Mise en contact de femelles d’Ixodes ricinus avec des lapins

Les lapins sont injectés à trois reprises avec trois semaines d’intervalle par 50 pg de

riris purifiée, en présence d’adjuvant de Freund complet et incomplet.

Les effets de la vaccination ont également été testés lors du repas sanguin de femelles

adultes. Les résultats sont résumés dans le tableau 9. Les valeurs proviennent de deux

expériences indépendantes incluant chacune deux lapins par conditions testées. Nous avons

tout d’abord regardé le taux de fixation des tiques sur les oreilles de lapins au cours des 24

premières heures du repas sanguin. Aucune différence n’a été observée entre les femelles

nourries sur les lapins immunisés et sur les lapins contrôles.

Sur les lapins contrôles, les tiques accomplissent leur repas sanguin entre 6 et 10 jours.

Sur les lapins immunisés, 21 % des tiques restent fixées entre 11 et 25 jours pour accomplir

leur repas sanguin. Comme indiqué dans le tableau 9, ce phénomène se traduit par une

augmentation significative de la durée moyenne du repas sanguin de plus d’une journée sur

les lapins immunisés (9,0 ± 0,6 jours) comparé aux contrôles (7,6 ± 0,4 jours) (P<0,02). A ces

résultats s’ajoute une hausse du taux de mortalité de 33,6 (± 3,9) % pour les tiques nourries

sur les lapins immunisés contre 4,2 (± 4,7) % sur le groupe contrôle (p<0,001). Ce calcul tient

en compte les tiques mortes sur le lapin ou les tiques nourries qui sont mortes sans avoir pu

pondre.

Les tiques mortes sont toutes d’un aspect asséché, mais bien qu’elles soient

pleinement gorgées ou presque (poids moyen de 208 (± 60) mg), suggérant qu’elles aient

accompli leur repas sanguin (figure 40B). La plupart des tiques récoltées sur les lapins

immunisés ou non, ont le même aspect (figure 40A). Cependant, plusieurs tiques nourries sur

les lapins vaccinés présentent un aspect « ffippé » (figure 40C), ce qui n’est pas observé sur

les lapins contrôles. Les tiques vivantes ont été pesées après détachement, et comme il est

décrit dans la tableau 9, aucune différence significative n’a été constaté entre les tiques

nourries sur les différents groupes. De même, aucune différence n’a été observée concernant

l’oviposition, la presque totalité des tiques ont pondu.

Ces résultats ont été reproduits avec un lapin immunisé suivant le même protocole, mais

en utilisant comme adjuvant l’Alum. Dans un taux de mortalité de 23,1 %, et une durée

moyenne du repas sanguin de 12,4 jours ont été observés. Ce dernier point est expliqué par la

grande proportion (42 %) de tiques ayant nécessité plus de 10 jours pour accomplir leur repas.

Ces résultats indiquent que la vaccination avec riris provoque une mortalité d’environ 30 %

chez les adultes. Enfin, les tiques survivantes ont conservé la capacité de pondre, de muer,

malgré une diminution de leur prise de poids.

DISCUSSION

La glande salivaire de la tique joue un rôle essentiel dans T accomplissement du repas

sanguin. Au cours de ce repas, la synthèse d’ARN messagers y est stimulée et de nouvelles

protéines sont exprimées, lesquelles peuvent être sécrétées dans la salive. La salive des tiques

est un composé complexe les aidant à contourner bon nombre des défenses de l’hôte

(Champagne, 2004 ; Ribeiro, 1995). Bien que la littérature rapporte beaucoup d’informations

au sujet des effets du repas de la tique sur l’hôte, la nature des facteurs actifs exprimés par les

glandes salivaires de la tique est peu connue. Néanmoins, quelques composés ont été

caractérisés chez les tiques molles ou dures, parmi lesquels un antagoniste de la pilba3-

integrine et des inhibiteurs de la coagulation (Hoffmann et al, 1991 ; Hom et al, 2000 ;

Francischetti et al, 2002 ; Lai et al, 2004 ; Law et al, 1992 ; Iwanaga et al, 2003 ; Waxman

étal, 1990 ; Sangamnatdej et al, 2002 ; Valenzuela étal, 2000 ; Ribeiro, 1987).

Le crible de deux banques d’ADN complémentaires - issues de la rétro-transcription

des ARN messagers synthétisés par les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus - a permis

l’identification de 27 protéines dont l'expression est spécifiquement induite ou régulée

positivement pendant le repas sanguin de la tique /. ricinus (Leboulle et al, 2002). Parmi ces

protéines, la protéine Seq24, induite au cours du repas sanguin, présente la capacité de

moduler les immunités innée et acquise de l’hôte (Leboulle et al, 2002). En conséquence, la

protéine Seq24 a été nommée Iris pour «Ixodes ricinusImmuno^ppressor ». Au cours de la

présente étude, notre but fut de caractériser le rôle d’iris et de déterminer son importance dans

le repas sanguin de la tique I. ricinus.

Expression d’iris au cours du revas sanguin de la tique I. ricinus

Dans cette perspective, nous avons tout d’abord analysé l’expression in vivo d’iris

chez la tique. Les RT-PCR ont permis de confirmer la présence d’ARNm d’iris dans les

glandes salivaires de femelles nourries (Leboulle et al, 2002) (Figure 25) et de démontrer leur

absence dans l’intestin. Les Western Blot ont confirmé que les ARNm spécifiques d’iris sont

traduits en protéine dans les glandes salivaires, et ont également montré la présence d’iris

dans la salive (Figure 26). Enfin, l’analyse de sera de lapins infestés à plusieurs reprises

démontrent qu’Iris est bien injectée dans l’hôte. La protéine Iris est donc bien sécrétée par la

tique et injectée dans l’hôte, ceci malgré l’absence de peptide signal classique. Cette absence

suggère donc l’implication d’un autre système de sécrétion (Sauer et al, 2000). Von Heijne et

al ont décrit un cas similaire. Le PAI-2, une serpine présentant une grande homologie avec

Iris, est en effet sécrétée par des cellules endothéliales, et ce malgré l’absence d’un peptide

signal classique. Les auteurs décrivent un peptide signal non clivé, correspondant à une zone

N-terminale hydrophobe. Les analyses HCA ont démontré le même type de région

hydrophobe dans la protéine Iris, ce qui pourrait expliquei sa secrétion (von Heijne et al.,

1991).

Par contre, les transcrits d’iris n’ont pas été détectés chez les mâles. Ceci pourrait être

expliqué par le fait que les mâles peuvent se fixer à l’hôte mais ne se nourrissent pas ou peu'

la présence d’iris serait donc nécessaire à l’accomplissement du repas sanguin de la tique.

Le gène codant pour Iris s’exprime aussi chez les nymphes. Comme Iris est sécrétée

dans la salive de la femelle, il est fort probable qu’elle le soit également dans la salive de

nymphe. De même, nous pouvons raisonnablement supposer que c’est aussi le cas chez la

larve. Ceci n’a pas été démontré car il est très difficile voire impossible de prélever de la

salive aux stades immatures.

Enfin, une bande supplémentaire de 54 kDa a été détectée avec le sérum anti-iris dans

les extraits de glandes salivaires (Figure 26), mais pas dans la salive. Il pourrait s’agir d’une

autre seipine présentant une forte homologie avec Iris, non sécrétée, ayant des fonctions intra

cellulaires. En effet, la notion de famille de serpines a déjà été proposée par Mulenga et al.

(2002) chez K appendiculatus, une autre tique dure. Ces auteurs ont isolé, à partir des

glandes salivaires, 4 serpines (RAS-1 à RAS-4) avec des poids moléculaires prédits

respectivement à 41,9 ; 42,7,43,2 et 53,9 kDa.

Iris appartient à la super-famille des serpines

La protéine Iris est sécrétée par la tique et injectée directement dans l’hôte. Afin de

déterminer quel rôle elle pourrait jouer chez l’hôte, nous avons voulu caractériser sa fonction.

Pour cela, nous avons tout d’abord analysé la séquence primaire d’iris. Cette analyse a prouvé

qu’Iris est fortement homologue à un inhibiteur d’élastase de leucocyte de porc (Leboulle et

al, 2002). Ceci nous a suggéré qu’Iris appartient à la super-famille des serpines, c’est-à-dire

qu'elle possède une fonction inhibitrice potentielle contre les protéases à sérine. Cette

appartenance a été confirmée d’une part avec des alignements BLAST et HCA de notre

protéine avec les homologues d’iris. Ces alignements ont mis en évidence des régions

conservées et notamment la présence du motif des serpines (Prosite PS00284) et de la boucle

RCL, régions typiques des serpines (Irving et al, 2000). D’autre part. Iris possède les résidus

fortement conservés, identifiés par Irving, nécessaires au maintien de la structure même des

serpines (Irving et al, 2000). Enfin, des prédictions des structures secondaires d’iris,

confirmées par des analyses infrarouge, ont également renforcé l’idée de l’appartenance d’iris

à cette super famille des serpines.

Puisqu’il existe des serpines avec ou sans activité inhibitrice de protéases, nous avons

analysé les régions clef pour le mécanisme inhibiteur, c’est à dire le RCL et la région hinge

d’iris. Les caractéristiques spécifiques respectives sont bien conservées dans chacune de ces

régions. De plus, l'homologie d’iris avec l'inhibiteur d'élastase de leucocyte de cheval et l’a-

antitrypsine nous a permis de construire des modèles tridimensionnels d’iris, sous les formes

native et clivée, ainsi qu’en interaction avec la trypsine. De cette analyse, il ressort qu’Iris

posséderait un effet inhibiteur potentiel sur les protéases à sérine.

Afin de mieux caractériser ses propriétés. Iris a été exprimée via le système

baculovirus et purifiée jusqu’à homogénéité. La protéine purifiée présente un poids apparent

de 48 kDa. Leboulle et al. (2002) avaient précédemment détecté la protéine recombinante

Iris (exprimée en CHO-Kl) en Western blot par l’utilisation de sérum anti-riris, selon un

profil de doubles bandes (dont la bande la plus faible est plus petite de 4 kDa). Ce profil de

double bande observé par Leboulle et collaborateurs est expliqué par la propension naturelle

des serpines au clivage dans la région du RCL. En effet, incuber une serpine quelques

secondes à 60 °C suffit au clivage de la protéine. La détection, à l’aide d’un anticorps dirigé

contre l’épitope V5, situé à l’extrémité carboxy-terminale, ne révèle que la bande au plus haut

poids moléculaire (non montré). Ce profil observé correspondait donc à la protéine

recombinante d’une part et d’autre part à la protéine tronquée de son extrémité carboxy­

terminale

Caractérisation du potentiel inhibiteur de riris

Plusieurs serpines inhibitrices sont impliquées dans une grande variété de processus

biologiques fondamentaux tels que la coagulation, la fibrinolyse, l’apoptose, l’angiogénèse ou

l’inflammation (comme par exemple l’antithrombine III ou la plasmine). (Davie et al, 1991 ,

Hekman et ai, 1987 ; Rubin, 1996). Cependant, beaucoup de mécanismes les impliquant

n’ont pas été identifiés. Afin de caractériser les propriétés d’iris dans ces différents

mécanismes, nous avons dans un premier temps évalué son potentiel inhibiteur. Nous avons

opté pour des protéases présentes (pour la plupart d’entre elles) dans le sang et impliquées

dans les mécanismes de l’hémostase. Les mesures ont démontré que la protéine recombinante

Iris (riris) inhibe de manière spécifique les protéases à sérine (HLE, t-PA, thrombine, et

facteur Xa) (tableau 5). Les constantes d'affinité et les pourcentages d'inhibition ont démontré

que, parmi ces cibles, riris possède l'affinité la plus élevée pour l'élastase de leucocyte humain

(tableau 5), comme cela a été prédit par les études structurales. Ces valeurs sont très

suggérant ainsi qu'Iris est un inhibiteur de type « a-l-antitrypsine-like ». Ces résultats

montrent également que les protéases « élastase-like » semblent être les cibles préférentielles

probables d'iris. Ces résultats sont appuyés par la présence d’une Méthionine (M340) en

position PI, comme dans toutes les serpines inhibitrices d’élastase. Le résidu PI (Met) est un

acide aminé principal dans l'interaction avec les protéases. La méthionine présente en PI est

susceptible d’être oxydée par des espèces réactives de l’oxygène dérivées des neutrophiles

activés. Ceci pourrait inactiver la fonction inhibitrice comme c’est le cas pour l'a-1-

antitrypsine (Kawabata et al, 2002).

Caractérisation des mécanismes d’action de riris par Vutilisation de mutants RCL

Il est bien décrit dans la littérature que l'activité inhibitrice des serpines est liée au

domaine RCL. Ceci a été confirmé par le modèle structural qui a prédit l'interaction entre Iris

et les protéases à sérine par le motif RCL.

Pour caractériser le mode d'action d’iris sur les systèmes de défense de l’hôte, nous avons

donc construit plusieurs mutants d’iris, affectant sa fonction inhibitrice, iiiais tout en

conservant l’intégrité de sa structure tertiaire. Plusieurs possibilités ont été examinées. En

effet, nous pouvons agir sur la force de l'interaction avec la protéase, sur la flexibilité de la

charnière ou sur l'ouverture et l'insertion du RCL dans le feuillet B-A.

De cette manière, nous avons produit un premier mutant, M340R, situé en position PI

du domaine RCL. Cette mutation devrait déplacer l’affinité d’iris pour l’élastase vers d’autres

sérine protéases comme la thrombine et le facteur Xa (Travis et al, 1986 ; Owen et al, 1983).

Relativement à Iris, le mutant M340R a une affinité 10 fois plus élevée pour le facteur Xa et

la thrombine, et environ 1.000 fois plus élevée pour la trypsine. Simultanément, le mutant

M340R a perdu sa capacité à inhiber les élastases humaine ou de porc. Par contre, le mutant a

acquis une activité inhibitrice pour la plasmine. Par conséquent, la mutation de Met (340) par

un résidu d'Arginine a modifié la propriété « a-l-antitrypsine-like » en un inhibiteur «

antithrombine-like », comme cela a été observé pour le facteur de Pittsburgh, un mutant

naturel de l’a-1-antitrypsine (Travis et al, 1986 ; Owen et al, 1983).

Deux autres mutants ponctuels ont été construits. Il s’agit des mutants L339A et

A332P, respectivement dans la région « hinge » (position P9) et dans le domaine RCL

(position P2). L’objectif de ces mutations est de supprimer la fonction anti-protéasique d’iris.

Le premier mutant a été obtenu en modifiant la Leuciue L339 (Acide aminé P2 du domaine

d’interaction) en Alanine. Cette mutation a modifié l’hydrophobicité et augmenté

l’encombrement stérique du domaine, ayant pour conséquence d’altérer l’interaction avec la

protéase.

Le mutant A332P est le produit d’une mutation dans la région « hinge ». Les résidus

du domaine « hinge » accomplissent simultanément trois fonctions : i) ils confèrent la

flexibilité au RCL, ii) ils stabilisent l'interaction avec la protéase et iii) ils favorisent

l’insertion du RCL dans le feuillet B-A. Il n’est donc pas étoimant de constater une grande

conservation des résidus dans ces régions. La mutation du résidu P9 (Ala) en Proline devrait

perturber l’interaction d’iris avec la protéase, plus exactement en rigidifiant la région Hinge et

donc en empêchant l’insertion du RCL dans le feuillet P-A par des contraintes stériques

imposées par la proline. En conséquence, la réaction devrait amener directement au produit

clivé (dégagement du domaine RCL) et il ne devrait y avoir aucune inhibition de la protéase.

Les tests enzymatiques in vitro indiquent que ces deux mutants ont complètement

perdu leur capacité à inhiber toutes les protéases testées, exception faite pour le mutant

A332P, qui présente une faible activité contre la HLE (Tableau 5). L’activité du mutant

M340R et l’absence d’activité du mutant L339A confirment que ce domaine constitue le site

d’interaction de la serpine avec les protéases. De plus, l’absence presque totale d’activité du

mutant A332P démontre que cette zone est essentielle à l’activité d’iris, bien que ce domaine

soit prédit pour n’avoir aucune interaction avec les protéases. Ce résidu est bien essentiel à

l’insertion du RCL dans le feuillet P-A. Nous proposons donc que le mécanisme de

l'inhibition des protéases de type élastase par Iris, soit de tjqje « suicidaire » - qui comporte le

repliement de la région « hinge » et la déformation de la protéase - et non pas simplement de

t)q)e «emplacement actif », comme pour les inhibiteurs traditionnels. Ces données confirment

que le mécanisme d’activité d’iris est typique d’une serpine.

Comme aucun des mutants inactifs n'a montré une quelconque activité inhibitrice,

nous avons utilisé par la suite seulement le mutant L339A dans la caractérisation du mode

d'action d'iris dans les systèmes inflammatoire et hémostatique expérimentaux.

riris inhibe les mécansimes de l’hémostase

Des nombreuses sérine protéases sont impliquées dans les voies de coagulation du

sang. Les analyses enzymatiques in vitro ont démontré qu'Iris inhibe plusieurs de ces

protéases (par exemple le facteur Xa ou la thrombine) suggérant ainsi qu'Iris pourrait agir en

tant qu'inhibiteur de la coagulation. En ce qui concerne la voie d’activation du facteur

tissulaire, nous n'avons observé aucune modification significative du temps de coagulation par

l’ajout de riris. Cependant, en ce qui concerne la voie de contact, le temps de coagulation a

Iris^

Lyse du caillot

Figure 41 : Schéma décrivant le rôle d’iris dans la fibrinolyse. Les flèches vertes

représentent les régulation positives. Les flèches rouges représentent les régulation

négatives. Les Serine protéases inhibée par riris sont en bleu. Les homologues d’iris sont

encadré en rouge. PAI ; Plamsinogen activator inhibitor. t-PA: Tissue - Plamsinogen

Activator. u-PA: Urokinase - plamsinogen activator. LEI: Leukocyte Elastase inhibitor

été sensiblement augmenté d'une manière dose-dépendante par l'addition de riris, alors que le

mutant L339A n’a pas cet effet (Figure 31). H y a donc une corrélation entre l'activité

antiprotéasique et l’effet sur la coagulation. Le fait qu’Iris inhibe préférentiellement la voie de

contact à la voie du facteur tissulaire est cohérent avec les connaissances actuelles

biochimiques des deux voies. En effet, la première est composée principalement de sérine

protéases telles que les facteurs IXa et Xla, cibles potentielles des serpines, tandis que la voie

du facteur tissulaire est naturellement régulée par un inhibiteur de type kunitz (Francischetti et

al, 2002), et non une serpine. Cependant, malgré le fait que riris inhibe de manière

significative la voie de contact, il s'est avéré que notre protéine n'est pas un anticoagulant

puissant, contrairement au mutant M340R que nous avons produit. Par rapport à Iris, le

mutant M340R montre un plus grand potentiel inhibiteur de la voie de contact et est aussi

capable d’inhiber la voie du facteur tissulaire. Cette double activité s’explique probablement

par le fait que ce mutant, tout en perdant son activité inhibitrice pour les élastases, a gagné en

affinité pour le facteur Xa et la thrombine. En effet, ces deux protéines sont situées dans la

partie commune des deux cascades de coagulation. Elles font partie de ce qui est appelé la

voie commune. Il est donc logique de voir le mutant agir dans les deux voies. La lyse du

caillot de fibrine implique également plusieurs sérine protéases, parmi lesquelles la plasmine,

le t-PA ou l'élastase de leucocyte. Les calculs des constantes d'association et des pourcentages

d'inhibition ont démontré que l'élastase de leucocyte et le t-PA sont des cibles préférentielles

pour riris (Tableau 5). Ces observations sont conformes au degré élevé d'identité et de

similarité d'iris avec l'inhibiteur d'élastase de leucocyte humain et avec l’inhibiteur-type 2 de

l’activateur du plasminogène (PAI-2). Le rôle de riris sur la fibrinolyse a été évalué par une

analyse ECLT. Afin de s'assurer que l'augmentation du temps de fibrinolyse n'était pas un

artefact dû à l'inhibition de la fibrino-formation, l'analyse ECLT a été exécutée en présence

d'un large excès de thrombine. Dans ces conditions, rhis inhibe seulement le t-PA (Figure

41). Cette inhibition permet de ralentir l'activation du plasminogène et par conséquent

d’augmenter le temps de fibrinolyse de 40% (Figure 32a). Nous avons également examiné

l'effet de riris sur le plasma en présence des leucocytes humains (Figure 32b). Comme

attendu, la présence de leucocytes diminue le temps de fibrinolyse de 20%, en raison de leur

sécrétion d'élastase. Dans ces conditions, l'action de riris prolonge le temps de fibrinolyse

(83%), excédant nettement les valeurs obtenues en l'absence des neutrophiles (40%). En

outre, le mutant L339A n'a aucun effet sur le temps de fibrinolyse, en présence ou non de

neutrophiles. Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que l’inhibition de la

fibrinolyse par riris est due à l’activité anti-protéol54ique du RCL. Ils indiquent également que

la fibrinolyse est atténuée par l’inhibition du t-PA et de l'élastase libérée par des leucoc

5

^es

(Figure 32b). Enfin, M340R inhibe totalement la fibrinolyse, en présence ou non de

neutrophiles. Alors qu’une fibrinolyse classique (conditions contrôles) se déroule en environ

6h, aucune fibrinolyse n’a été observé après 72 h. Cet effet est lié au changement de la cible

de la serpine. En effet, alors que M340R perd son activité pour le t-PA et l’élastase, il gagne

en activité sur la plasmine.

Nous avons également analysé l'action de riris sur l’hémostase primaire. La protéine

Iris recombinante et les deux mutants RCL (L339A et M340R) favorisent une augmentation

dose-dépendante du temps d’occlusion du PFA_100, une mesure fiable du temps d'adhésion

plaquettaire (Figure 30). Contrairement aux résultats observés pour riris sur la coagulation et

la fibrinolyse, les mutants conservent la même activité que riris. La présence d’un RCL intact

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