Leboulle a démontré au sein de notre laboratoire la capacité de riris à moduler la
réponse immunitaire (Leboulle et al., 2002). Plus précisément, il a démontré la capacité
d’extraits semi-purifiés de protéine Iris recombinante (exprimée en CHO-Kl), à inhiber la
production de TNF-a, d’IL-6, et d’IL-8 (cytokines proinflammatoires) ainsi que la production
d’fFN-y par des PBMCs (Peripherical Blood Mononuclear Cells) humaines, alors qu’aucune
modification de la production d’IL-lp n’a été observée. Nous avons décidé de poursuivre ces
travaux en déterminant le(s) mécanisme(s) par le(s)quel(s) Iris agit dans la réponse
immunitaire et en particulier dans l’inflammation.
7.1. Actions d’iris purifiée et de ses mutants sur la production de cytokines par
les PBMCs
Les PBMCs, stimulées par l’ajout de LPS, ont été mises en présence ou non de
différentes doses de protéines recombinantes Iris Des prélèvements sont effectués à différents
temps en fonction des cytokines à doser ; 4h pour le TNE-a, 24h pour riL-8, et 48h pour
C o n c e n tr a ti o n s d e TNF-a (p g /ml )
rlRIS
PBMCs Monocytes Macrophages
TNF-a 6% 97 7c 101 %
IL-8 11 7c 92 7c 97 %
L339A
IL-lp 98 7c 105 7c 96%
TNF-a \4 7c 112% 93 %
IL-8 I6 7c 98% 94%
IL-lp 95 7c 98% 99%
Tableau 6 ; Production de cytokines par des PBMCs et des monocytes THPl différenciés ou non en macrophases,
traités avec riris. Les valeurs indiquées représentent le pourcentage de production de cytokine calculé en comparaison
avec les cellules stimulées simplement en présence de LPS. Comme contrôle positif d’inhibition de la production de
cytokines, nous avons utilisé la dexaméthasone. Les PBMCs sont récoltées comme décrit au point 7.2. de la section
Matériels et Méthodes. Les Monocytes THPl proviennent d’ime ügnée commerciale. Les monocytes THPl ont été
différenciés en macrophages par l’ajout de PMA (30pg/ml). Les cytokines sont dosées par technique ELISA.
Dilutions des anticorps + riris + LPS - riris + LPS - riris -LPS
10 20 40 80 / / 10
Anti-dl 28 % 24% 24% 23% 25 %
100%2%
Anti-d2 56 % 43 % 32% 27% 25 %
100%3%
Anti-d4 80% 59% 44% 31 % 25 %
100%6%
Tableau 7 .• Neutralisation de l’activité de riris sur de la production de TNF-a par l’ajout des anticorps anti-peptides.
Les valeurs indiquées représentent le pourcentage de production de cytokine calcidé en comparaison avec les cellules
stimulées simplement en présence de LPS (+ LPS ; - riris). Les PBMCs sont récoltées comme décrit au point 7.2. de la
section Matériels et Méthodes. Les PBMCs sont incubées en présence ou non de 100 nM de protéines recombinantes Iris
et de différentes dilutions d’anticorps. Les cellules sont stimulées par l’ajout de LPS (lOpg/ml). Des prélèvements sont
effectués après 4h. Les cytokines sont dosées par technique ELISA. (/) : absence d’anticorps
Fleure 34 : Effet de Tanti-d5 sur la production du
TNF-a par des PBMCs humaines. La première
coloime représente la production de TNF-a par des
PBMCs stimulées au LPS. L’anti-dl n’a aucun effet
sur la production de TNF-a. La dernière colonne
(anti-d5 sans LPS) indique que l’échantillon n’est pas
contaminé par des endotoxines.
(- LPS) : cellules non stimulées. (+LPS) ; cellules
stimulées au LPS (lOpg/ml). Les cytokines sont
dosées par technique ELISA.
riL-ip. Les dosages de cytokines sont effectués grâce à des kits ELISA (BD Biosciences).
Les résultats indiquent que la protéine rlris exprimée en baculovirus, inhibe également la
production de TNF-a et d’IL-8 (figure 33 - tableau 6) de manière dose dépendante, alors
que la production d’IL-ip n’est pas modifiée.
De plus on constate que le mutant RCL(L338A), conserve la même activité qu’Iris
(tableau 6). Ce résultat indique que l’activité anti-inflammatoire d’iris est indépendante du
RCL et donc de l’activité anti-protéasique.
Dans le but de déterminer quels sont les domaines de la protéine Iris responsables de
l’action anti-inflammatoire, nous avons, en collaboration avec le Prof Robert Brasseur, isolés
d’autres domaines pouvant potentiellement interagir avec d’autres protéines. Ces domaines
sorit appelés motifs RBD. Dans le but de déterminer ces interactions, la construction de
mutant (comme pour l’analyse du motif RCL) nous a paru trop fastidieuse. Nous avons opté
pour l’utilisation d’anticorps dirigés contre les sites RBD. Si un ou plusieurs anticorps utilisés
bloquent l’activité d’iris, ces résultats pourront nous indiquer quel site est responsable de cette
activité. Le choix et la production des anticorps sont décrits au point 3.1.
100 nM de rlris inhibe 75 % de la production de TNF-a par des PBMCs humaines.
L’addition de concentration croissante des anticorps dirigés contre les domaines d2 et d4
enlève progressivement cette inhibition, ce qui indique la capacité des anticorps à inhiber
l’activité anti-inflammatoire de rlris de manière dose dépendante. Le tableau 7 montre que
l’ajout de ces anticorps dilués 10 fois diminue l’action d’iris. Dans ces conditions, la
production de TNF-a n’est plus inhibée que de 44 % et 20 % (respectivement avec Tanti-d2
et l’anti-d4). L’addition de l’anticorps anti-dl n’a aucun effet sur l’activité de rlris. Enfin, la
capacité de l’anti-d5 à bloquer l’activité de rlris n’a pu être évalué. Cet anticorps inhibe à lui
seul la production de TNF-a, de manière dose-dépendante (figure 34).
7.2. Détermination du ou des types cellulaires interagissant avec Iris
7.2.1. Utilisation du FACS
Comme aucune lignée cellulaire ne nous a permis de reproduire les résultats obtenus
par le contact de rlris avec les PBMCs humaines, nous avons voulu analyser les interactions
probables entre rlris et ces cellules via l’utilisation d’un FACS. rlris a été marquée avec des
CD 11b
h
CD 16
CD3
Figure 35 : Visualisation des populations cellulaires en fonction de leur aptitude à fixer la protéine Iris
recombinante marquée et de leur réponse à l’anti-CDIIb. CD 16 ou CD3. La protéine Iris marquée FITC (lOOpl à
Img/ml) est mise en contact avec des PBMCs humaines (lOOpl à 2.10® cellules /ml), Ih à 4°C dans l’obscurité. A
gauche. Iris est mise au contact de PBMCs sans ajout de LPS, à droite, avec ajout de LPS (lOpg/ml). Les cellules sont
lavées dans 3 ml de PBS et resuspendues dans 100 pi de PBS contenant différents anticorps CDllb, CD3, et CD16
marqués à la R-Phycoérythrine, respectivement dirigés contre des réceptems doimés représentatifs des populations
d’origine monocytaire, des lymphocytes et des granulocytes. Les cellules sont incubées 30 min à 4°C à l’obscurité.
Après un nouveau lavage, les cellules sont resuspendues dans 100 pl de PBS et analysées par FACS afin de déterminer
si Iris s’est fixée ou non siu un type cellulaire précis.
Figure 36 : Analyse de la spécificité de la liaison de riris sur les cellules d’origine monocytaire. A. La protéine rlris
non marquée (lOOpl à Img/ml) est mise au contact de PBMCs humaines (lOOpl à 2.10® cellules /ml), Ih à 4°C dans
l’obscurité. B. La protéine Iris FITC (lOOpl à Img/ml) est mise en contact avec des PBMCs humaines (lOOpl à 2.10®
cellules /ml), Ih à 4°C dans l’obscurité. Les cellules sont lavées dans 3 ml de PBS et resuspendues dans 100 pl de
protéine rlris non marquée (lOOpl à Img/ml), Ih à 4°C dans l’obscurité. C. La protéine Iris FITC (lOOpl à Img/ml) est
mise en contact avec des PBMCs humaines (lOOpl à 2.10® cellules /ml), Ih à 4°C dans l’obscurité.
Dans chaque cas, les cellules sont lavées dans 3 ml de PBS et resuspendues dans 100 pl PBS contenant de l’anti-
CDl Ib marqué à la R-Phycoérythrine. Les cellules sont incubées 30 min à 4°C à l’obscurité. Après im nouveau lavage,
les cellules sont resuspendues dans 100 pl de PBS et analysées par FACS.
fluorochromes via Tutilisation du Kit Alexa Fluor. La protéine marquée est mise en contact
avec des PBMCs humaines activées ou non au LPS. Puis les cellules sont passées au FACS
afin de déterminer si Iris s’est fixée ou non sur un type cellulaire précis. Ceci a été effectué
par l’utilisation d’anticorps marqués à la R-Phycoérythrine, dirigés contre un récepteur donné
(CD 11b, CD3, CD 16), respectivement représentatifs des populations de monocytes /
macrophages, des lymphocytes et des granulocytes. Les résultats montrent que riris se fixe sur
les cellules possédant le récepteur CDU b (figure 35) et pas sur les cellules possédant les
récepteurs CD 16 et CD3 (figure 35). Cela signifie qu’Iris se fixe uniquement sur les cellules
d’origine monocyte/macrophage. De plus on constate que l’ajout de LPS ne modifie en rien
l’action d’iris (figure 35).
Afin de vérifier si l’interaction entre riris et les monocytes / macrophages est spécifique, nous
avons mis en compétition les protéines riris marquée et non marquée. En bref, après
incubation 30 min en présence de riris marquée, les PBMCs ont été lavées au PB S puis mises
en contact avec de la protéine riris non marquée. Le FACS a montré une augmentation
progressive du signal entre les trois conditions testées : i) riris froid, ii) riris marquée puis rfris
froid, iii) riris marquée (figure 36). Ceci indique que la signal observé sur le FACS, en
présence de riris marquée, est spécifique. Cela confirme l’interaction entre riris et les
monocytes / macrophages.
7.2.2. Utilisation de lignées cellulaires humaines
Les PBMCs correspondent à une diversité cellulaire parmi lesquelles des monocytes,
des lymphocytes, des macrophages,... La réponse inflammatoire est un processus complexe
mettant enjeu différents t}q)es cellulaires. Pour déterminer quelles cellules interagissent avec
riris, différentes lignées cellulaires humaines ont été mises en présence de la protéine
hautement purifiée.
Les monocytes THPl sont stimulés avec du LPS et incubés en présence ou non de
différentes doses de protéines recombinantes Iris. Dans ces conditions, riris n’influe en rien la
production de cytokines pro-inflammatoires (tableau 6). Nous avons donc essayé de
différencier les monocytes THPl en macrophages, par l’ajout de PMA. Là encore, l’ajout de
riris ne module pas les productions de cytokines pro-inflammatoires (tableau 6).
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