Afin d’accomplir son repas sanguin, la tique se doit de moduler les réponses
immunitaires et hémostatiques. L’hémostase est l’ensemble des mécanismes qui concourent à
maintenir le sang à l’état fluide à l’intérieur des vaisseaux. Ce processus se déroule en trois
temps ; l’hémostase primaire, la coagulation et la fibrinolyse.
1.4 1
1,3-c
8
>O
2
2
1,2 1,1 -1 -—•—patient 1 —■— patient 2 —*— patient 3 —K— patient 4 —K—patient 5 0,9-I---1---1---1---1
HBSS iris 0,5 pM irisIpM iris 2pM
Figure 30 : riris auemente le temps d’adhésion planuettaire. Le temps d’adhésion plaquettaire augmente avec la
concentration de riris. Le sang a été collecté chez cinq volontaires en bonne santé dans des tubes citratés (0,13 M). Le
temps d'adhérence plaquettaire est mesimé avec le PFA-100 ® (Dade, Behring). Les échantillons testés sont composés
pour 1/10 par de la protéine dans de l’HBSS (GIBCO) et pour 9/10 du sang complet citraté. Le temps requis pour
obtenir la pleine occlusion de l'ouverture est défini comme temps de fermeture de collagen/epinephrine (EPI).
*
iris1,5MM L339A 6^M M340R6[iM M340R3nM
Figure 31 : riris inhibe la voie de contact de la coagulation. Le temps de coagulation de 1a voie de contact augmente
avec la concentration de riris. Le plasma est mis en présence de riris ou de ses mutants aux concentrations indiquées.
Les valeurs sont indiquées en ratio par rapport au contrôle PBS. Le mutant L339A perd l’activité anti-protéasique suite
à la mutation de son RCL. Les tests ont été fait en triplicata. * p<0,05, test ANOVA à ime voie de variance par rapport
au contrôle PBS.
6.1. l’hémostase primaire
Le temps d'adhérence plaquettaire est mesuré au moyen d’un PFA-100 (point 6.1.
Materiel et Méthodes). Le sang a été collecté chez cinq volontaires en bonne santé. Dans
quatre des cinq échantillons, riris prolonge de manière dose dépendante le temps d’adhésion
plaquettaire (figure 30). L’addition de 2|iM de riris prolonge le temps de 15 à 30% (selon
l’échantillon). L’addition de 2pM des mutants L339A et M340R augmentent de manière
similaire le temps d’adhésion plaquettaire. Ceci suggère que l’augmentation du temps
d’adhésion plaquettaire n’est pas du à l’activité anti-protéasique.
6.2. la coaeulation
Plusieurs sérine protéases inhibées par riris sont impliquées dans les mécanismes de la
coagulation. On distingue deux voies d'activation de la coagulation: la voie dite extrinsèque,
initiée pai le facteur tissulaire et la voie dite intrinsèque, initiée par le contact des facteurs
coagulation avec des surfaces chargées négativement.
L’analyse de la voie extrinsèque a démontré une augmentation très faible du temps de
coagulation (6% pour6pM d’iris) (non montré). Par contre, l’analyse de la voie intrinsèque a
montré que riris prolonge significativement le temps de coagulation de manière dose
dépendante. En effet, l’ajout de 6pM d’iris augmente le temps de coagulation de 21 % (figure
31)
Le mutant M340R est actif sur les deux voies testées, responsable d’une hausse
conséquente des temps de coagulation des voies extrinsèques et intrinsèques respectivement
de 250 (non montré) et 300 % environ (figure 31). Enfin, le mutant L339A, dépourvu
d’activité anti-protéasique, n’a aucun effet sur la coagulation (figure 31). Ceci indiquerait que
l’augmentation du temps de coagulation serait due à l’activité anti-protéasique de riris
6.3. la fibrinolyse
La mesure du temps de lyse du caillot d’euglobuline (ECLT) a permis de déterminer
l’effet de riris sur la fibrinolyse. Comme on peut le voir sur la figure 32a, riris accroit le
temps de fibrinolyse de manière dose dépendante. La présence de 16pM d’iris augmente la
fibrinolyse de 39%, par rapport au contrôle (HESS). Nous avons également testé l’action de
riris sur la fraction d’euglobulines en présence de leucocytes humains (figure 32b). L’ajout
A
B
Figure 32 : riris inhibe la fibrinolyse. Le temps de lyse du caillot d’euglobulines augmente avec la concentration de
riris. A : la fraction d’euglobuline est resuspendue dans de l’HBSS en présence de riris ou de ses mutants aux
concentrations indiquées. Les valeurs sont calculées par rapport au contrôle HBSS. Le mutant L339A perd l’activité
anti-protéasique par la mutation de son RCL. Les tests ont été fait en triplicata. * p<0,05, test ANOVA à une voie de
variance par rapport au contrôle HBSS. B : la fraction d’euglobuline est resuspendue dans de l’HBSS en présence de
riris ou de ses mutants aux concentrations indiquées. Les leucocytes (86% de neutrophiles) sont ajoutés pom ime
concentration finale de 5.10® cellules/ml. Les valeurs sont calculées par rapport au contrôle HBSS + cellules. Le mutant
L339A perd l’activité anti-protéasique par la mutation de son RCL. Les tests ont été faits en triplicata. * p<0,05, test
ANOVA à une voie de variance par rapport au contrôle HBSS + cellules. Les valeurs obtenues avec le mutant M340R
n’ont pas été représentées parce que, après 72h, aucune fibrinolyse n’a été observée.
NS NS IRIS LPS LPS LPS/iris LPS/iris LPS/iris LPS/iris LPS/iris LPS/iris
HBSS 300 nM HBSS HBSS 400 nM 200 nM 100 nM 50 nM 25 nM 12 nM
DEX
Figure 33 : Effet d’iris sur la production du
TNF-a pTNF-ar des PBMCs humTNF-aines. Les deux premières
colormes indiquent qu’Iris et son milieu ne sont pas
contaminés par des endotoxines. La troisième
coloime est le contrôle de l’activation au LPS. La
dexaméthasone a été utilisée comme contrôle de
l’inhibition de l’inflammation. NS : cellules non
stimulées au LPS. DEX dexaméthasone,
inhibiteur de 1a production de cytokines pro
inflammatoire. LPS : cellules stimulées au LPS.
Les cytokines sont dosées par technique ELISA.
de leucocytes diminuent le temps de fibrinolyse (environ 20%). Le retour au temps contrôle
(sans cellule) après ajout d’AACKPV (inhibiteur de synthèse de l’élastase de leucocytes)
démontre que cette diminution est spécifique à l’action de l’élastase relarguée par les
neutrophiles. Dans ces conditions plus « physiologiques », Iris inhibe la fibrinolyse de 83 %.
Dans le but de déterminer si l’augmentation du temps de fibrinolyse est due à une interaction
de riris avec la surface des cellules, les neutrophiles ont été préincubés Ih, en présence de
riris, puis lavées avant d’être testées à l’ECLT. Dans ces conditions, aucune variation du
temps de lyse n’a été observé (non montré)
Le mutant L339A n’a aucun effet sur la fibrinolyse, avec ou sans addition de
neutrophiles (figures 32a et b). Ceci indique que l’augmentation du temps de fibrinolyse
serait due à l’activité anti-protéasique de riris. Par contre, le mutant M340R inhibe totalement
la fibrinolyse. En effet, aucune lyse de caillot n’a été observé après 72h alors qu’une
fibrinolyse normale est obtenue après 6h (figures 32a et b). Comparer Iris et M340R est
délicat car ils n’inhibent pas les mêmes protéases de la fibrinolyse (respectivement le t-PA et
la plasmine).
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