4.2.1. COLETA DAS AMOSTRAS
A coleta de sangue foi realizada por punção venosa com sistema de coleta múltipla a vácuo. As amostras coletadas foram mantidas em temperatura ambiente até serem transportadas para a Faculdade de Farmácia, onde foram centrifugadas a 2500 rpm por 10 minutos. Parte do soro foi, então, separado e armazenado a -20ºC até a realização dos exames e outra parte foi acondicionada em tubos criogênicos e mantida a -70ºC.
4.2.2. PESQUISA DE CRIOGLOBULINAS
As coletas de sangue para pesquisa de crioglobulinas foram feitas em tubos secos de 10 mL, que ficavam em banho-maria a 37ºC logo após a coleta, por no mínimo 1h até a centrifugação. Logo após a centrifugação, o exame foi realizado utilizando duas metodologias distintas: crioprecipitação em tubo de Wintrobe e difusão em meio gelificado, essa última baseada no protocolo descrito por Okazaki e colaboradores (1998).
4.2.3. AUTOANTICORPOS
A pesquisa do FR foi realizada pelo método quantitativo de nefelometria com o sistema automatizado nefelômetro Immage® (Beckman Counter, USA). O método de nefelometria baseia-se nas reações de imunoprecipitação entre antígeno e anticorpo, em meio líquido, que produzem aumento da reflexão da luz, que pode ser diretamente medida pela dispersão da luz incidente. Essa dispersão da luz é conhecida como efeito Tyndall. A quantidade e a natureza da dispersão dependem, dentre outros fatores, da concentração da substância a ser dosada. Para a pesquisa de FR, é usado um conjunto composto de IgG humana fixada em partículas de látex como antígeno. O limite de detecção de FR por esta metodologia foi de 20 UI/mL.
ANA foram avaliados por teste de imunofluorescência indireta (IFI) usando células epiteliais humanas Hep-2 como substrato antigênico e anti-IgG humana
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marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) como conjugado de detecção da reação primária (VIRO-IMMUN LABOR-DIAGNOSTIKA, Alemanha). SMA também foram avaliados por IFI, só que utilizando cortes de estômago/rim/fígado de rato como substrato antigênico e anti-IgG humana marcada com FITC como conjugado (VIRO-IMMUN LABOR-DIAGNOSTIKA, Alemanha). Ambos os testes tiveram a diluição de 1/40 como título de triagem das amostras.
Os autoanticorpos antitireoidianos foram pesquisados por meio de ELISA indireto. Este método baseia-se na imobilização de antígenos na fase sólida e na utilização de anti-IgG humana ligada a uma enzima como conjugado. Se houver anticorpo no soro do paciente contra o antígeno imobilizado na fase sólida, este anticorpo permanecerá ligado a esta fase. A adição do conjugado permite que este seja ligado ao anticorpo, caso esteja positivo na amostra do paciente. Ao final, o substrato enzimático cromogênico é adicionado e a intensidade da absorbância medida pelo espectrofotômetro é proporcional à concentração do anticorpo na amostra do paciente. Os pontos de corte dos exames para anti-TPO e anti-TG foram de 50 UI/mL e 100 UI/mL, respectivamente (ORGENTEC DIAGNOSTIKA GMBH, Alemanha).
4.2.4. PARÂMETROS LABORATORIAIS DE ACOMPANHAMENTO TERAPÊUTICO
Exames bioquímicos e hematológicos foram realizados para servirem de parâmetros de acompanhamento terapêutico antes do tratamento, para determinar a linha de base, e nas semanas 12 e 24 após início da terapia. Dentre eles destaca- se: hemograma completo (CELL-DYN RUBY; Abbott, USA) e determinação da ALT (LABTEST DIAGNÓSTICA S.A, Brasil).
4.2.5. CARGA VIRAL E GENOTIPAGEM
Os pacientes atendidos no C-HUPES foram encaminhados para o Laboratório Central da Bahia (LACEN-BA) para realização da determinação da carga viral pelo método Real-Time PCR (AMPLICORTM HCV detection KIT V2.0; Roche Molecular Systems Inc., Somerville, NJ, USA) com o limite inferior de quantificação de 25 UI/mL, sendo 1 UI/mL igual a 5,26 cópias virais/mL. A genotipagem também foi determinada no LACEN pelo método INNO-LiPA (INNOGENETICS, NV, Gent,
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Bélgica), que possibilita diferenciar os seis genótipos e os principais subtipos do HCV.
4.2.6. BIÓPSIA HEPÁTICA
Os fragmentos obtidos por biópsia hepática percutânea foram avaliados por patologistas experientes do C-HUPES, que classificaram a atividade necroinflamatória e a fibrose de acordo com o sistema METAVIR (BEDOSSA et al., 1996).
4.2.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A normalidade da distribuição das variáveis quantitativas foi avaliada pelo teste de D’Agostino & Pearson. Diferenças nos níveis dos parâmetros laboratoriais de acompanhamento terapêutico (p.ex. ALT) e CV entre os pacientes com e sem marcadores laboratoriais de autoimunidade foram determinadas pelo teste de Mann- Whitney, quando a distribuição foi não normal e pelo teste t quando a distribuição foi normal. Esse mesmo teste foi utilizado para comparar os níveis de CV antes do tratamento entre os pacientes respondedores e não respondedores. A variação nos níveis das variáveis quantitativas que tiveram distribuição não normal durante o seguimento foi analisada pelo teste de Friedman com o pós-teste de Dunn e as variáveis que tiveram distribuição normal foram analisadas pelo teste de ANOVA pareado com o pós-teste de Tukey.
As associações entre os grupos categóricos que tiveram amostragens independentes foram avaliadas por tabelas de contingência (teste exato de Fisher ou de Chi-Quadrado). O teste de McNemar com correção de continuidade foi utilizado para comparar variáveis categóricas que tiveram amostragens pareadas, ou seja, antes e durante o tratamento. O software GraphPad Prism 5.0 e o GraphPad Quick Calcs (disponível em: http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm) foram utilizados para as análises. O nível de significância estatística estabelecido foi de p < 0,05.
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5. RESULTADOS
5.1. PACIENTES
Este estudo avaliou 29 pacientes com hepatite C crônica, que realizaram o tratamento antiviral com IFN-Peg mais ribavirina durante 24 semanas. Desses, 15 pacientes foram do gênero masculino e 14 do gênero feminino, com média de idade de 48 ± 10 anos para os homens e 54,7 ± 8,8 anos para as mulheres. Essa diferença de idade entre os gêneros não foi estatisticamente significante, P = 0,0915.
O genótipo mais prevalente neste estudo foi o genótipo 1, responsável pela infecção de 24 pacientes, representando 82,8% do total, os cinco pacientes restantes foram infectados pelo genótipo 3, 17,2%. Os genótipos 2, 4, 5 e 6 não foram encontrados nos pacientes incluídos neste trabalho. A atividade necroinflamatória foi ausente em apenas 24,1% dos pacientes, sendo que a maioria apresentou A1 ou A2 (72,4%) e nenhum teve A3 (Tabela 1).
A fibrose hepática estava presente em todos os pacientes do estudo. Como demonstrado na Tabela 1, a maioria dos pacientes tinha F3 ou F4 (51,7%), que são os estágios mais avançados de fibrose, sendo que desses, três eram pacientes com F4. Quanto à CV pré-tratamento, a mediana foi de 850.000 UI/mL com variação de 19.000 UI/mL a 8,7x106 UI/mL. Considerando a concentração de 600.000 UI/mL como parâmetro para classificar carga viral alta ou baixa, 58,6% tiveram carga viral alta.
Nenhum paciente foi excluído do estudo de acordo com os critérios de exclusão adotados. No entanto, quatro pacientes foram acompanhados somente até a 12ª semana de tratamento. Um paciente teve o tratamento suspenso pela equipe médica por não apresentar sinais de resposta virológica, outro paciente deu continuidade ao tratamento fora do Estado da Bahia e dois completariam a 24ª semana depois de finalizada a coleta de sangue. O seguimento completo foi realizado em 25 pacientes, o que representou 86,2% do total de pacientes incluídos.
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Tabela 1. Dados demográficos e histológicos dos pacientes portadores do HCV
Variável n = 29 %
Gênero e Idade (anos)
Masculino 15 51,7 Média = 48,6 ± 10 Feminino 14 48,3 Média = 54,7 ± 8,8 Genótipo 1 24 82,8 3 05 17,2 Atividade necroinflamatória 0 07 24,1 1 11 37,9 2 10 34,5 Não classificado* 01 3,4 Fibrose 2 13 44,8 3 12 41,4 4 03 10,3 Não classificado* 01 3,4
Carga viral antes do tratamento
< 600.000 UI/mL 12 41,4 ≥ 600.000 UI/mL 17 58,6
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