1 [32]. Ces messagers sont tous générés à partir d’un transcrit primaire unique via un processus complexe d’épissage alternatif. Trois catégories d’ARNms existent : les ARNms génomiques, qui encodent les précurseurs protéiques Gag et Gag-Pol ; les ARNms simplement épissés, correspondant aux précurseurs de Env, Vpu, Vif et Vpr ; et les ARNms multi-épissés, encodant les protéines Tat, Rev et Nef [26]. Ces derniers sont les premiers transcrits traduits permettant ainsi à Tat d’activer la transcription virale et à Rev d’exporter du noyau vers le cytoplasme les transcrits non ou simplement épissés. Ces derniers servent soit d’ARNms viraux traduits en protéines virales structurales ou enzymatiques, soit d’ARNs génomiques encapsidés dans les nouveaux virions. L’ARNm du gène env est traduit en un polypeptide qui après avoir été glycosylé dans le réticulum endoplasmique affiche un poids de 160 Kd (gpl60). Une enzyme cellulaire clive ensuite ce polypeptide en deux sous-unités matures, les glycoprotéines d’enveloppe gpl20 et gp41. gp41 s’ancre à la membrane cellulaire tandis que la gpl20 s’expose extracellulairement par son interaction non covalente avec la gp41. Les gènes pol et gag sont codés par le même ARNm mais sont traduits en protéines suivant deux cadres de lecture différents. Les précurseurs polypeptidiques Gag et Gag-Pol interagissent avec l’ARN génomique et se concentrent à proximité de la membrane plasmique. Les particules virales immatures bourgeonnent, tandis que la protéase virale est activée et catalyse le clivage des polyprotéines Gag et Gag-Pol en protéines structurales ou enzymatiques individuelles, ce qui conduit à la formation du virion mature et donc infectieux. Cette étape de maturation s’accompagne de changements morphologiques du virion.

(25)

mRNA

mV-1 genome

ntl

U3

mRNA -R-

NRE

455

ENHANCER CORE PROMOTER distal proximal

638

leader région

ÇX) CAA__ Q

TATA box

rm A

GR

LEF-1 (ID AP-1

(NI)

789

V vi I 1 V \K 1 1 1

/ \

1 V

AP-1/ nf-ati usf Ets-1 NF-kB Spl TBPinr LSF/ AP-1 \ NF-ATI Spl

COUP YY1 (1) AP-l\

IRF

Fieure 1.6: Représentation schématique du LTR5’ du HIV-1.

Le LTR5’ du HIV-1 est divisé en trois régions (U3, R et U5) présentant de nombreux sites de liaison pour différents facteurs. La jonction entre les régions U3 et R représente le site d’initiation de la transcription. La position des nucléosomes dans le LTR5’ est également indiquée. Le nucléosome nuc-1, situé juste en aval du site d’initiation de la transcription, est spécifiquement remodelé lors de l’activation transcriptionnelle.

Adapté de [284] et de la thèse de M. Calao (2009-ULB).

(26)

I-Introduction

La plupart des cellules infectées le sont de manière productive et meurent quelques jours après l’infection. Cependant, la cellule infectée ne produit pas toujours de nouvelles particules virales, le provirus étant alors qualifié de provirus latent (voir section 1.4).

1.2. Régulation transcriptionnelle du virus HIV-1

Après intégration de l’ADN proviral dans le génome cellulaire, le provirus HfV-l est transcrit par TARN polymérase cellulaire de type II. La formation de transcrits viraux à partir du provirus intégré semble être contrôlée par de multiples facteurs à la fois cellulaires et viraux, à savoir des éléments c/j-régulateurs présents dans le LTR5’ liant des facteurs de transcription cellulaires agissant en trans, la structure de la chromatine au niveau du site d’initiation de la transcription, des protéines de régulation virales dont la protéine Tat.

1.2.1. Organisation structurale et fonctionnelle du LTR5’

Le LTR5’ est divisé en trois éléments structuraux, U3 (nt -453 à -1), R (nt -t-1 à -i-98) et U5 (nt -t-99 à -1-180) (le nt -tl représentant le site d’initiation de la transcription) et en 4 domaines fonctionnels, la région NRE (nt -454 à -104), la région enhancer (nt -105 à -79), le promoteur (nt -78 à -1) et la région leader (nt -i-l à -1-180) (Fig.1.6). Des expériences de DNAsel footprinting in vitro et de retard de migration sur gel ont permis l’identification de sites de liaison pour plusieurs facteurs de transcription cellulaires dans chacun de ces domaines fonctionnels [25].

La région NRE ou Négative Regulatory Elément contient des sites de liaison pour de nombreux facteurs cellulaires, notamment COUP-TF (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter- Transcription Factor), API (Activator Protein 1) et NFAT-1 (Nuclear Factor of Activated T cells-1).

Elle a été décrite initialement comme une région silencer mais il a été montré plus récemment que cette région était également capable d’activer l’expression virale. Son action dépendrait du type cellulaire et de l’état d’activation de la cellule.

La région enhancer est composée d’un élément distal et d’un élément proximal comportant deux sites de reconnaissance pour le facteur de transcription NF-kB (Nuclear Factor-kappaB). Les sites NF-kB de l’enhancer proximal confèrent au promoteur du HfV-1 un taux élevé de transcription en réponse à divers stimuli [33]. Le rôle de NF-kB dans la transcription du HIV-1 est détaillé dans la section 1.5.4.

Le promoteur basal, siège de l’initiation de la transcription, est composé d’une TATA-box, d’un élément initiateur (INR) et de trois sites de liaison pour le facteur de transcription ubiquiste Spl (Stimulating proteinl). De nombreux facteurs cellulaires interagissent avec cette région et semblent jouer un rôle important dans l’assemblage du complexe de pré-initiation et dans la régulation

(27)

I-Introduction

transcriptionnelle du promoteur viral. C’est le cas de Spl, capable de recruter TFIED au site d’initiation transcriptionnelle [34],

La région leader non traduite contient de nombreux sites de liaison tels que 3 sites API (I, II, et III), un site NFAT-1, un site IRF (Interferon-Responsive Factor) et des sites Spl juxtaposés [35].

Ces sites, localisés en aval du site d’initiation de la transcription, jouent des rôles importants dans la transcription et la réplication du HIV-1 [35].

Notre laboratoire a précédemment démontré que, indépendamment du site d’intégration, deux nucléosomes sont présents au niveau du LTR5’, nuc-0 et nuc-1 [36, 37]. Nuc-0 est localisé à l’extrémité 5’ de U3. Nuc-1, situé juste en aval du site d’initiation de la transcription, est spécifiquement perturbé ou remodelé suite à l’activation de la transcription virale [36], suggérant que nuc-1 joue un rôle dans la répression transcriptionnelle du HTV-1 (voir section 1.5.3.4).

1.2.2. La machinerie transcriptionnelle

La synthèse d’ARNms viraux matures et fonctionnels est un processus à plusieurs étapes qui dépend notamment de la présence et de la fonction de différentes protéines virales et cellulaires [25].

Le processus décrit ci-dessous correspond à la situation lorsque les conditions pour la transcription du virus HTV-l sont réunies.

Lors de l’initiation de la transcription, TBP (TATA-Binding Protein) reconnait la TATA box entraînant la liaison de nombreux facteurs qui y sont associés (TBP-Associated Factor (TAF)) et la formation du complexe multiprotéique TFIID. Ensuite, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH et l’ARN polymérase de type II (ARNPII) sont également recrutés et forment le complexe de pré-initiation. La plus grande sous-unité de l’ARNPII contient un domaine carboxy-terminal (CTD) comprenant deux sites de phosphorylation (sérine 2 et sérine 5). Le complexe de pré-initiation assemblé, TFIIH sépare les deux brins d’ADN [38] et entraîne la phosphorylation de la sérine 5 du CTD de l’ARNPII par l’intermédiaire de sa sous-unité kinase Cdk7 (Cyclin-dependent kinase 7) [39]. A ce stade, des facteurs d’élongation négatifs (N-TEFb), tels que NELF (Négative Elongation Factor) et DSIF (DRB- Sensitivity Inducing Factor) sont liés à l’ARNPII et bloquent sa progression [40]. P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b), composé de Cdk9 (Cyclin-dependent kinase 9) et de sa cycline associée, la cycline humaine Tl, catalyse la phosphorylation de la deuxième sérine du CTD de l’ARNPII [41, 42] de DSIF et de NELF, ce qui permet de contrecarrer les effets de N-TEFb et de lever la répression [43, 44]. La phosphorylation des sérines du CTD de l’ARNPII, associée généralement au passage de la phase d’initiation transcriptionnelle à la phase d’élongation, entraîne le recrutement de facteurs de modification de l’ARNm, tels que les complexes permettant la coiffe de l’ARN en 5’, la polyadénylation en 3’ ou encore l’épissage [45].

In vivo, P-TEFb existe, dans la même proportion, sous la forme de deux complexes, l’un actif et l’autre inactif [46-48]. Dans le complexe inactif, P-TEFb est lié au petit ARN nucléaire 7SK

8

(28)

I-Introduction

(7SKRNA), ce qui permet à HEXIM-1 (HMBA inducible protein-1) de lier P-TEFb et d’inhiber l’activité kinase de Cdk9 [48]. Malgré le fait que des agents induisant un stress, tels que des irradiations UV, permettent la dissociation du complexe inactif [48] et favorisent la formation du complexe actif, le mécanisme par lequel P-TEFb est relargué du complexe inactif n’est toujours pas complètement élucidé’ [49]. En absence de Tat (avant la synthèse des premières molécules), Spl [50, 51], p65 [52-54] et les histones acétylées [46, 47] pourraient contribuer au recrutement de P-TEFb au promoteur du HIV-1. Le recrutement de P-TEFb par p65 et les histones acétylées s’effectue grâce à Brd4, un régulateur positif de l’activité de P-TEFb [46, 47, 53]. Brd4 est une protéine membre de la famille des protéines BET possédant deux bromodomaines qui reconnaissent les histones acétylées [55] ainsi que NF-kB acétylé [53].

En absence de la protéine virale Tat, la transcription médiée uniquement par les protéines cellulaires génère principalement des transcrits courts de +/- 60 nt [25]. Des transcrits de pleine longueur sont néanmoins générés permettant l’expression des gènes précoces dont le gène codant pour la protéine Tat. La transcription médiée par la protéine Tat est beaucoup plus efficace et permet la production de transcrits de pleine longueur en grande quantité [25]. Tat se lie à une séquence d’ARN appelée TAR (Trans-Activation Response element) localisée juste en aval du site d’initiation de la transcription du nt +1 à -i-60. L’élément TAR présente une boucle centrale de 6 nt liant une ou plusieurs protéine(s) cellulaire(s) et une protubérance de 3 nt reconnue par Tat. L’expression d’une protéine Tat fonctionnelle, ainsi qu’une copie intacte de sa séquence cible TAR, sont toutes deux essentielles à la réplication du HIV-1. Tat, qui entre en compétition avec HEXIMl pour la liaison à la cyclineTl, permet la dissociation de P-TEFb du complexe 7SKRNA/HEXIM1 (Fig.1.7) [56, 57].

Ensuite, Tat recrute P-TEFb au LTR5’ par la formation d’un complexe stable P-TEFb/TatyTAR [41].

P-TEFb phosphoryle comme précédemment DSIF et NELF mais la présence de Tat modifie la spécificité de substrat de P-TEFb pour le CTD de l’ARNPlI, P-TEFb phosphorylant à la fois les sérines 2 et 5 [42]. L’ensemble de ces modifications permet une élongation performante de la transcription [58].

Tat interagit également avec de nombreuses histone-acétyltranférases (HATs), telles que les Tat-interactive proteins Tip 60 et Tip 110, TAFII250, hGCN5, p300/CBP et p/CAF (p300/CBP- Associated Factor) [25]. Certaines de ces HATs ont pour cible directe la protéine Tat. p/CAF acétyle

’ Deux pistes sont actuellement à l’étude. D’un côté, une équipe a montré que l’activation de la cascade P13K/Akt entraîne la phosphorylation de HEXIMl et par conséquence la dissociation du complexe inactif (A, B). D’un autre côté, des travaux ont montré que la liaison de P-TEFb au complexe 7SKRNA/HEXIM1 nécessite la phosphorylation sur la thréonine 186 de Cdk9 (C, D). La protéine phosphatase 1 (PPl) déphosphoryle Cdk9 et permet la dissociation de P-TEFb du complexe inactif (C).

Ensuite, une kinase non encore identifiée rephosphoryle la thréonine 186 de Cdk9, ceci étant nécessaire pour son activité enzymatique (E). Les agents induisant un stress pourraient permettre l’activation de la phosphatase PPL Les niveaux de phosphorylation de la thréonine 186 de Cdk9 contrôleraient donc son association et sa dissociation avec 7SKRNA en réponse à différents stimuli (C).

(29)

I

j^O/CBP

TTTTT P P P P P PP

Figure 1.7; Régulation de l’élongation transcriptionnelle du HIV-1 par la protéine Tat.

Tat, acétylée sur la lysine 28 par p/CAF, permet la dissociation de P-TEFb (Cdk9/CyclineTl) du complexe inactif composé de 7SKRNA et de HEXIMl. Tat recrute P-TEFb au LTR5’ et entraîne la formation d’un complexe stable P-TEFb/Tat/TAR. P-TEFb phosphoryle les facteurs d’élongation négatifs (DSIF et NELF) et les sérines 2 et 5 du domaine carboxy-terminal de l’ARN polymérase II (ARNPII). L’acétylation de la lysine 50 par p300/CBP provoque la dissociation du complexe Tat/P-TEFb de TAR, sa liaison à l’ARNPII et le recrutement de P/CAF (formation d’un complexe multiprotéique P-TEFb/Tat/p/CAF associé à l’ARNPII durant l’élongation transcriptionnelle).

Adapté de [25].

(30)

I-Introduction

la lysine 28 de Tat ce qui augmente le recrutement de P-TEFb par Tat (Fig.1.7) [59, 60]. L’acétylation de la lysine 50 et plus faiblement de la lysine 51 par p300/CBP ou hGCN5 provoque la dissociation du complexe Tat/P-TEFb de TAR et sa liaison à l’ARNPII [59, 61-63]. Cette modification permet également le recrutement de p/CAF via son bromodomaine et la formation d’un complexe multiprotéique P-TEFb/Tat/p/CAF associé à l’ARNPII durant l’élongation transcriptionnelle [59, 60, 64, 65]. L’histone-désacétylase humaine de classe III SIRTl interagit spécifiquement avec Tat in vitro et in vivo et entraîne sa désacétylation. Ce phénomène est très important lorsque la quantité de protéine Tat est faible car il permet le recyclage de Tat en entraînant sa dissociation du complexe comprenant l’ARNPII et p/CAF [66]. En plus d’être modifiée par acétylation, Tat médie également le recrutement de HATs, notamment p300 et p/CAF, au niveau du promoteur du HIV-1, ce qui contribue à l’ouverture de la chromatine par acétylation des histones (voir section 1.5.3.4) [67-69]. De plus, Tat recrute au niveau du LTR5’ des complexes de modification de la chromatine dépendants de l’ATP, tels que le complexe SWFSNF. Cependant, deux théories s’opposent [70, 71]. La première théorie suggère que Tat interagit avec la sous-unité ATPase Brm du complexe SWI/SNF et que cette interaction dépend de l’absence d’acétylation au niveau de la lysine 50 de Tat [70]. Il semble que le recrutement de Brm au LTR5’ prenne place avant que Tat ne se dissocie de TAR suite à l’acétylation de sa lysine 50 [70]. La deuxième théorie exclut une interaction entre Tat et Brm et montre que Tat interagit avec une autre sous-unité ATPase du complexe SWI/SNF, BrgI [71]. Cette interaction étant dépendante de l’acétylation de la lysine 50 de Tat, le modèle proposé est donc que la protéine Tat acétylée facilite le recrutement du complexe SWI/SNF au promoteur du HIV-1, et que ce complexe synergise avec p300 pour activer ce promoteur [71].

1.3. La thérapie antirétrovirale hautement active ou traitement HAART 1.3.1. Généralités

Depuis 1996, la HAART ou Highly Active AntiRetroviral Therapy a considérablement augmenté la longévité de vie des individus infectés par HIV-1 [72]. Le traitement consiste généralement en la prise de 3 médicaments appartenant à 2 classes de composés antirétroviraux. Ceci permet d’inhiber le cycle réplicatif viral à différentes étapes et donc de limiter l’apparition de virus résistants [73]. Le traitement HAART inclus habituellement 2 inhibiteurs de la transcriptase inverse analogues aux nucléotides (ou NRTIs) combinés soit à un inhibiteur de la protéase, soit à un inhibiteur de la transcriptase inverse non-analogue aux nucléotides (ou NNRTIs) [73]. Le mécanisme d’action de ces différentes familles d’inhibiteurs est présenté dans le tableau 1.8. Plus de 20 composés antirétroviraux sont actuellement disponibles rendant le nombre de combinaisons HAART possibles très grand [74]. Il existe également une quatrième classe d’antirétroviraux en utilisation clinique, les inhibiteurs de fusion [24]. Le premier de ceux-ci, l’enfuvirtide (ou T-20), se lie à une région de la gp41 et empêche la fusion virale avec la membrane cellulaire [75]. De plus, 3 nouvelles molécules ont été

(31)

Classe d'inhibiteur Mécanisme d'action Molécules [23]

Inhibiteurs de la transcriptase inverse

analogues aux nucléotides (NRTIs)

En raison de l'absence de groupes hydroxyles essentiels pour la continuation de la chaîne, les NRTIs causent un arrêt de la transcription suite à

leur incorporation, par la transcriptase inverse, dans la chaîne d'ADN en formation [11].

Zidovudine (AZT), Didanosine (ddl), Stavudine (d4T), Lamivudine (3TC), Abacavir (ABC), Tenofovir

(TDF), Emtricitabine (FTC).

Inhibiteurs de la transcriptase inverse

non-analogues aux nucléotides

(NNRTIs)

Les NNRTIs se lient à la transcriptase inverse à proximité du site actif et inhilDcnt son activité

enzymatique [364].

Nevirapine (NVP), Delaviridine (DLV), Efavirenz (EFV).

Inhibiteurs de la protéase

Les inhibiteurs de la protéase, par mimétisme avec les sites de clivage du précurseur polypeptidique Gag-Pof empêchent la protéase

virale d'interagir avec son substrat ce qui se traduit par l'absence de maturation des particules

virales en particules infectieuses [24,73].

Saquinavir (SQV), Indinavir (IDV), Ritonavir (RTV), Nelfmavir (NFV),

Lopinavir (LPV), Atazanavir (ATV), Fosamprenavir (fAPV),

Tripanavir (TPV), Darunavir (DRV).

Tableau 1.8: Caractéristiques des différentes familles d’inhibiteurs couramment utilisés dans le traitement HAART.

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I-Introduction

récemment approuvées pour l’utilisation clinique : le maraviroc, un antagoniste du CCR5 ; le raltegravir, inhibiteur de l’intégrase ; l’etravirine, inhibiteur de seconde génération de la transcriptase inverse non-analogue aux nucléotides [76, 77].

La mise en évidence de mécanismes moléculaires cellulaires pouvant limiter la réphcation du HFV-l offre de nouvelles perspectives pour le développement de molécules anti-HIV-1. Un des mécanismes de défense cellulaire est médié par APOBEC3G (APOlipoprotein B mRNA-Editing enzyme Catalytic polypeptide-like 3G), protéine de la famille des désaminases de cytidines, qui, incluse dans les particules virales, provoque la désamination des cytidines en uridines lors de la réplication suivante, entraînant la production de virus non fonctioimels [78], Le virus détourne ce mécanisme grâce à la protéine Vif qui inhibe l’incorporation de APOBEC3G dans les particules virales, provoque son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome [78]. Etant donné que l’inhibition de l’encapsidation d’APOBEC3G par Vif nécessite une interaction entre ces deux facteurs, de nouvelles molécules inhibant cette interaction et permettant l’incorporation d’APOBEC3G dans les particules virales pourraient être développées [79]. Afin de favoriser l’action d’APOBEC3G, le ratio entre Vif et APOBEC3G pourrait également être modifié, par exemple en stimulant l’expression de APOBEC3G, comme cela a été montré dans des hépatocytes humains suite au traitement avec de l’interféron a [80, 81]. La protéine cellulaire TRIM5a (Tripartite Motif protein 5a) possède également des propriétés antivirales contre HTV-l. Elle interagit avec les particules virales et semble provoquer une décapsidation prématurée de celles-ci, ce qui interrompt le cycle viral, empêche la transcription inverse et l’entrée de l’ADN proviral dans le noyau [82, 83].

Lorsqu’une combinaison efficace d’inhibiteurs est administrée, le taux de particules virales devient inférieur à 50 copies par millilitre de plasma (soit inférieur au seuil de détection) et le nombre de lymphocytes T CD4'^ réaugmente [84]. Une utilisation judicieuse de la HAART permet donc de restaurer partiellement le système immunitaire et par conséquent limite les infections opportunistes [73]. L’utilisation de la HAART sur le long terme est limitée par l’apparition de résistances, d’effets indésirables et d’interactions pharmacocinétiques [24]. Les effets indésirables associés au traitement HAART sont un syndrome métabolique comprenant une lipodystrophie, une hyperlipidémie et une résistance à l’insuline, des réactions inflammatoires locales et systémiques, des toxicités au niveau de foie, du muscle cardiaque, des reins, de la moelle osseuse et des os [74]. La recherche de nouveaux composés continue et de nombreuses molécules sont actuellement évaluées (nouveaux inhibiteurs de la protéase, molécules interagissant avec Taxe Tat/TAR, des inhibiteurs de l’interaction CD4/gpl20, des antagonistes du corécepteur CCR5, ...) [24].

L’initiation du traitement HAART est recommandée chez les individus infectés symptomatiques sans tenir compte de la charge virale ou du nombre de lymphocytes T CD4^, et chez les individus infectés de façon asymptomatique présentant un nombre de lymphocytes T CD4^

inférieur à 350 cellules/pl de sang [76]. L’initiation du traitement doit être évaluée au cas par cas

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I-Introduction

lorsque le taux de lymphocytes T CD4'^ excède les 350 cellules/pl de sang, en tenant compte notamment des facteurs de risque de progression vers le stade SIDA, de la présence d’autres infections (telles que l’hépatite B ou C), de la charge virale (>100.000 copies ARN viral/ml de plasma), de la vitesse de diminution du nombre de lymphocytes T CD4^ (>1(X) cellules/pl par an), des risques cardiovasculaires, de la présence d’une néphropathie associée à HIV et du patient [76].

Une stratégie permettant aux patients d’interrompre le traitement HAART et ses effets secondaires (fenêtres thérapeutiques) sans que la virémie n’augmente a été proposée. Cette stratégie consiste à interrompre le traitement HAART de manière structurée dans l’espoir de stimuler une réponse immune spécifique contre HFV-l qui pourrait contrôler la réplication virale [85, 86]. En effet, une interruption structurée du traitement HAART (STI) permettrait la stimulation du système immunitaire par HFV-l pendant des périodes de temps définies. La plupart des études de STI réalisées sur des patients infectés de manière chronique n’ont montré que des améliorations très faibles de l’immunité spécifique contre HFV-l et ces patients n’étaient pas capables de contrôler la virémie pendant des périodes prolongées [87, 88]. Par contre, des études menées sur des patients traités par HAART durant l’infection primaire, ont montré des effets impressionnants avec certains patients qui contrôlent la virémie pendant plus d’une année [85, 89, 90]. Cette différence s’explique sans doute par le fait qu’un démarrage précoce de la HAART permet la maintenance à long terme des réponses lymphocytaires T CD4^ et CD8^ spécifiques contre HIV-1 [91-93].

Le traitement HAART permet un contrôle de la réplication virale et donc de la progression de la maladie [94, 95]. Néanmoins, ce traitement présente certaines limites et ne permet pas l’éradication du vims chez les individus infectés, et ce même au terme de plusieurs années de traitement continu. En effet, une virémie plasmatique résiduelle est mise en évidence même chez des patients traités depuis longtemps et de façon continue par la HAART [96, 97]. De plus, un arrêt du traitement HAART provoque, en quelques jours ou en quelques semaines, un rebond de la virémie plasmatique dont le niveau atteint celui présent avant l’initiation du traitement HAART [98, 99].

L3.2. Les limites de la HAART

L’initiation du traitement HAART provoque une diminution de la charge virale selon une courbe quadriphasique (Fig.1.9) [100-103]. L’analyse de cette courbe permet de mettre en évidence les sources de production de virus et leurs temps de demi-vie. La première phase est caractérisée par une diminution rapide de la virémie. Elle correspond à la disparition des virus circulants (Ti/a vie : 6 heures) et des lymphocytes T CD4^ activés, infectés de manière productive (T|/2 vie : 1,6 jour), responsables de 99% de la charge virale plasmatique [100, 102]. Les cellules infectées de manière productive meurent rapidement suite aux effets cytopathiques viraux ou suite à leur détection et destruction par le système immunitaire. Durant la seconde phase, qui dure 1 à 4 semaines, la virémie diminue plus lentement [100, 102]. Elle représente la disparition des cellules infectées au long terme.

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PlasmaHIVRNA(copies/ml)

Figure 1.9: Courbe caractéristique de la diminution de la charge virale plasmatique suite à l’initiation du traitement HAART.

L’initiation du traitement HAART provoque une diminution de la charge virale selon une courbe quadriphasique. La première phase est caractérisée par une diminution rapide de la virémie (disparition des virus circulants et des lymphocytes T CD4+ activés, infectés de manière productive). Durant la seconde phase, la virémie diminue plus lentement (disparition des macrophages, des cellules dendritiques folliculaires et des lymphocytes T CD4+ partiellement activés). Après la mort de ces différents types cellulaires, la virémie diminue tout doucement sous le seuil de détection (3^*"® phase) pour finalement atteindre un plateau (4^™ phase), nommé virémie résiduelle (VR) (1-20 copies/ml). Des élévations transitoires de la virémie au-dessus du seuil de détection sont mises en évidence chez de nombreux patients (blips).

Adapté de [103].

Figure

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