Résumé des résultats

Dans un premier temps, nous avons déterminé, pour plusieurs HDACIs, la concentration optimale en tenant compte de la cytotoxicité de la molécule et de son potentiel d’activation de la production virale. Pour cela, nous avons, suite au traitement par des HDACIs d’une lignée cellulaire modèle de latence post-intégrationnelle (cellules Ul), mesuré la viabilité cellulaire (Fig.Sl et Texte SI de la publication) et dosé la protéine de capside p24 (Fig. 1 de la publication), reflet de la production virale. L’ensemble des inhibiteurs de HDACs de classe I et/ou II testés permettent l’activation de la production virale quelle que soit la famille structurale à laquelle ils appartiennent (Fig.LA, l.B, LC et l.D). Dans le groupe des acides aliphatiques, le VPA active la production virale plus faiblement que le NaBut (Fig. LA). Tous les HDACIs de la famille des acides hydroxamiques sont plus performants que la TSA en termes d’induction de la production de la protéine de capside p24 (Fig.l.D). Aucun des deux inhibiteurs spécifiques des HDACs de classe III testés (splitomycine et sirtinol) n’a permis l’activation de la production virale (Fig.LA et l.B).

Parmi les HDACIs testés, le VPA, le NaBut et le SAHA sont déjà utilisés en thérapie humaine [223-229], tandis que d’autres, tels que le MS-275, sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques [213, 321]. Nous avons ensuite voulu déterminer si ces HDACIs permettaient, dans les cellules Ul, une activation synergique de la production virale en combinaison avec différents activateurs de NF-kB : le TNFa (cytokine pro-inflammatoire), la PMA (ester de phorbol tumorigène) et la prostratine (ester de phorbol non-tumorigène) (Fig.2.A, 2.B et 2.C de la publication). Deux activateurs synergisent lorsque leur combinaison permet une activation dont le niveau est supérieure à la somme des niveaux d’activation obtenus avec les activateurs individuellement. Chaque co­ traitement TNFa-i-HDACI active en synergie la production de la protéine de capside p24 (Fig.2.A). De manière similaire, nous observons une activation synergique de la production virale pour chaque combinaison de PMA (Fig.2.B) ou de prostratine (Fig.2.C) avec un HDACI, à l’exception du MS-275.

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Dans le but d’étendre les résultats obtenus dans les cellules U1 de type monocytaire, nous avons utilisé un autre modèle de latence post-intégrationnelle dérivé des lymphocytes T CD4^ Jurkat, les cellules J-Lat [179]. Ce sont des clones cellulaires contenant un provirus intégré de pleine longueur dans lequel le gène nef a été remplacé par celui codant pour la GFP (Green Fluorescent Protein). Contrairement à d’autres modèles cellulaires de latence post-intégrationnelle (dont les cellules Ul), les clones J-Lat ne contiennent pas de mutations dans le gène codant pour la protéine Tat ou dans l’élément TAR. Nous avons observé d’importantes activations synergiques de la production virale dans les deux clones J-Lat testés (8.4 et 15.4) pour chacune des combinaisons comprenant le TNFa (Fig.2.D et 2.G), la PMA (Fig.2.E et 2.H) ou la prostratine (Fig.2.F et 2.1) et un HDACI. Contrairement à ce que nous avions observé dans les cellules Ul, la PMA et la prostratine activent la production virale en synergie avec le MS-275 dans les deux clones J-Lat, indiquant que ces combinaisons peuvent présenter une certaine spécificité et soulignant l’importance de tester les différentes combinaisons dans plusieurs types cellulaires. Nous avons également montré, dans des PBMCs sains (Peripheral Blood Mononuclear Cells), que la prostratine n’augmente pas la cytotoxicité de ces HDACIs, à l’exception du MS-275 (Fig.S2 et Texte S2 de la publication).

Etant donné que les clones J-Lat contiennent un provims latent de pleine longueur dans lequel le gène ne/a été remplacé par celui codant pour la GFP, l’activation transcriptionnelle du provirus peut être détectée dans chaque cellule individuellement par cytométrie de flux. Les deux clones J-Lat n’expriment pas la GFP en conditions basales, illustrant un blocage de l’expression virale (Fig.S.A, 3.B et S3 de la publication). De manière intéressante, dans les deux clones J-Lat analysés, les différentes combinaisons prostratine-i-HDACIs induisent l’expression de la GFP dans un plus grand pourcentage de cellules que les traitements individuels.

HIV-1 est caractérisé par une grande diversité génétique évolutive illustrée par l’existence de différents groupes, sous-types, sous-sous-types et formes recombinantes circulantes [1]. Malgré que les LTRs des différents variants viraux assurent la même fonction, ils diffèrent au niveau de leurs séquences nucléotidiques, de leurs activités basales et de leurs réponses aux différentes cytokines et facteurs de transcription [322]. Pour examiner l’impact de ces différences sur la synergie prostratine-i-VPA, nous avons réalisé des expériences de transfection transitoire de cellules Jurkats avec des constructions plasmidiques contenant le gène rapporteur de la luciférase en aval des LTRs des sous-types A, B, Cl, D, F, G, de CRF01_AE et de CRF02_AG. La combinaison prostratine-l-VPA active en synergie la transcription LTR-dépendante de chaque construction testée, à l’exception de celle contenant le LTR du sous-type G (Fig.4 de la publication).

Afin d’étudier les mécanismes moléculaires responsables de l’activation synergique de la production virale observée suite au co-traitement prostratine+VPA, nous avons analysé l’effet du VPA sur la liaison de NF-kB à l’ADN induite par la prostratine à l’aide d’expériences de retard de migration sur gel (Fig.5.A de la pubhcation). Lorsque la prostratine est combinée au VPA, nous

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observons une liaison à l’ADN de NF-kB plus intense que celle observée avec la prostratine seule, et ce, aux deux temps testés (Fig.S.A, piste 5 comparée à la 3, piste 8 comparée à la 6). De plus, le VPA prolonge la liaison de NF-kB à l’ADN induite par la prostratine (Fig.S.A, piste 8 comparée à la 6). Etant donné que la liaison de NF-kB à l’ADN nécessite la dégradation de son inhibiteur iKBa, nous avons analysé la présence d’iKBa dans le cytoplasme suite aux différents traitements prostratine, VPA ou prostratine-)-VPA (Fig.S.B de la publication). Alors que la dégradation d’iKBa induite par la prostratine est suivie de sa réapparition dans le cytoplasme après 1 heure de traitement (Fig.S.B, piste 6), nous ne détectons qu’une réapparition partielle d’iKBa dans le cytoplasme après 1 heure de co­ traitement prostratine-l-VPA (Fig.S.B, piste 8). Nos résultats démontrent que le VPA intensifie et prolonge la liaison de NF-kB à l’ADN induite par la prostratine et que ceci est corrélé à une dégradation prolongée de l’inhibiteur Ixfia. Ces données expliquent, au moins en partie, la synergie transcriptionnelle observée entre la prostratine et le VPA sur le promoteur du HlV-1.

Nous nous sommes ensuite intéressés aux effets de la combinaison prostratine-)-VPA sur le remodelage du nucléosome nuc-1, nucléosome situé juste en aval du site d’initiation de la transcription et spécifiquement remodelé lors de l’activation transcriptionnelle [36, 37, 235]. Pour cela, nous avons analysé, dans des cellules Ul, le clivage de l’ADN génomique par l’endonucléase AflII, qui possède un site de coupure au niveau de nuc-1 (Fig.6.A de la publication). Tout d’abord, l’enzyme est incubée avec les noyaux purifiés, ensuite, TADN est purifié, digéré in vitro par l’enzyme de restriction PstI, et analysé par Southern blot et par la technique de marquage des extrémités (Fig.6.B de la publication). A chaque temps testé, le traitement combiné prostratine-)-VPA provoque une augmentation de l’accessibilité de TADN dans la région de nuc-1 supérieure à celles obtenues avec les traitements individuels (Fig.6.B, piste 4 comparée aux pistes 2 et 3, piste 7 comparée aux pistes 5 et 6, piste 10 comparée aux pistes 8 et 9). Des résultats similaires ont été obtenus avec Hinfl, une autre endonucléase qui possède, en plus du site de coupure au niveau de nuc-1, deux sites de coupure additionnels (au niveau de nuc-2 et au niveau de la région entre nuc-1 et nuc-2), générant 3 fragments lors d’une digestion incomplète (Fig.S4A et S4B de la publication, bandes x, y et z). L’accessibilité des deux sites de clivage additionnels n’est pas modifiée par les différents traitements (Fig.S4B, bandes y et z). Nous avons ensuite analysé l’effet de la combinaison prostratine-)-VPA au niveau de la chromatine. Dans ce but, nous avons examiné, par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans des cellules Ul, le niveau d’acétylation de Thistone H4 dans la région de nuc-1 (Fig.SS et Texte S3 de la publication). En accord avec des études précédentes, le VPA induit l’acétylation de Thistone H4 au niveau de nuc-1 [239, 241, 243]. La prostratine augmente légèrement et graduellement le niveau d’acétylation de Thistone H4 entre 20 min et 2 heures de traitement. Ceci est en accord avec une étude précédente dans laquelle, lors de l’activation transcriptionnelle du HTV-l par Tester de phorbol PMA, des HATs sont recrutées au promoteur viral via NF-kB [69]. Cependant, à chaque temps testé, le traitement combiné prostratine-)-VPA n’induit pas un niveau d’acétylation

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supérieure à celui observé avec le traitement VPA seul (Fig.S5 et Texte S3), indiquant que le remodelage plus efficace du nucléosome nuc-1 observé suite au co-traitement prostratine-i-VPA n’est pas corrélé à une acétylation plus importante de l’histone H4 dans la région de nuc-1.

Dans le but d’examiner les effets de la combinaison prostratine+VPA sur l’activation transcriptionnelle du HIV-1, nous avons tout d’abord réalisé, dans des cellules Ul, des expériences de ChIP dirigées contre l’ARN polymérase II (ARNPII) dans la région du LTR5’. Après 2 heures de co­ traitement, nous observons un effet coopératif entre la prostratine et le VPA sur le recrutement de l’ARNPII au niveau du promoteur du HIV-1 (Fig.V.A de la publication). Afin de d’étudier la pertinence fonctionnelle de cette observation, nous avons quantifié, par des expériences de RT-PCR quantitative en temps réel, les transcrits initiés et élongués dans des cellules Ul en utilisant 4 paires de primers ciblant différentes régions du provirus HTV-1 (TAR et les gènes pol, vif et nef) (Fig.V.B de la publication). Après 4 heures de traitements individuels avec la prostratine ou le VPA, nous détectons une accumulation des transcrits initiés et élongués par rapport à la condition contrôle non traitée. De plus, le traitement combiné prostratine-i-VPA de 4 heures provoque une accumulation synergique des transcrits courts et longs, par rapport aux traitements individuels. L’ensemble de ces résultats indiquent que la synergie entre la prostratine et le VPA a lieu, au moins en partie, au niveau transcriptionnel (initiation et élongation).

Les résultats décrits précédemment suggèrent qu’une combinaison prostratine-i-HDACI pourrait présenter un meilleur potentiel que les composés individuels pour la réactivation de l’expression virale dans les cellules réservoirs de patients sidéens sous traitement HAART et présentant une charge virale indétectable (<50 copies d’ARN HlV-l/ml de plasma). Afin de tester cette hypothèse, nous avons obtenu des échantillons sanguins de 52 patients répondant à certains critères (voir Materials and Methods de la publication). Ensuite, nous avons purifié les PBMCs desquelles nous avons éliminé les lymphocytes T CD8^ connus pour leur activité antivirale [323]. D est important de noter que les cellules purifiées sont cultivées en absence d’IL-2 et en absence de stimulation allogénique (co-culture avec des PBMCs provenant d’un donneur sain), afin d’éviter une activation et une prolifération cellulaires massives et donc une amplification des niveaux d’ARN génomique viral. Les cellules mises en culture sont traitées ou non avec des anticorps anti-CD2-i-anti- CD28 (contrôle positif), de la prostratine, du VPA, du SARA, des combinaisons prostratine-i-VPA ou prostratine+SAHA. Après 6 jours de traitement, les concentrations d’ARN génomique viral sont mesurées dans les surnageants de culture (Roche Amplicor Test). Nous avons exclu de cette étude les cultures de PBMCs (10/52) pour lesquelles de l’ARN génomique viral a été détecté en l’absence de traitement. Les caractéristiques des 42 patients restants sont décrites dans la Table 1. Cette table indique également, pour chaque échantillon, la combinaison prostratine-i-HDACI testée (prostratine-i-VPA et/ou prostratine-i-SAHA) ainsi que le niveau d’ARN génomique viral obtenu avec le contrôle positif. Pour 25 des 42 échantillons, nous détectons une réactivation de l’expression du

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HFV-1 par au moins un des traitements testés (prostratine, VPA, SAKLA, prostratine+VPA et/ou prostratine+SAHA) (Table 1 et 2, patients XI à X25). La prostratine réactive l’expression virale dans 17 de ces 25 cultures (Table 2, XI, X2, X4 à X6, X9, XI1, X14, X16, X18 à X25), tandis que le VPA et le SAHA individuellement ne réactivent l’expression virale que dans 3 de ces cultures (Table 2, respectivement X4, XI1, X14 et X4, X23, X24). Aucun traitement individuel ne réactive l’expression virale dans 8 de ces 25 cultures (Table 2, X3, X7, X8, XIO, X12, X13, X15 et X17). Pour 17 de ces 25 cultures, nous détectons une réactivation synergique de l’expression virale par au moins une des combinaisons prostratine+HDACI testée (Table 2, patients XI à X17). Ces échantillons peuvent être divisés en trois catégories pour chacune des combinaisons prostratine+HDACI, selon le profil de réactivation obtenu (Fig.8.A à 8.F de la publication) ;

soit nous observons une réactivation par les traitements individuels et une réactivation synergique par la combinaison prostratine+HDACI (Fig.8.A et 8.D);

soit nous n’observons, pour les traitements individuels, une réactivation de l’expression virale qu’avec la prostratine, mais nous détectons néanmoins une réactivation synergique avec la combinaison prostratine+HDACI (Fig.8.B et 8.E);

soit nous observons une réactivation de l’expression virale seulement avec les traitements combinés prostratine+HDACIs (Fig.8.C et 8.F).

Dans les cultures de PBMCs des patients X26 à X42, nous ne détectons pas de réactivation de l’expression virale suite à nos traitements avec la prostratine et les HDACIs, seuls ou en combinaison (Table 1). De plus, les niveaux d’ARN génomique viral obtenus avec le traitement d’anticorps anti- CD2+anti-CD28 dans ces échantillons (Table 1, patients X26 à X42) sont nettement inférieurs à ceux obtenus, avec le même traitement, dans les 25 cultures dont l’expression virale est réactivée suite à nos différents traitements prostratine et/ou HDACI (Table 1, patients XI à X25). Nous ne pouvons exclure que, dans certaines de ces cultures, les niveaux de réactivation obtenus soient en-dessous du seuil de détection du test Amplicor utilisé (50 copies ARN HlV-l/ml).

Les lymphocytes T CD4’’ au repos, comprenant un provirus intégré compétent pour la réplication et infectés de manière latente, représentent la source majeure de persistance du HIV-1 chez les individus avirémiques traités par HAART [108, 285, 324]. Afin de confirmer dans des lymphocytes T CD4^ au repos les résultats obtenus dans les cultures de PBMCs, nous avons purifié des lymphocytes T CD4’' HLA DR' (HLA DR : marqueur d’activation du lymphocyte T) de 9 patients HIV-1^, avirémiques et traités par HAART (Table 3, patients X43 à X51). En raison d’un nombre limité de cellules purifiées, seule la combinaison prostratine+SAHA a pu être testée et a permis la réactivation de l’expression virale dans 7 des 9 cultures testées (Fig.9 de la publication).

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En conclusion, cette étude suggère que des traitements combinant deux activateurs de l’expression virale de type différent pourraient être de bons candidats comme adjuvant de la thérapie HAART afin d’accélérer la purge des réservoirs cellulaires infectés de manière latente par HTV-1.

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^ PLoSone