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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Prévot, P.-P. (2007). Rôles de la protéine Iris dans l'accomplissement du repas sanguin de la tique Ixodes ricinus (Unpublished doctoral dissertation).
Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/210730/5/90b96002-59dd-4acb-92bd-3520ae43d6de.txt
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DBM 00687
V__________________
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires
Rôles de la protéine Iris dans Eaccomplissement du repas sanguin de la tique Ixodes ricinus
Promoteurs : Dr Edmond GODFROID Dr Luc VANHAMME
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biologiques
Avril 2007
ULB - IBMM
BIBLIOTHEQUE PREVOT Pierre-Paul
« La qualité d’un homme se calcule à sa démesure ; tentez, essayez, échouez même, ce sera votre réussite. »
Jacques Brel
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires
Rôles de la protéine Iris dans raccomplissement du repas sanguin de la tique Ixodes ricinus
Promoteurs : Dr Edmond GODFROED Dr Luc VANHAMME
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biologiques
Avril 2007
PREVOT Pierre-Paul
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier les personnes qui m’ont encadrés tout au long de ces 4 dernières années. En premier lieu, je remercie Edmond Godfroid de m’avoir accueilli au sein du laboratoire du feu-Service de Génétique Appliquée et d’avoir donné sa chance à un français. Je remercie également Luc Vanhamme, qui a accepté d’une part de rejoindre l’aventure au sein du néo-laboratoire d’Ectoparasitologie Moléculaire, et d’autre part de travailler avec un français. Leurs conseils avisés m’ont été des plus précieux.
Je tiens à remercier le Professeur Michel Brossard de l'Université de Neuchâtel, qui m’a suivi de « loin » (la Suisse, ce n’est pas la porte à côté), et qui m’a permis de mieux comprendre les interactions tiques-hôtes. Merci de m’avoir inculqué l’amour de la tique.
Je remercie également le Professeur M. Vanhaeverbeek du CHU de Charleroi pour avoir mis à ma disposition les appareils nécessaires à la réalisation de certains tests. Un grand merci à Amélie et surtout à Karim, pour leur disponibilité et leurs précieux conseils qui m’ont permis de présenter mes travaux aujourd’hui.
Je remercie le Professeur R. Brasseur du Centre de Biophysique Moléculaire et Numérique de Gembloux pour avoir mis à notre disposition leur connaissance et leurs outils, nécessaires à l’analyse in situ de la protéine Iris. Je pense en particulier à Benoît Adam, un doctorant effectuant sa thèse sur la modélisation d’iris, avec qui j’ai échangé de nombreux et longs appels téléphoniques sur le pourquoi du comment d’iris.
Mes remerciements vont également au Dr Alain Beschin et à Léa, pour m’avoir accueilli si gentiment au sein du laboratoire d’immunologie Cellulaire de la VUB.
Mes pensées vont maintenant pour mes collègues et en particulier pour Valérie, une perle avec laquelle tout le monde voudrait travailler. Merci pour tout ce que tu m’as apporté ces dernières années (même si tu t’es éloignée un an pour t’occuper de ton petit dernier que tu as dédaigner appeler Pierre-Paul, mais bon....). Sans ta précieuse aide, ta patience, ta générosité et ton sale caractère. Dieu seul sait ou j’en serai aujourd’hui... .et je ne parle même pas de l’état de mon bureau et de ma paillasse...
2
De très grands remerciements iront aussi vers Jérôme, mon « collègue préféré », le gars le plus cool du bâtiment, si ce n’est du monde, comme il le dit lui-même. Je ne comprends vraiment pas les gens qui te définissent comme caractériel et désagréable, toi qui es pourtant si gentil et si doux.. .avec tes lapinous (Harry, on te fais des doudouces là ou tu es). Je remercie également ton frère jumeau polonais adepte de la voile. Vous avez tous deux été d’une grande aide pour moi dans les moments les plus difficiles. Merci pour ta bonne humeur et tes judicieux conseils dans le boulot et dans la vie de tous les jours. Je n’oublierai jamais toute l’aide que tu m’as apporté.
Merci aux « cadres », Yves et Virginie. Je les remercie de m’avoir si bien accueilli et de m’avoir permis de m’intégrer dans le laboratoire. Merci à Yves, mon compagnon de thèse, pour m’avoir aidé et pour m’avoir donné de précieux conseils tout au long des ces quatre dernières années. Tous les délires que nous avons pu avoir au laboratoire (avec la participation active de Jérôme) mais surtout en Suisse (ils s’y passent vraiment de drôles de choses à Neuchâtel) garderont toujours une grande place dans ma mémoire. Merci à toi Virginie : tu correspondras toujours à ma première image du Plat Pays ; spontanée, généreuse et d’une gentillesse qui n’a d’égale qu’un appréciable petit accent, une fois.
J’en viens maintenant aux p’tits nouveaux du laboratoire, Laurence et Cédric. Ils nous ont apporter un vent de fraîcheur appréciable dans ce laboratoire de brutes. . .enfin, au début, parce qu’en y regardant de plus près, je me demande s’ils ne sont pas plus névrosés que nous.
Merci à eux d’avoir toujours accepté de m’accorder leur aide et leur attention. Merci à Laurence d’avoir su apporter rigueur et ordre (surtout sur la paillasse d’Yves) avec bonne humeur et merci à Cédricounet d’avoir apporté beaucoup de gaîté dans notre bureau.
Je remercie enfin le « vieux » du groupe, Bernard. Et même si je n’ai pas toujours
compris tes blagues, merci pour ton soutien ces deux dernières années, surtout en ce qui
concerne la rédaction. Je remercie enfin toutes les autres personnes que j’ai pu cotoyer au
cours de ces quatre années de thèse. Je pense à des anciens collègues ou étudiants du labo (par
ordre alphabétique d’importance : Barbara, Erwan, François, Kaki, Maryse, Sophie), à Louis
Delhaye qui m’a appris à travailler avec les animaux, à Michelle Haumont et ses filles
d’HENOGEN pour leur aide et leur bonne humeur.
Merci à toutes les autres personnes de l’IBMM que j’ai côtoyé chaque jour, en particulier Anna, Jacques et Vito pour leur grande gentillesse. Je remercie aussi la bande des
« Immunos » (Sébastien, Delphine, Fred, Mara, Gwen, Cindy, lain et une autre personne que je ne peux pas citer sinon son chef le saura), avec qui j’ai passer de très bons moments au cours des soirées « rétroprojecteur » (cela dit en passant, beaucoup plus nombreuses que leurs séances «journal-club»). Merci également à Akhim dont la générosité n’a d’égal que l’humour, et qui a toujours accepté de prêter attention à mes histoires.
Merci à toutes les personnes qui m’ont donné l’envie de faire de la recherche (en particulier les Drs Corinne et Franck Chauvat), choix que je ne regrette pour rien au monde et qui m’ont amené dans ce laboratoire. Merci également à Bruno André, qui représente à lui seul le début de mon histoire en Belgique. Les conditions qui m’ont amené ici ressemblent à une accumulation de coïncidences pour le moins troublantes. Certes, Jérôme y verrai une volonté bien plus grande, puisque depuis que je lui ai dit que mon père avait été sujet à la maladie de Lyme, il ne voit dans ma thèse qu’une vengeance contre les tiques du monde entier (dixit Jérôme : « Je vais te venger papa ! Saleté de tiques ! »). Tout dans le monde tourne autour des volontés fortes, mais parfois je veux bien croire que tout fait partie d'un grand rouage qui m’a permis d’atterrir à Gosselies, d’y rencontrer toutes ces personnes, et en particulier Julie.
Merci à toi Julie, pour tout ce que tu m’as apporté ces dernières années et pour le meilleur qui reste à venir. Merci également à mes parents qui m’ont toujours encouragé dans mes choix et qui m’ont toujours permis d’y arriver même au prix de quelques sacrifices.
Merci à ma sœur Armelle pour....hé, mais tu n’as rien fait à part m’ennuyer. J’vais le dire à Maman. J’aurais également une tendre pensée pour mes grand-parents et pour Claude.
Et enfin, un dernier (et non des moindres) remerciement à Edmond, pour les moments passés à échanger nos points de vue sur l’importance des cristaux de Monash et de Cambridge. Et comme vous le dites parfois, « Au moins, on aura bien rigolé ».
4
RESUME
Les tiques sont des arthropodes ectoparasites obligatoires qui se nourrissent sur une grande variété de vertébrés sur une large partie du globe. Au cours de leur repas, les tiques sécrètent dans leur salive de nombreux facteurs leur permettant de contourner bon nombre des défenses de l’hôte. Bien que la littérature rapporte beaucoup d’informations au sujet des effets du repas de la tique sur l’hôte, la nature des facteurs actifs exprimés par les glandes salivaires de la tique est peu connue. Au cours d’anciens travaux au sein du laboratoire, le crible de deux banques d’ADN complémentaires - issues de la rétro-transcription des ARN messagers synthétisés par les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus - a permis l’identification de 27 protéines dont l'expression est spécifiquement induite ou régulée positivement pendant le repas sanguin de la tique /. ricinus. Parmi ces protéines, la protéine Seq24, induite au cours du repas sanguin, présente la capacité de moduler les immunités innée et acquise de l’hôte En conséquence, la protéine Seq24 a été nommée Iris pour « Ixodes ricinus Immuno^ppressor ».
Au cours de la présente étude, notre but fût de caractériser le rôle d’iris et de déterminer son importance dans le repas sanguin de la tique I. ricinus.
La protéine Iris appartient à la famille des inhibiteurs de sérine protéases et présente une homologie significative avec l’inhibiteur d’élastase de leucocytes. Une analyse in silico a confirmé qu’Iris présentait la structure des serpines, et notamment le RCL (Reactive Center Loop), boucle responsable de l’activité anti-protéasique. Comme attendu (sur base de l’analyse in silico), iris inhibe de manière spécifique l’activité de plusieurs sétiiie uioiéascs, ei en particulier l’élastase de leucocyte. Ces tests effectués, nous avons essayé de comprendre quel(s) pouvai(en)t être le(s) rôle(s) d’iris dans l’accomplissement du repas sanguin de la tique, c’est à dire dans la lutte contre les différents systèmes de défenses de l’hôte.
Tout d’abord, des tests ont démontré la capacité d’iris à inhiber les mécanismes de l’hémostase. Des tests sur du plasma et du sang complet ont montré qu’Iris allonge le temps de fibrinolyse, la voie intrinsèque de la coagulation et l’adhésion plaquettaire. L’utilisation de mutants a également démontré que si les deux premières activités sont dépendantes du RC)^., et donc d’un mode de fonctionnement anti-protéolytique, l’adhésion plaquettaire est indépendante de ce système. Ce résultat met en évidence l’existence d’autres sites actifs, isolés pai' analyse in silico, nommés Receptor Binding Domain (RBD).
Un travail antérieur du laboratoire avait permis d’indiquer la capacité de la protéine recombinante Iris semi-purifiée à inhiber la production de TNF-a, d’U^-6, et d’IL-8 (cytokines pro-inflammatoires) ainsi que 1’IFN- y par des PBMCs (Peripherical Blood Mononuclear Cells) humaines. Ces résultats ont été confirmés avec de la protéine purifiée.
Des analyses complémentaires ont démontré qu’un mutant d’iris - dépourvu d’activité anti
protéasique - conserve l’activité pro-inflammatoire. Là encore, ce mécanisme semble impliquer un ou plusieurs RBD. L’utilisation d’anticorps dirigés contre ces zones a permis de déterminer le domaine d’interaction (aa : 105-120) impliqué dans cette fonction. D’autre part, une analyse par FACS a permis de démontrer qu’Iris interagit uniquement avec les cellules d’origine monocytaire.
Enfin, nous avons également analysé l’importance d’iris au cours du repas sanguin de
la tique par une approche vaccinale. Les résultats observés indiquent que 30 % des tiques
nourries sur des lapins immunisés par la protéine riris ne survivent pas au repas.
RESUME... 5
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INTRODUCTION_______________________________________ ___________________ 13 1. Présentation du parasite...14
1.1. Généralités sur les tiques...14
1.2. Les tiques : vecteurs de pathogènes... 14
1.3. Cycle de vie des Ixodidae...,15
1.4. Ixodes ricinus_...,16
2. La salive et ses facteurs... 17
2.1. Les facteurs bioactifs... 17
2.2. Les inhibiteurs de protéases... ,18
2.3. Iris...18
3. Les serpines (SERine Protease EVhibitor)... 19
3.1. Généralités... 19
3.2. Structure... 19
3.3. Mécanisme d’action des serpines... 20
3.4. Les serpines sans activité inhibitrice... 21
4. L’hémostase... 22
4.1. L’hémostase primaire 23 4.1.1. Le temps vasculaire ...23
4.1.2. Le temps d’adhésion plaquettaire ...23
4.1.3. Le temps d’agrégation plaquettaire ...24
4.2. L’hémostase secondaire...24
4.2.1. Les éléments intervenant dans l ’hémostase secondaire 25 42.1.1. Les facteurs plasmatiques procoagulants 25 a. Le fibrinogène 25 b. Les zymogènes 25 c. Les cofacteurs V et VËi ... 26
4.2.1.2. Le facteur tissulaire ...26
4.2.2. Le déroulement de l’hémostase secondaire ....27
4.2.2.1. La conception classique du phénomène de coagulation... 27
4.2.2.2. La conception actuelle du phénomène de coagulation... 27
4.2.2.3. La transformation du fibrinogène en fibrine,... 29
4.3. La fibrinolyse...29
4.3.1. Les acteurs de la fibrinolyse...30
4.3.1.1. Les facteurs plasmatiques... 30
4.3.1.2. Les éléments cellulaires... 30
4.3.2. Le déroulement de la fibrinolyse...30
5. L’inflammation...31
5.1. Les médiateurs de l’inflammation... 31
5.1.1. Amines vasoactives_...32
5.1.2. protéases plasmatiques...32
5.1.2.1. Système du complément... 32
5.1.2.2. Système des kinines... 33
5.1.2.3. Facteurs de la coagulation / fibrinoformation / fibrinolyse... 33
5.1.3. Médiateurs lipidiques,... 33
5.1.4. Enzymes et métabolites des polynucléaires et des macrophages,... 34
5.1.4.1. Les enzymes lysosomiaux... 34
6
a. généralités... 34
b. l’élastase... 34
5.1.4.2. Les radicaux libres dérivés de l’oxygène... 35
5.1.5. Les cytokines^...36
5.1.6. Les autres facteurs...36
5.2. Le déroulement de l’inflammation... 37
6. Modulation des mécanismes de l’hémostase et de l’inflammation par la tique,... 38
6.1. Modulation de l’hémostase par la tique... 38
6.2. Modulation de l’inflammation par la tique... 41
OBJECTIFS ____________________________________________________ __________________________ 44 RESULTATS_________________________________________________________ ___ _________________45 1. Etude structurale d’iris...46
1.1. Analyse de la séquence en acides aminés d’iris... 46
1.2. Prédiction de l’activité d’iris...47
1.2.1. Iris, protéine ayant une activité anti-protéasique...47
1.2.2. Prédiction de sites d’interaction...48
1.2.2.1. Construction d’un modèle en interaction d’iris avec la trypsine...48
1.2.2.2. Extraction des acides aminés impliqués dans l’interaction... .48
1.2.2.3. Prédiction des autres sites d’interactions probables... .48
2. Expression d’iris en système baculovirus... 49
3. Production d’anticorps... 49
3.1. Production d’anticorps polyclonaux de lapins et de souris...50
3.2. Production d’anticorps peptidiques... 50
4. Expression d’iris au cours du repas sanguin de la tique I. ricinus... 51
4.1. Détection des ARNm d’iris...52
4.2. Détection de la protéine native Iris dans la salive de tique...52
4.3. Mise en évidence de l’injection d’iris dans l’hôte au cours du repas sanguin... 53
5. Caractérisation in vitro de l’activité anti-protéasique d’iris,...53
5.1. Mesure in vitro de l’activité anti-protéasique d’iris... 53
5.2. Mesure in vitro de l’activité anti-protéasique des mutants d’iris...54
6. Activités d’iris dans les mécanismes de l’hémostase... 55
6.1. l’hémostase primaire... 56
6.2. la coagulation...56
6.3. la fibrinolyse... 56
7. Activité anti-inflammatoire d’iris...57
7.1. Actions d’iris purifiée et de ses mutants sur la production de cytokines par les PBMCs... 57
7.2. Détermination du ou des types cellulaires interagissant avec Iris... 58
7.2.1. Utilisation de lignées cellulaires humaines... 58
7.2.2. Utilisation du FACS_...59
8. Importance d’iris dans le repas sanguin de la tique et approche vaccinale,... 60
8.1. Détermination de la qualité de la réponse humorale...60
8.1.1. La réponse humorale contre Iris...60
8.1.2. Mesure de la capacité des anticorps à neutraliser l'activité de riris...60
8.2. Mise en contact de tiques avec différents animaux de laboratoire...61
8.2.1. Mise en contact de nymphes d’Ixodes ricinus avec des souris
immunisées par riris,... 61
8.2.2. Mise en contact de nymphes d’Ixodes ricinus avec des lapins
immunisés par rlris_... 62
8.2.3. Mise en contact de femelles d’Ixodes ricinus avec des lapins immunisés par rlris_...63
DISCUSSION __________________________________________________ 65 MATERIEL et METHODES_________________________________ 81 1. La bioinformatique et ses méthodes...82
1.1. Méthode de recherche de séquences homologues : Blast... 82
1.2. Méthode d’alignement : ClustalW et Matchbox... 82
1.3. Méthode d’analyse de profils hydrophobes : HCA (Gaboriaud et al., 1987)... 82
1.4. Méthode de modélisation par homologie: Swissmodel et Modeller...83
1.5. Méthode d’analyse de contraintes angulaires : Procheck...83
1.6. Méthode de détection de sites d’interaction: RBD (Gallet et al, 2001)... 83
1.7. Méthode de prédiction d’épitopes...84
1.8. Méthode de prédiction de peptide signal : Signal?... 84
1.9. Méthode de recherche de motifs...85
1.10. Prédiction d’acides aminés impliqués dans des interactions entre deux protéines différentes... 85
2. Expression d’iris en système baculovirus...85
2.1. Clonage...85
2.2. Cellules d’expression : les SF9... 85
2.3. Isolation et amplification d’un virus recombinant exprimant Iris... ... 86
2.4. Expression et Purification d’iris... 86
3. Construction et Expression des mutants d’iris... 86
4. Production d’anticorps... 87
4.1. Les animaux...87
4.2. Production d’anticorps par injection de protéine Iris recombinante...87
4.3. Production d’anticorps anti-peptidiques... 88
4.4. Purification des anticorps anti-iris... 88
4.5. Evaluation des titres des anticorps par la technique ELISA... 89
4.6. Evaluation du potentiel des anticorps anti-iris à bloquer l’activité d’iris... 89
5. Caractérisation in vitro de l’activité anti-protéasique d’iris...90
5.1. Mesure des pourcentages d’inhibition de différentes protéases... 90
5.2. Mesure des constantes d’affinité d’iris pour différentes protéases... 90
6. Caractérisation de l’activité d’iris dans les mécanismes de l’hémostase... 92
6.1. Mesure du temps d’adhésion plaquettaire... 92
6.2. Mesure des temps de coagulation...92
6.3. Mesure du temps de fibrinolyse...92
6.3.1. Préparation des neutrophiles...92
6.3.2. Mesure du temps de lyse du caillot d’euglobulines (ECLT)... 93
7. Rôle d’iris dans les mécanismes de l’inflammation... 93
7.1. Dosage des cytokines... 93
7.2. Actions d’iris purifiée et de ses mutants sur la production de cytokines par les PBMCs (Peripherical Blood Monocytes Cells)...94
7.2.1. Récolte des PBMCs... ... 94
7.2.2. Production de cytokines sur une culture de PBMCs...94
8
7.3. Détermination du ou des types cellulaires interagissant avec Iris...95
7.3.1. Utilisation du Facs_...95
7.3.1.1. Marquage de la protéine Iris recombinante... 95
7.3.1.2. Mise en contact d’iris marquée avec des PBMCs humaines...95
7.3.2. Utilisation de la lignée cellulaire de monocyte THPl... 96
8. Importance d’iris dans le repas sanguin de la tique et approche vaccinale... ... 96
8.1. Les animaux...96
8.2. Analyse de l’expression in vivo d’iris... 96
8.2.1. Récolte de la salive...97
8.2.2. Extrait protéique de glandes salivaires... 97
8.2.3. Western blot_...97
8.2.4. Production d’anti-sera dirigés contre la salive de tiques,...97
8.2.5. Extraction d’ARN et analyses par RT-PCR ...98
8.3. Détermination de l’importance d’iris chez la tique par approche vaccinale...98
8.3.1. Mise en contact de nymphes d’I. ricinus avec des souris immunisées par riris...99
8.3.2. Mise en contact de nymphes d’I. ricinus avec des lapins immunisés par riris...99
8.3.3. Mise en contact de femelles d’I. ricinus avec des lapins immunisés par riris... 100
Analyses statistiques... 100
BIBLIOGRAPHIE__________________________________________________________ 101
ANNEXES_____________________ ____________________________________ 111
Liste des abréviations
AAPVCK: Ala-Ala-Pro-Val Chlorométhyl Kétone ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire AM (D, T) P : Adenosine Mono- (Di-, Tri-) Phosphate ARNm : Acide RiboNucléique messager
ARNr : Acide RiboNucléique ribosomial BCT ; Behring Coagulation Timer
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool BmAP ; Boophilus microplus Anti-Protease CHO : Chinese Hamster Ovary
DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium ECLT ; temps de lyse du caillot d’euglobulines EDTA. Acide éthylène-diamine-tétraacetique ET.H Elastase de leucocyte humain
EPP : Elastase pancréatique de porc
F ; Facteur
F3P : Facteur 3 des plaquettes
FACS : Flow cytométrie Analysis and Cell Sorting FBS : Fœtal Bovine Semm
FITC ; Fluoresceine Iso Thio Cyanate FT ; Facteur Tissulaire
fVW : facteur de von Willebrand
GP : GlycoProtéine
GVB : Gelatin veronal buffer HBE : Heparin Binding Exosite HBSS : Hank's BufFered Sait Solution HCA: Hydrophobie Cluster Analysis HLS : Haemaphysalis longicomis Serpin IFN ; Interféron
Ig: Immunoglobuline
IL . Interleukine
Iris : Ixodes ricinus immunosuppressor
1RS : Ixodes ricinus Serpin
Isac ; Ixodes scapularis anti-complement Ixac : Ixodes ricinus anti-complement KLH: Keyhole limpet hemocyanin LPS : Lipopolysaccharide
MMP : metalloélastase NO ; Monoxyde d’azote
OmCI : Ornitodoros moubata Complément Inhibitor PAF : Platelet Activator Factor
PA-I ; Plasminogen Activator - Inhibitor PBMC : Peripherical Blood Mononuclear Cells PBS ; Phosphate BufFer Saline
PCR: Polymerase Chain Reaction PDB; Brookhaven Protein Data Bank PDF : Produits de Dégradation de la Fibrine PFA: Platelet Fonction Analyser
Pen/Strep : PG;
Pénicilline / Streptomycine Prostaglandine
PMA : Phorbol 12-Myri State 13-Acetate
PTT-A : Partial Thromboplastin Time - Activator
RaHBP : Rhipicephalus appendiculatus Histamin Binding Protein RBD : Receptor Binding Domain
RCL : Reactive center loop
RT-PCR ; Rétro Transcription and Polymérisation Chain Reaction riris : Iris recombinante
RPMI : Roswell Park Memorial Institute
SDS-PAGE : Somium DodecylSulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Serpin :
SHBP :
SERine Protease INhibitor
Sérotonine Histamine Binding Protein SVF : Sérum Foetal
TAFI : Thrombin Activable Fibrinolysis Inhibitor TAP ; Tick Anticoagulant Peptide
TBE ; Tri s-B orate-EDT A
TCI : Tick Carboxypeptidase Inhibitor
TFPI : Tissue Factor Pathway Inhibitor
Th ; TMB : TNF ; t-Pa : u-Pa : VB :
T helper
3,3’,5,5’ TetraMethylBenzidine Tumor Necrosis Factor
activateur tissulaire du plasminogène urokinase (activateur du plasminogène) Veronal buffer
12
INTRODUCTION
INTRODUCTION
13
Prostriata Ixodinae
Ixodidae
Tiques ou Ixodinae
Nuttalleilidae
Argasidae
Uetasiriata
AmMvomminae Haemaphvsalinae
Hvalomminae
Rhipicaphalinae
Omithodoros
Argasinae
Ixodes Amblyomma Aponomma
Haemaphysafis Hyalomma Dermacentor Cosmiomma Nosomma Rhipicephalus Anomalohimalaya Rhipicentor Boophilus Margaropus Nuîtatilelia Otobius Antricola Nothoaspis Argas
Figure 1 : Phylogénie de; familles, sous-familles et genres des tiques Ixodidae, Argasidae et Nutallelidae.
Fleure 1 : Classification et Phyloeénie des tiques. Cette classification est construite selon celle proposée
par Hoogstraal et Aeschlimann (1982), sur base de la morphologie et des interactions avec l'hôte. La
longueur des branches ne dorme aucune indication concernant l’importance des taxons et leur parenté.
1. Présentation du parasite
1.1. Généralités sur les tiques
Les tiques sont des arthropodes ectoparasites obligatoires qui se nourrissent sur une grande variété de vertébrés (incluant les oiseaux, les mammifères et les reptiles) sur une large partie du globe (Sauer étal, 1995). Les tiques comptent parmi les plus importants vecteurs de maladies humaines et animales. En effet, la diversité des organismes pathogènes qu’elles transmettent inclut virus, bactéries, protozoaires et nématodes, et excède celle des organismes transmis par les autres arthropodes hématophages (Sonenshine, 1991).
Les tiques appartiennent à l’ordre des Acariens et se divisent en 3 familles (figure 1);
les tiques dures (Ixodidae) présentant dorsalement un scutum sclérotisé, les tiques molles (Argasidae) sans scutum, et les Nuttaliellidae représentés par une seule espèce (Nuttalilela namaqua) qui montre des caractères particuliers intermédiaires. Cette classification fondée sur la morphologie a été récemment confortée par des critères moléculaires, notamment pai l’utilisation de trois gènes mitochondriaux : l’ARNr 12S, l’ARNr 16S et le gène codant pour la cytochrome C oxydase I (Barker étal, 2004)
1.2. Les tiques : vecteurs de pathogènes
Certaines espèces sont directement responsables de pertes économiques substantielles dans le domaine de la production de viande, de cuir et de laine (Steelman, 1976 ; Mulenga et al., 2001), soit en raison d’infestations massives, comme dans le cas de Boophilus microplus en Australie (Johnsson et al, 2001), soit à cause de substances toxiques, généralement paralysantes, contenues dans leur salive (Gothe et al, 1979 ; Roberts et al, 2000), à l’exemple dl’Ixodes rubicundus en Afrique du Sud (Spickett et Heyne, 1988). Cependant la majorité des tiques d’importance économique et médicale le sont au rang de vecteurs d’agents pathogènes pour le bétail, et se trouvent en 2®“® position derrière les moustiques en ce qui concerne la transmission de parasites à l’homme (Balashov, 1972 ; Sonenshine, 1991).
Approximativement 10% des espèces de tiques connues agissent comme vecteurs de pathogènes. Par exemple, la borréliose de Lyme est la pathologie - véhiculée par les tiques - la plus répandue dans l’hémisphère nord, provoquant plus de 10.000 nouveaux cas chaque année en Europe et en Amérique du Nord (Jongejan et al, 2004)
14
Fleure 2 : Les différents stades du cycle bioloeÎQue de la tique Ixodes ricinus. A ; larve. B : nymphe. C :
femelle adulte. D : mâle adulte. Les tiques sont octopodes, exception faite de la larve qui est hexapode. La
différenciation sexuelle ne se fait qu’au stade adulte. Ces photos ont été prises à l’Institut de Zoologie de
Neuchâtel et généreusement mises à disposition par le Prof Michel Brossard.
La lutte contre les tiques et leurs pathogènes est aujourd’hui coûteuse et souvent peu efficace. En 2004, le coût économique mondial a été évalué à 7 milliards d’euros. Le moyen le plus utilisé actuellement est l’emploi d’acaricides Cependant, cette méthode présente un certain nombre de désavantages comme la pollution chimique de la chaîne alimentaire et de l’environnement, et l’apparition rapide d’une résistance des tiques aux acaricides (Shapiro et al, 1986) Des méthodes alternatives ont été développées et sont décrites par différents auteurs (Sonenshine, 1993 ; Brossard, 1998 ; Willadsen 2004). Ces méthodes incluent la sélection d’animaux résistants génétiquement ou encore le contrôle biologique des tiques par utilisation de phéromones. Cependant, au regard de la faisabilité et de l’efficacité de toutes ces méthodes, seule la vaccination ouvre des perspectives intéressantes. En effet, l’immunité d’un hôte contre les tiques peut être acquise par l’infestation naturelle par les tiques ou par l’immunisation artificielle avec des antigènes de tiques. Cette immunité affecte le repas, la reproduction et la survie de la tique (Barriga, 1999 ; Wikel, 1996). En effet, la réponse humorale joue entre autres un rôle très important dans les mécanismes de défense de l’hôte et dans l’acquisition de la résistance contre les tiques (Ackerman and Skinner, 1981 ; Roberts and Kerr, 1976 ; Wikel and Allen, 1976). Le développement de nouveaux vaccins dépend de l’identification et de la caractérisation des molécules candidates (Wikel, 1996 ; Kay and Kemp, 1994 ; McKenna et ai, 1998 ; Opdebeeck, 1994 ; Wikel, 1988). Les recherches actuelles se tournent plutôt en direction des protéines salivaires ou intestinales. Une réponse immunitaire efficace contre des protéines essentielles pour le développement de la tique pourrait empêcher la prise de sang au cours du repas et aussi la transmission de pathogènes (Kovar, 2004). Si plusieurs vaccins sont en cours de développement sur différents genres de tiques comme Rhipicephalus^ Amblyomma, Haemaphysalis (Mulenga, 2000 ), un seul vaccin a été commercialisé à ce jour. Ce dernier - restreint à l’usage vétérinaire - est dirigé contre l’espèce Boophilus microplus (Tick GARD). Il a été élaboré à partir de deux protéines intestinales, Bm86 et Bm95. Cependant, ce vaccin s’utilise en association à des acaricides (Garcia-Garcia et al, 2000) et son efficacité limitée ne permet qu’une régulation modérée de la population de tiques proches des animaux vaccinés (De la Fuente et al, 2000).
1.3. Cycle de vie des Ixodidae
Le cycle de vie des Ixodidae comprend trois stades uniques de développement (larvaire, nymphal et adulte) (figure 2). Chaque stade passe par une phase libre et une phase parasitaire durant laquelle la tique se gorge de sang de différents hôtes, parmi lesquels des
15
Les lar\'es se nourrissent sur l'hôte n°l
Les lars'cs cherchent un nouvel hôte
Les œufs éclosent en larv es ♦
Les lanxs nourries tombent de l'hôte
Les femelles se fixent et se nourrissent sur l'hôte n°3
Les femelles pondent leurs œufs et meuieni
Les femelles gorgées se décrochent de l'hôte
Les larves muent en nymphes
Hôte n°2
Les larves se fixent et se nourrissent sur l’hôte n°2
Les nymphes muent en adultes
Fleure 3 : Cycle de vie des Ixodidae. La taille relative des animaux représente approximativement leur importance en tant qu’hôte pour les différents stades de la tique, dans un habitat boisé classique.
Fleure 4 : site de morsure. A Schéma illustrant le site de morsiu-e^ Lors de la morsure, la tique insère un
hypostome denté dans le derme de l'hôte. Elle se maintient grâce aux pédipalpes qui permettent l'accrochage
aux tissus de l'hôte et aux chélicères qui lacèrent les tissus. B Hypostome (brun sur la photo) d'une tique
femelle adulte gorgée à 5 jours inséré dans la peau d'une souris. Coupe histologique réalisée par Mme
Menten-Dedoyart Catherine, du Laboratoire d’histologie humaine de l'Université de Liège (Professeur Emst
Heinen), dans le cadre d'ime collaboration avec le Service de Génétique Appliquée (IBMM, Gosselies).
mammifères, des oiseaux et des reptiles (figure 3). Le degré de spécificité dépend des espèces. Chez certaines espèces, les étapes juvéniles (larvaire et nymphale) ou tout le cycle de vie se déroulent sur le même individu ; leur cycle est alors dit à 1 ou 2 hôtes (mono ou diphasique). Néanmoins, certaines espèces, comme I. ricinus, possèdent un cycle de vie à 3 hôtes (triphasique). Après avoir trouvé un hôte, la tique s’y fixe à l’aide du rostre (ensemble formé par deux chélicères et un hypostome) et débute son repas sanguin afin d’acquérir les nutriments nécessaires à son métabolisme (figure 4). Le repas sanguin débute par une
« phase lente » qui dure plusieurs jours. Durant cette période, les prises de sang sont ponctuées par de longues périodes d’inactivité et de salivation. Puis, vient la « phase rapide », de 12 à 24h, pendant laquelle la tique absorbe la majorité de son repas et son poids va augmenter très fortement (jusqu’à 100 fois selon les espèces) (Sauer et al, 1995 ; Sonenshine, 1991). A la fin du repas, la tique reste sur l’hôte ou se laisse tomber au sol, puis, après une période de digestion, effectue la mue ou la ponte pour donner le stade suivant. Il est à noter qu’aux stades immatures, il n’est pas possible de différencier sur base de leurs morphologies externes les mâles des femelles. Il n’y a donc qu’au stade adulte que l’on dénomme les tiques par leur genre.
Après avoir pondu ses œufs, la femelle meurt (Sauer ei al, 1995 ; Sonenshine, 1991).
Le cycle est donc la succession de phases libres exogées (recherche de l’hôte), de phases parasitaires et de phases libres endogées (diapause, morphogénèse et développement).
1.4. Ixodes ricinus
I. ricinus est la tique la plus répandue en Europe septentrionale. Elle colonise les milieux abrités à hygrométrie élevée (forêts, bosquets, haies) jusqu’à une altitude de 1200m en Suisse (Aeschlimann, 1972). Son repas sanguin dure environ 3 jours pour la larve, 5 jours pour la nymphe et 7 à 14 jours pour la femelle Au terme de cette période, son poids aura centuplé. Les mâles ne se nourrissent généralement pas, ou tout au plus, ils absorbent de faibles quantités de sang pendant de courts intervalles de temps.
Dans leur environnement naturel, la durée du cycle de vie des différentes espèces de tiques est variable. Pour I. ricinus, ce cycle se déroule en général en 3 années. Dans des conditions de milieu optimales (hôtes à disposition, température à 25°C, humidité > 85 %), obtenues en laboratoire, la durée du cycle de vie de la tique peut être réduite à moins d’une année.
16
2. La salive et ses facteurs
2.1. Les facteurs bioactifs
Au cours de son repas, la tique prélève de grandes quantités de sang. Le repas sanguin des tiques est en soi un processus long et complexe au cours duquel les tiques sont confrontées aux différents mécanismes de défense des hôtes parasités. Lorsque l’intégrité des épithélia, qui isolent l’organisme du milieu extérieur, est perturbée par rupture ou déchirure, différents mécanismes sont activés. Chez les mammifères, les premières lignes de défense systémique sont la réponse immune innée et les mécanismes de l’hémostase, caractérisés par l’agrégation plaquettaire, la coagulation du sang et l’inflammation. Par la suite, la réponse immune adaptative prend le relais de la réponse innée. L’ensemble de ces mécanismes participe au maintien de l’intégrité de l’organisme
La glande salivaire de la tique joue un rôle essentiel dans l’accomplissement du repas sanguin. Au cours de ce repas, la synthèse d’ARN messagers y est stimulée et de nouvelles protéines sont exprimées et peuvent être sécrétées dans la salive (Leboulle et al., 2002, Das et al, 2002).
Afin d'accomplir leur repas sanguin, les tiques expriment un éventail de constituants bioactifs (cément, enzymes, inhibiteurs enzymatiques,...) parmi lesquelles des vaso
dilatateurs, des inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire, et des anticoagulants (Champagne et al, 2004 ). La salive et les extraits de glandes salivaires de tique sont également connus pour moduler les mécanismes de défense de l’hôte (Ribeiro et al, 1995 ; Kopecky et al, 1998 ; Wikel, 1996 ; Leboulle et al, 2002 ; Brossard et Wikel, 2004). Des composés anti
hémostatiques et immunosuppresseurs ont été identifiés, isolés, et caractérisés chez des tiques molles et dures. Ces composés incluent des lipocalines ayant la capacité de fixer l’histamine, des inhibiteurs de protéase comme des homologues du TFPI et de l’anti-thrombine, et des facteurs anti-complément (Hoffmann et al, 1991 ; Hom et al, 2000 ; Francischetti et al, 2002 ; Lai et al, 2004 ; Law et al, 1992 ; Iwanaga et al, 2003 ; Waxman et al, 1990 ;
Sangamnatdej et al, 2002 ; Valenzuela étal, 2000 ; Ribeiro, 1987).
La salive est également la source principale d’immunogènes de la tique. Ainsi Das a
trouvé 14 antigènes immunodominants en criblant une banque d’ADNc de glandes salivaires
à'Ixodes scapularis (Das et al, 2001). Dans cette voie, plusieurs laboratoires ont rapporté la
construction et le criblage des bibliothèques d'ADN des glandes salivaires de tique. Le service
Pn)téa.scs Mécanismes
Sérine protéases
La classe des protéases à sérine est composée des protéases dont la trbde catal>tique est définie par les acides aminés histidine (Hi. acide glutamique lE) et sérine (S). Le groupement hydroutyl de la sérine agit comme un site nuclév>phile en initiant la formation de i'intermédiaire en/ymaiique acylé.
CystéiiK' protéases
Les pri>téases à c)-sléin<;. nommées aussi thiol protéases, sont des protéases dont k mode de rotKÙonnenKm est analogue au.x protéases à sérine. Leur triade calalvnique est composée des acides anunés asparaguic (Ni. hislidme (Hi ei cystéine (C). Lors de fhydrolyse prokolytmue. k groupement soufré de la cystéine agit comme k site iiucléophik en initiant l'attaque du groupement carboxyl du substrat.
Asparlyl protéases
Cette classe est composée de protéases dont k site calalyliqtie est formé de 2 acides glutamiques (El L'hydrolyse protéolytique procède d'une rcaelion acido-basique. Conuaia-nKtni aux 2 classes précédentes, fc mécanisme de coupure protéolytique ne nécessite pas k passage par un intermédiaire enzymatique aeyk .
Métallo-protéases
Les mciallo-protéascs présentent un ion divalent, souvent Zn^. au niveau du site catalytique. Par ailleurs, au nxùns une hislidine (H) et un acide gluuniique (El sont impliquas. L'hislidine permet la coordination de l'ion mélanique qui conduit à l'attaque nuckophile pendant laquelle l'acide glutamique a un rôk de donneur d'ékctroa
Tableau 1 : Les différents types de protéases. Les protéases hydrolysent les protéines au niveau de sites internes spécifiques. La spécificité de la réaction est basée sur la nature des acides aminés de l'enzyme formant la poche catalytique, et donc, interagissant avec les acides aminés du substrat. Cette spécificité détermine la classification des protéases.
1
MEASLSNHIL NFSVDLYKRL KPSGKDTAGN VFCSPFSIAA ALSMALAGAR.SI
GNTAKQIAAI LHSNDDKIHD HFSSFLCKLP SYAPDVALHI ANRMYSEQTFloi
HPKAEYTTLL QKSYDSTIKA VDFAGNADRV RLEVNAWVEE VTRSKIRDLL151
APGTVDSSTS LILVNAIYFK GLWDSQFKPS ATKPGDFHLT PQTSKKVDMM201
HQKGDFKMGH CSDLKVTALE IPYKGNKTSM VILLPEDVEG LSVLEEHLTA251
PKLSALLGGM YVTSDVNLRL PKFKLEQSIG LKDVLMAMGV KDFFTSLADL.301
SGISAAGNLC ASDIIHKAFV EVNEEGTEAA AATAIPIMLM CA.RFPQWNF.351
FVDRPFMFLI HSHDPDWLF MGSIREL*Heure 5 : Séquence peptidique d’iris. La séquence d’iris, longue de 377 aa, présente
plusieurs zones hautement conservées chez les serpines : le motif « serpine » (code Prosite
PS00284) surligné en jaune, le RCL (Reactive center Loop) indiqué en vert et un domaine
hautement conservé recouvrant le feuillet p A, nommé domaine s3 A, représenté en bleu.
de Génétique Appliquée a identifié au cours du crible d’une banque soustractive d’ADN complémentaires - issus de la rétro-transcription des ARN messagers synthétisés par les glandes salivaires de la tique I. ricinus (au jour 5 du repas et à jeun) - 27 protéines pour lesquelles l'expression est spécifiquement induite ou régulée positivement pendant le repas sanguin d’7. ricinus (Leboulle et al., 2002). Ces protéines ont été nommées successivement Seqlà Seq27.
2.2. Les inhibiteurs de protéases
Parmi les molécules de tique les plus décrites, on distingue les inhibiteurs de protéases. Les protéases sont des endopeptidases classées en quatre grandes familles: les sérine-protéases, les cystéine-protéases, les métalloprotéases et les aspartyl-protéases. Elles sont classées par rapport à leur mode de fonctionnement. Ces critères sont regroupés dans le tableau 1. Chacune de ces familles possèdent des inhibiteurs qui lui sont propres.
Dernièrement, Ribeiro et al. ont exploré le slalome de la tique I. scapularis (Valenzuela et al., 2002 ; Ribeiro et al., 2006) et ont identifié plusieurs inhibiteurs de protéase à sérine contenant les motifs de serpine, de kunitz, kazal ou de l’a-macroglobuline (Kanost, 1999). Quelques serpines ont été récemment isolées chez les tiques dures ; BmAP chez B.
microplus, HLSl et HLS2 chez Haemaphysalis longicornis, et RAS 1 à 4 chez Rhipicephalus appendiculatus (Hom et al., 2000 ; Imamura et al., 2005 ; Mulenga et al., 2003 ; Sugino et al., 2003). Ces protéines sont exprimées dans les glandes salivaires. Parmi ces protéines, seules BmAP et HLSl et 2, ont été caractérisées comme inhibiteurs de thrombine. D’autre part, les protéines HLSl et 2, ainsi que RASl et 2, ont été proposées comme composant d’un vaccin anti-tique (Mulenga et al., 2001 ; Mulenga et al., 2000 ; Narasimhan et al., 2004).
Enfin, 4 serpines ont été récemment identifiées chez I. ricinus (non publié). Il s’agit des protéines IRS-1, IRS-2, IRS-4 et IRS-8, disponibles dans la banque de données NCBI (correspondant respectivement au numéro d’accès : ABI94055, ABI94056 ; ABI94057 ; ABI94058) mais elles n’ont cependant pas été caractérisées.
2.3. Iris
Parmi les protéines découvertes au laboratoire (Leboulle et al, 2002), la protéine
Seq24 (figure 5), longue de 377aa et induite au cours du repas sanguin de la tique, possède
une homologie significative pour des protéines appartenant à la famille des inhibiteurs de
Invasion de cellules lumorales
Facteurs neiuotrophiques
PHiF(srRPiNHi
ncufüscT^in <StRPIN| 1 » PM <SFRPINF2»
Maladie d'Alzheimer
itlACl (Si Rl'ISAliTranspon homional
DéveloppeiiKnt
Al.l (SI RPINASi mçgsin (M Rl'ISir IDéveloppement du sperme
Pt l (SLRPL\A5 'Coagulation
Maintenance et lemodelage MEC
Pt, I «St RPINAS»
Intlammation et activation du complément
Régulation de la pression sanguine
AtiT (SfcRPINASiangiogenese
fibrinolyse
apoptose
Infection microbienne
ccntcnn (SI RPISA*)!
( I InMSFRPINOI) ov-vcrpim (StHPINB*)"
Fleure 6 : Représentation de l’importance des serpines dans les mécanismes phvsioUKiaues du corps humain. Les
fonctions dans lesquelles les serpines sont impliquées sont en noires. Les serpines dont la fonction principale semble
directement liée à une inhibition de protéase sont en rouge. Les serpines non inhibitrices et celles dont le mécanisme
n’est pas encore défini sont en vert. (Figure extraite de Silverman et al, 2001)
sérine protéases (l’inhibiteur d’élastase de leucocytes de porc et un inhibiteur de thrombine humaine). L’analyse de la séquence de la protéine Seq24 montre qu’elle possède un motif particulier des serpines, inhibiteurs de sérines protéases (figure 5). Il est donc fort probable que Seq24 soit un inhibiteur de sérine protéase. Leboulle et al. ont montré la capacité de Seq24 à inhiber la prolifération des lymphocytes T et à moduler la réponse immunitaire en favorisant une réponse TH2. Ils ont aussi démontré la capacité de Seq24 recombinante semi- purifiée (exprimée en CHO-Kl) à inhiber la production de TNF-a, d’IL-6, et d’IL-8 (cytokines proinflammatoires) ainsi que l’IFN-y par des PBMCs (Peripherical Blood Monocytes Cells) humaines. Sur bases de ces données, la protéine Seq24 a été appelée Iris pour « Ixodes ricinus hrimunosuppressor ».
3. Les serpines (SERine Protease INhibitor)
3.1. Généralités
Les serpines sont des inhibiteurs de serine protéases impliquées dans de nombreux processus biologiques fondamentaux tels que la coagulation du sang, l'activation de complément, la fibrinolyse, l'angiogénèse et l'inflammation (Davie et al, 1991 ; Hekman et al, 1987; Rubin, 1996) (figure 6). A ce jour, approximativement 500 serpines ont été identifiées, chez une grande variété d'espèces comprenant des animaux, des virus et des plantes. Elles comprennent des serpines de type extracellulaire et intracellulaire (van Gent et al., 2003). Dans le plasma humain, les serpines représentent approximativement 2% de la masse protéique.
3.2. Structure
La taille moyenne d’une serpine est de 350 à 400 acides aminés. La structure des serpines est relativement bien conservée (Silverman, 2001). Elle est caractérisée par 3 feuillets 3 et 8 ou 9 hélices a (figure 7a).
Du point de vue de la séquence, certaines zones sont typiques des serpines. Hormis la
séquence signature des sepines (code PROSITE n° PS00284) ([LIVMFY] - {G} -
[LIVMFYAC] - [DNQ] - [RKHQS] - [PST] - F - [LIVMFY] - [LIVMFYC] - x -
[LIVMFAH]), on observe une zone très conservée recouvrant le feuillet-P A (zone nommée
Figure 7; Structure des Serpines, a : état natif, b : état clivé, c ; état latent, d : état D. e : état polymérisé. Le feuillet (3-
A est représenté en rouge. Le feuillet (3-B est représenté en vert. Le feuillet p-C est représenté en jaune. Les hélices a
sont en bleu et le RCL en rose. (Irving et al., 2000)
s3A en conséquence) et une région essentielle pour le mécanisme inhibiteur des serpines, le Reactive Center Loop (RCL), proche de la partie C-terminale de la serpine. Ces séquences
sont représentées pour la molécule Iris sur la figure 5.
3.3. Mécanisme d’action des serpines
Afin d’inhiber les serine protéases, les serpines interagissent avec ces dernières comme substrat. La sérine protéase crée un lien covalent entre la sérine de son site actif et un acide aminé de la protéine cible (dans notre cas, la serpine), et clive cette dernière. La région de la serpine interagissant avec la protéase est le domaine RCL. Schechter et Berger ont assigné une nomenclature spécifique au RCL : la notation P. Elle commence au résidu précédant l'emplacement du clivage (PI) et annote l'ordre en direction de l’extrémité N- terminale (Schechter et Berger, 1967).
Après le clivage, le RCL est déplacé et s’insère dans le feuillet P-A. Cette transition est énergiquement favoiable . c’est la tiansition entre un état métastable et un état stable de la protéine. L'état clivé (figure 7b) est deux fois plus stable que la conformation native (Huntington et Carrell, 2001). Le changement de conformation est permis grâce au domaine Hinge, qui fournit la plasticité nécessaire à la structure. H correspond à la partie P15-P9 du RCL. Le domaine Hinge est très conservé chez les serpines inhibitrices. PIS est habituellement une Glycine, P14 une Thréonine ou une Sérine et les positions P12-P9 sont occupées par des résidus possédant des chaînes latérales courtes, telles que l'Alanine, la Glycine, ou la Sérine. La présence de ces résidus peut expliquer la plasticité de la charnière Hinge (Callebaut et al, 1994).
Les domaines Hinge et RCL sont essentiels au fonctionnement de la serpine. De nombreuses mutations naturelles ont été identifiées dans ces régions dont quelques exemples sont répertoriés sur le site suivant : http://www-stmctmed.cimr.cam.ac.uk/Serpins/. Ces dernières augmentent la propension à la polymérisation, menant à des dysfonctionnements et au développement de certaines maladies tels que des perturbations de la coagulation, l’emphysème pulmonaire, la cirrhose et la démence (Irving et al, 2000).
Dans une réaction classique, la protéase se libère de son substrat. Cependant lorsque ce dernier est une serpine, l'insertion du RCL qui s'ensuit va l'empêcher de se libérer. En effet, lors de cette insertion, le RCL doit emmener avec lui les résidus du site actif de la protéase.
Ceci entraîne une déformation, une dénaturation du site actif de la protéase. Une fois la
protéase déformée, elle n'est plus active. L’ensemble du mécanisme d’activité des serpines est
Figure 8 : Mécanisme d’inhibition suicide d’une protéase par une serpine. A ; Une serpine avec le résidu PI
représenté en vert. B ; Une protéase rentre en contact avec la serpine. C : Clivage du RCL (vert). D : Déplacement du
RCL dans le feuillet P-A (en rouge) et déformation de la protéase.
représenté sur la figure 8. A l’issue de cette réaction, la protéase ne peut plus se libérer et la serpine est clivée. Dans ce cas, les deux protéines perdent leur fonction. On parle d’un mécanisme de t5fpe « double-suicide ». Les deux protéines restent liées de façon covalente.
Dans cet état, la protéase est beaucoup plus susceptible à la protéolyse qu'en temps normal (Huntington et al, 2000). Le complexe protéase-serpine obtenu est très stable et peut persister pendant plusieurs mois ou même plusieurs années in vitro.
Sur le plan réactionnel, quand la protéase clive la liaison peptidique PI-PI’ du RCL, elle forme un état tétraédrique de transition (figure 9). Une liaison covalente lie le carbone Cl du substrat et le groupe hydroxyle d'un résidu réactif de la sérine de l'enzyme. Ce stade s'appelle le complexe acyle-enzyme intermédiaire. Pour cliver la serpine, la protéase inverse la deuxième étape de la protéolyse. Elle empêche ainsi la déacylation du complexe acyle- enzyme. La déacylation est l'inverse de l'étape d'acylation, avec l'eau dans le rôle du groupe NH2 du substrat de polypeptide (figure 9) (Branden et Tooze, 1991). La déacylation est inhibée par une déformation de l'emplacement catalytique de la protéase. Ceci a pour conséquence la destruction de ce site. Par contre, si l'insertion du RCL n'est pas ass^z rapide pour concurrencer la déacylation, la serpine est clivée et il n'y a aucune inhibition (Zhou et al, 2001).
Quelques serpines transitent, sans clivage, vers un état stable. L’insertion du RCL non clivé dans le feuillet P-A mène à l’état latent de la serpine (figure 7c). Deux autres conformations ont été découvertes grâce à la cristallographie : l’état « D » et l’état de polymérisation (respectivement représentés sur les figures 7d et 7e). L’état « D » est un état où le RCL est dans une conformation intermédiaire entre la forme native et la forme latente. La pol5onérisation est la conséquence de l’insertion du RCL clivé dans le feuillet P-A d’une autre serpine (Irving et al, 2000).
3.4. Les serpines sans activité inhibitrice
Certaines serpines n'ont aucune fonction inhibitrice, telles que des chaperones et des
protéines de transport d'hormone (Irving et al, 2000). Chez ce type de serpine, un centre
réactif putatif peut être, en général, aisément identifié par alignement avec les serpines
inhibitrices typiques. Cependant, certains acides aminés des régions correspondantes à ce
centre réactif putatif dévient du consensus décrit par Irving (2000). En conséquence, la
A(^l3tion Tetrahedral transition State Peptide siibstmte
j HC—
: I
Acyl-enzyme intermediate
Déacylation
Acyl-enzyme intermediate Tetrahedral transition state
HC—R I
i ^
N-ter peptide releatedFieure 9 : Mécanisme des protéases à sérine. Acylation. 1 : La classe des protéases à sérine est composée des
protéases dont le site catalytique est défini par les acides aminés histidine (H), acide glutamique (E) et sérine (S). Le
substrat est représenté en rouge. 2 : Le groupement hydroxyl de la sérine agit comme un site nucléophile en initiant la
formation de l'intermédiaire enzymatique acylé. 3 : Le site His de la protéase transfère le proton sur le peptide tronqué
nouvellement formé et libre de se dissocier de la protéase. Déacylation. Le complexe acyl-enzyme est hydrolysé par
l’eau et la protéase récupère sa structure d’origine.
structure perd sa rigidité et s’enroule en hélice a, induisant la perte de mobilité du RCL putatif.
D’autres serpines sans activité conservent la mobilité du RCL. Cependant, ces protéines, comme l’ovalbumine, ne sont pas capables d’être clivées. Ceci explique pourquoi l'ovalbumine ne montre aucune activité inhibitrice en dépit de son homologie avec les inhibiteurs fonctionnels de la famille de serpines (Huntington et Stein, 2001).
4. L’hémostase
Chez tous les vertébrés, le sang circule en circuit fermé sous une pression relativement élevée. L'hémostase est l'ensemble des réactions biologiques permettant la formation d'un caillot sanguin lors d'une brèche vasculaire. Il s'agit d'un mécanisme de défense naturel empêchant des troubles de la circulation sanguine (hémorragies ou thromboses). Elle met en jeu un ensemble de phénomènes interdépendants, mécaniques, physico-chimiques, biochimiques et enzymatiques. Elle nécessite la coopération entre la paroi vasculaire, des protéines plasmatiques et les cellules sanguines.
Au cours de son repas, la tique prélève de grandes quantités de sang. Afin de faciliter ce repas, elle maintient le sang à un état fluide et empêche la réparation des vaisseaux endommagés. La tique contourne donc les mécanismes de l’hémostase.
L’hémostase est divisée en plusieurs étapes qui se recouvrent partiellement. Pour des raisons didactiques, on distingue ;
- L’hémostase primaire, qui dure de 3 à 5 minutes, comprend la formation d’un agrégat plaquettaire.
- L’hémostase secondaire, qui dure de 5 à 10 minutes, permet la consolidation de cet agrégat par de la fibrine.
- La fibrinolyse permet en 48 à 72 heures la dégradation du caillot et le retour à une
circulation sanguine normale.
Fleure 10 : Formation du clou plaQuetttüre : rhémostase primaire. (A) ; Vaisseau dans les conditions normales. (B) Le phénomène d'agrégation plaquettaire débute à l'endroit d'une lésion vasculaire, lorsque les plaquettes contenues dans le plasma s'activent et se lient au collagène sous-endothélial pour obstruer le site de la lésion. (C) Cette interaction, appelée temps d’adhésion plaquettaire, est l'étape primordiale de l'agrégation plaquettaire qui se poursuit par (D) la formation de ponts moléculaires multiples entre des molécules d'adhésion et entre différentes cellules (plaquettes, cellules endothéliales, leucocytes, ...) présentes au site de la lésion, poin former le clou plaquettaire ou thrombus blanc. Les plus importantes molécules d'adhésion sont le fibrinogène, le facteur de von Willebrand, la fibronectine, et la vitronectine. Ces molécules, contenues dans les granules de sécrétion des plaquettes, sont sécrétées durant l'agrégation. De plus, elles circulent dans le plasma et sont contenues, à l'exception du fibrinogène, dans le sub
endothélium.
cellule endotliéliale
Sous-endothélium fibrinogène
plaquette
Facteur de
\ on Willebrand
^ = récepteur GPTIb/ITTa GPlb/IX
Fleure 11 : mécanisme moléculaire de l’aeréeation plaquettaire L’agrégation plaquettaire se déroule en trois temps.
Le temps vasculaire : au site d’une lésion vasculaire, le sous-endothélium, mis à nu, présente des molécules de
collagène, et les cellules endothéliales libèrent du vWF qui s’adhère au sous-endothélium. L’adhésion plaquettaire : les
plaquettes adhèrent alors au sous-endothélium via les GP la-lla et IblX qui se lient respectivement au collagène et au
vWF. L’agrégation plaquettaire : les plaquettes s’agrègent entre elles grâce aux molécules GP llb-llla qui s’associent
au fibrinogène.
4.1. L’hémostase primaire (modifier la présentation pour ne pas avoir un début de chapitre en fin de paee)
L’hémostase primaire regroupe l’ensemble des phénomènes survenant à la suite d’une lésion vasculaire. C’est le temps aboutissant à la formation d’un agrégat plaquettaire ou thrombus blanc, ou encore clou plaquettaire. Cet agrégat est suffisant pour arrêter l’hémorragie au niveau des petits vaisseaux, tout en étant insuffisant (mais indispensable) pour freiner l’hémorragie au niveau des plus gros vaisseaux.
Différents éléments interviennent dans l’hémostase primaire. Ce sont principalement la paroi vasculaire, les plaquettes sanguines et certaines protéines plasmatiques comme le facteur de von Willebrand (fvW) ou le fibrinogène. L’hémostase primaire comporte 3 phases successives: un temps vasculaire, un temps d’adhésion plaquettaire, et un temps d’agrégation plaquettaire. Ces mécanismes sont schématisés sur la figure 10.
4.1.1. Le temps vasculaire
La phase vasculaire se déclenche dès l'apparition d'une lésion de la paroi vasculaire. Il en résulte une vasoconstriction rapide. Cette vasoconstriction est dans un premier temps dite
« passive ». Liée à l’élasticité de la paroi, elle ralentit le débit sanguin pendant un bref moment. Puis vient la constriction dite « active », via la contraction des fibres musculaires lisses. Cette phase active est accrue et prolongée par des substances humorales (adrénaline, nor-adrénaline, sérotonine, et thromboxane TXA2) libérées par les plaquettes.
4.1.2. Le temps d’adhésion plaquettaire
L’adhésion plaquettaire permet d’obstruer la brèche vasculaire. L’adhésion s’effectue au niveau du sous-endothélium exposé, en faisant intervenir essentiellement la GP Ib/ IX (une glycoprotéine de la membrane plaquettaire), le facteur de von Willebrand (fVW), et certaines structures du sous-endothélium (fibres de collagène de type III et IV et les microfibrilles) (figure 11) (Parise et al, 2001).
Dans un premier temps, le fVW se fixe aux fibres de collagène de l’endothélium mis à
nu et permet à la plaquette de s’amarrer par l’intermédiaire de la GP Ib/DC. L’adhésion est
suivie d’un changement de structure et d’une activation des plaquettes. Initialement discoïdes,
les plaquettes deviennent sphériques et plus volumineuses par pénétration de 30% d’eau.
--- PLAIE VASCULAIRE --- 1
V if
Libération d'ADP Contact avec le sous-endothélium Libération de facteur tissulaire
Adhésion des plaquettes Sécrétion plaquettaire
i
ADP Agrégation plaquettaire
réversible
adrénaline
Agrégation plaquettaire irréversible
Activation du XII
i ir
Voie endogène Voie exogène
