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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Baup, D. (2009). Identification de gènes préférentiellement exprimés par les cellules dendritiques et évaluation critique d'une approche de transgenèse lentivirale afin d'en étudier la fonction biologique in vivo (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.

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DBM 00725

Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires

Laboratoire de Physiologie animale

Directeurs de thèse : Dr Muriel Moser et Pr. Oberdan Léo

Identification de gènes préférentiellement exprimés par les cellules dendritiques et évaluation critique d'une approche

de transgenèse lentivirale afin d'en étudier la fonction biologique in vivo.

ULB - IBMM

BIBLIOTHEQUE

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences

Delphine BAUP

Année académique 2009-2010

Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires

Laboratoire de Physiologie animale

Directeurs de thèse : Dr Muriel Moser et Pr. Oberdan Léo

Identification de gènes préférentiellement exprimés par les cellules dendritiques et évaluation critique d’une approche

de transgenèse lentivirale afin d'en étudier la fonction biologique in vivo.

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences

Delphine BAUP

Année académique 2009-2010

Remerciements

Au commencement, le cours de Jacques, une révélation. Le film « Le cercle des poètes disparus » avait bouleversé ma vision de l'approche académique et il m'a fallu attendre une décennie pour que je vive une expérience non conforme du genre. Votre cours m'a confirmé que rien n'était rigide et que toute chose pouvait être abordée sous différentes perspectives. Les lapins se rêvent en nuages, les souris sont austères et l'immunologie est passionnante.

J'ai l'unique chance d'avoir été doublement aidée. Un remerciement ne convient pas pour tout ce que vous m'avez apporté, mais mon vocabulaire est bien trop pauvre, alors... Muriel, merci de m'avoir permis de réaliser une thèse, elle m'a forgée ; pour m'avoir toujours soutenue et aidée, pour avoir cru en moi ; pour ta profonde gentillesse et ton optimisme revigorant, on sort de ton bureau et tout semble abordable. Oberdan, merci pour toute ton aide, tout le temps que tu m'as consacré et pour avoir donné une fin improbable à cette aventure. Vous êtes incroyables tous les deux, merci pour tout.

Deux personnes m'ont recommandée auprès de Muriel pour que je vienne au laboratoire : Laurent et Magali. Merci Laurent. Quelle tristesse que les « jeunes » du labo ne sauront jamais l'homme briUant que tu étais. Et altruiste, sensible, rieur, serviable. La fin est là, enfin, je peux te dire au revoir mon ami. Merci ma très chère Magali pour ton appui, ta présence, ton aide, ta grande gentillesse, ton organisation incroyable, ta disponibilité. Tu es un modèle.

L'ambiance au labo est stimulante, je ne rendrai jamais avec justice combien chacun m'a touchée et a enrichi ces dernières années.

Julien et Claude sont aussi un exemple pour moi. Merci Julien pour l'aide constante que tu m'apportais quand tu étais encore au labo. Dès que je me perdais dans mon travail, tu me retrouvais, accompagné de nombreuses idées. Claude, ton courage, ta force m'ont toujours impressionnée. Vous méritez tellement, merci pour votre amitié.

Mes chères compagnes de bureau : Alice et Annette. Merci Alice pour être là, pour qui tu es, ta force, ta gentillesse, tcm soutien, ton amitié. Merci Annette pour m'aider avec ma grande progéniture odorante à poils, pour ta gaieté, ton énergie et surtout, merci de nous avoir laissé débarquer sur ton territoire et de nous materner. L'ambiance était irrésistible, c'est normal que Geoffroy s'y attardait.

Merci Geoffroy pour ton soutien, pour communiquer ta passion, ta bonté, ton amitié.

Merci Anne-Sophie pour avoir fait un bout de chemin avec moi, partagé mes doutes, pour m'avoir aidée à avancer. Merci Cindy pour apporter un peu de féerie, pour être toujours partante, pour ta sensibilité. Merci David pour ton humour décalé. J'en resterai au fait que vos goûts cinématographiques sont douteux, monsieur le faux pessimiste. Merci Fabienne pour ta gentillesse, ta disponibilité, l'intérêt que tu portes à chacun. Merci Françoise pour ton soutien, ton aide logistique et pour avoir toujours accepté de descendre au Supply en dehors des horaires. Merci Fred pour inlassablement répondre à mes nombreuses questions, pour ta présence, ta délicatesse. Merci Georgette pour ta profonde gentillesse et ta patience. Merci Guillaume pour ta disponibilité, tes encouragements et pour tcxi flegme légendaire qui apaise ton entourage. C'est formidable que tu sois revenu parmi nous. Merci Gwen pour ton enthousiasme, ton rire communicateur, ta bonne humeur égale. Je suis heureuse d'avoir pu te voir enceinte, tu es resplendissante. Tu seras une maman formidable. Merci lain pour ton aide, tes aptitudes de Geek, pour ne pas me croire définitivement folle alors que je vois le petit écureuil bleu en toi, pour ton soutien quand je touche mes limites. Merci Isa pour ton écoute, ta disponibilité et ton aide logistique. Merci Julie pour ton esprit, tes drôleries, tu es épatante. Merci Mara pour ton soutien, ta gaieté, ta bonté, tous les moments passés ensemble, courage pour la fin. Merci Nath pour ta gaieté, ta gentillesse, ta force tranquille. Merci Nicolas pour ton aide avisée, notamment dans les domaines de l'Evolution et du sport, pour ton soutien et pour ton enthousiasme. Merci Seb pour ta bonne humeur constante, pour ta gentillesse, pour m'empêcher de

tomber quand on chausse les objets futuristes à roues, pour tout ce que tu fais pour le labo. Merci Soraya pour croire en moi, me pousser de l'avant, pour ta générosité et ton soutien. Merci Val pour ta grande générosité, pour ton aide dans les dernières manipulations, tes conseils et tout ce que tu fais pour le labo. Il faut que tu penses davantage à toi. Merci Véro pour nous permettre de travailler dans de bonnes conditions.

Enfin, bonne continuation aux derniers arrivés que je n'ai pas eu le temps de mieux connaître : Nat et Adrien et bonne thèse à Hussein. Et bon courage à Philippe. Merci à ceux qui sont déjà partis : Nicolas (un exemple d'organisation et adepte de petits jeux farfelus), Fouad (un esprit mordant qui sublime les autres). Manu, Fabrice, Hanane, Anthony, Marjorie, Virgmie, Emily, Caro, Cari....

J'ai eu l'occasion de devoir circuler dans l'institut. Je tiens à remercier nos maîtres en biologie moléculaire, Véronique et C)mil, pour leur grande disponibilité, pour m'avoir aidée à de multiples reprises et pour toujours nous accueillir avec plaisir malgré les invasions répétées. Un grand merci à mes amies Tong et Sabrina qui m'ont initiée au clonage et qui m'ont beaucoup conseillée ; et bien sûr merci Julie pour ton énergie hallucinante. Le labo ne serait pas le même sans Coco et sa bonne humeur. Merci pour ces années Corinne. Enfin merci Laure pour avoir partagé tes débuts avec moi.

Merci à Stéphane et Eileen pour m'avoir appris à générer des souris transgéniques. Ce furent les mois les plus stimulants de ma thèse du point de vue technique. Merci Eileen pour ton aide. Merci à Yoann, Stéphanie, Eva et aux autres membres de l'équipe.

Merci Pierre et Pascale pour m'avoir si gentiment formée au Southern blot.

Et quelques séjours à la VUB. Un énorme merci à Carlo et Karine pour leur aide, leurs conseils et leur gentillesse.

Merci à Anna d'être notre premier rayon de bonheur le matin. Merci d'être là.

Merci Louis pour nos discussions. Merci aux animalières. Merci aux souris.

Merci à ma belle famille pour être si adorable, pour m'avoir entourée et encouragée tout au long de ma thèse. Merci à ma famille, infaillible malgré la distance, pour m'avoir portée jusque là, pour être mon pilier et ma force.

Merci Eric pour avoir traversé les joies et les tourments à mes côtés, pour faire naître les premières et me guider dans les seconds. Merci de m'offrir im univers paisible et naturel.

Table des matières

INTRODUCTION_____________________________________________________________________ 1

I. Lescellulesdendritiques l

1.1. GENERALITES D'UNE REPONSE IMMUNE 1

1.2. L^es CELLULES DENDRITIQUES, UNE FAMILLE HETEROGENE 3

1.2.1. Distribution tissulaire et sous-populations murines 3

1.2.2. Développement des cellules dendritiques 7

IL L'ARN INTERFERENCE 12

11.1. L^es PETITS ARN NON CODANTS 12

11.1.1. Sources 12

11.1.2. Fonctions 14

11.2. BIOGENESE DES MIRNA/SIRNA ET MECANISME D'INTERFERENCE 16

11.2.1. Biogenèse des miRNA/siRNA 16

11.2.2. Mécanismes d'interférence 18

II. 3. L'ARN INTERFERENCE, UN OUTIL GENETIQUE 22

III. TRANSGENESE LENTIVIRALE 25

BUT DU TRAVAIL___________________________________________________________________ 27 RESULTATS ET DISCUSSION_________________________________________________________ 29

I. Decouvertedenouveauxgenespreferentiellementexprimesdanslescellules

DENDRITIQUES MURINES, 29

1.1. Decouvertedesgenes 29

1.2. TBC1D4 31

1.3. ANKRD57 39

IL GENERATION DE SOURIS LENTIGENIQUES. 43

n.l. VARIEGATION ET «SILENCING» DANS UN MODELE MURIN DE TRANSGENESE LENTIVIRALE 43

II. 2. Régulationde L'AcnvriE dupromoteurcomposite CAG aucoursdudéveloppementdes

LYMPHOCYTES T MURINS. 65

III. PHENOTYPAGE des SOURIS TRANSGENIQUES 73

CONCLUSION GENERALE____________________________________________________________79 ANNEXES_________________________________________________________________ 83

I. SEQUENCES DE L'ADNC ET DE LA PROTEINE TBC1D4 83

IL SEQUENCES DE L'ADNC ET DE LA PROTEINE ANKRD57 86

III. Materielet Méthodes 87

BIBLIOGRAPHIE_____________________________________________________________________99

Index des Figures et Tableaux

FIGURE 1 : Cellules dendritiques migratoires et conventionnelles: brève histoire d'une vie. 5 FIGURE 2 : Distribution tissulaire des cellules dendritiques murines. 6

FIGURE 3 : Développement des cellules dendritiques. 11

FIGURE 4 : miRNA: localisation génomique et structure des gènes. 12

FIGURE 5 : Biogenèse des miRNA. 13

FIGURE 6 : Sources génomiques des dsRNA à l'origine des endo-siRNA. 14

FIGURE 7 : Biogenèse des mi/siRNA. 17

FIGURE 8 : Domaines protéiques de la protéine Argonaute Ago. 18

FIGURE 9 : Modèles de mécanismes d'interférence. 20

FIGURE 10 : Expression préférentielle de TBCld4 et Ankrd57 dans les cellules dendritiques. 29 FIGURE 11 : Expression préférentielle de TBCld4 et Ankrd57 dans les cellules dendritiques. 30 FIGURE 13 : Tbcld4 présente un transcrit unique dans les cellules dendritiques. 31

FIGURE 14 : L'ADNc isolé coderait effectivement pour TBCld4. 32

FIGURE 15 : Modulation de l'expression de TBCld4. 33

FIGURE 16 : Etude de TBCld4 par spectrométrie de masse. 34

FIGURE 17 : L'atténuation de TBCld4 ou Ankrd57 n'occasionne pas de défaut dans les capacités

immuno-stimulatrices des BMDC. 36

FIGURE 18 : Mauvaise efficacité des mir-shRNA sélectionnés afin de moduler l'expression de TBCld4.

37 FIGURE 19 : TBCld4 participe à la régulation du trafic intracellulaire de GLUT4. 38 FIGURE 20 : Motifs Ankyrine: structure d'une répétition et niveau de conservation. 39

FIGURE 21 : Modulation de l'expression d'Ankrd57. 40

FIGURE 22 : Profil d'expression de la protéine Ankrd57 endogène. 41

FIGURE 23 : Localisation cytoplasmique de la protéine Ankrd57. 42

FIGURE 24 : Activité du promoteur CAG au cours du développement des lymphocytes T. 66 FIGURE 25 : Efficacité de la modulation d'Ankrd57 in vitro et in vivo. Ti

FIGURE 26 : L'atténuation d'Ankrd57 n'occasionne pas de défaut dans les capacités immuno-

stimulatrices des cellules dendritiques. 75

FIGURE 27 : Réponse normale des cellules dendritiques et des cellules T suite à l'injection de CFA-

KLH dans les souris sous-exprimant Ankrd57. 75

FIGURE 28 : La surexpression d'Ankrd57 entraîne une augmentation du nombre de cellules

dendritiques, de macrophages et de lymphocytes B spléniques. 76

FIGURE 29 : Expression d'Ankrd57 dans les lymphocytes B et T. 77

FIGURE 30 : L'hybridation soustractive suppressive 90

FIGURE 31 : Représentation schématique de la construction pW-shRNA et des vecteurs dont elle est

dérivée. 93

FIGURE 32 : Détection des anticorps spécifiques des peptides TBCld4 et Ankrd57. 94 FIGURE 33 : Représentation schématique des différents transgènes et des sites de restriction des

enzymes utilisées pour les analyses par southem blot. 98

TABLEAU 1 : Facteurs de transcription intervenant dans le développement des sous-populations de

cellules dendritiques 10

TABLEAU 2 : Protéines reconnues par les anticorps polyclonaux anti-TBCld4 produits au laboratoire.

34

TABLEAU 3 : Séquences des shRNA clonés dans le vecteur pSicoR 92

Liste des abréviations

ADNc Acide DésoxyriboNucléique complémentaire

ARN Acide RiboNucléique

ARNm ARN messager

BMDC Bone Marrow derived Dendritic Cells

cDC Cellules Dendritiques conventionnelles

CDP Progéniteur Commun des cellules Dendritiques

CLP Progéniteur Commun Lymphoïde

CMH Complexe Majeur d'Histocompatibilité

CMP Progéniteur Commun Myéloïdes

DC Cellules Dendritiques

dsRNA ARN double brin {double-stranded RNA)

Flt3-L FMS-related tyrosine kinase 3 - Ligand

GFP Green Fluorescent Protein

GM-CSF Granulocyte Macrophage - Colony Stimulating Factor

IFN Interféron

IRF IFN Regulatory Factor

KLH Keyhole Limpet Hemocyanin

LB Lymphocyte B

LC Cellules de Langerhans

LT Lymphocyte T

LTR Long Terminal Repeat

M-CSF Macrophage - Colony Stimulating Factor

MDP Progéniteur des Macrophages et cellules Dendritiques

miRNA micro ARN

NK cellule Natural Killer

ORF phase ouverte de lecture {Open Reading Frame)

OTE Off Target Effect

PAMP P athogen-Associated Molecular Pattern

PCR Polymerase Chain Reaction

pDC Cellules Dendritiques plasmacytoïdes

piRNA Piwi-interacting RNA

pre-miRNA précurseur du miRNA

pri-miRNA précurseur primaire du miRNA PRR Pattern Récognition Receptor

RISC RNA-Induced Silencing Complex

RNase RiboNucléase

RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

shRNA short hairpin RNA

siRNA short interfering RNA

STAT Signal Transducer and Activator of Transcription

Th cellule T auxiliaire (T helper ceïl)

Tip-DC Cellules Dendritiques produisant du TNF-a et de l'iNOS

TLR Toll Like Receptor

UTR UnTranslated Région

Introduction

I. Les cellules dendritiques

1.1. Généralités d'une réponse immune

Le système immunitaire a été ciselé par l'évolution pour permettre aux organismes multicellulaires de vivre en dépit de toutes les agressions perpétrées par des agents qui ont développé des modes de vie parasitaires. Notre organisme maintient ime certaine intégrité face à ces menaces extérieures mais également intérieures, à cause de la formation de cellules oncogènes. Cette intégrité résulte de la mise en place de ce système de défense de plus en plus perfectionné.

La peau et les muqueuses forment un premier édifice, une défense à la fois physique, chimique et microbicide, qui fait bloc contre la majorité des menaces extérieures. Certaines tentatives d'intrusion ne sont toutefois pas vaines. Les pathogènes s'immiscent dans les brèches de cette barrière lorsqu'elle est endommagée ou lorsqu'ils ont développé des stratégies d'invasion.

C'est à ce niveau qu'intervient le système immunitaire. Il est le fruit de la collaboration étroite de diverses cellules qui agissent sous forme de deux vagues coordonnées. La première, ou réponse innée, est souvent suffisante pour endiguer l'infection. Ses acteurs principaux sont les macrophages, les granulocytes et les cellules tueuses naturelles. Ils identifient les agents infectieux grâce à des réceptetirs nommés PRR (Pattern Récognition Receptor) qui reconnaissent des signatures commîmes aux pathogènes, appelées PAMP (Pathogen- Associated Molecular Pattern). Une fois activés, ils se différencient en cellules effectrices avec à leur disposition tout un arsenal - chimokines, protéines du complément, produits toxiques tels que les superoxydes, lysozymes ... - qui leur permettent d'éradiquer très rapidement les agents pathogènes.

Parfois, cette inflammation ne suffit pas et xme deuxième vague de défense spécialisée est nécessaire : la réponse adaptative. L'immunité innée aura toutefois alerté l'organisme du danger présent et offert le temps aux cellules spécialisées de se mobiliser, en limitant l'expansion des pathogènes. Les protagonistes de ce deuxième acte sont les lymphocytes B et les lymphocytes T. Ces cellules peuvent générer un vaste répertoire de récepteurs, d'une telle diversité qu'üs pourraient reconnaître les composants antigéniques de tout pathogène potentiel. Les lymphocytes B sont responsables de la réponse humorale qui participe à

Introduction : Les cellules dendritiques ^-1^-

rélitnination des pathogènes extracellulaires. Ils sont capables de reconnaître les structures antigéniques sous leur forme native. Les lymphocytes T, quant à eux, ont besoin du concours de cellules présentatrices d'antigènes dont les plus performantes stimulatrices d'ime réponse immune primaire sont les cellules dendritiques^ ^

Les cellules dendritiques se situent à la frontière entre rtmmxmité innée et l'immunité adaptative. Elles sont à la fois capables de recruter des effecteurs de l'immunité innée et de les activer^ mais elles sont aussi responsables de l'mitiation et de l'orchestration de la réponse immune adaptative^.

Dans les tissus périphériques, les cellules dendritiques dites inunatures surveillent la présence de pathogènes. Elles échantillonnent continuellement l'environnement, en alerte du moindre danger. EUes sont douées pour la capture active d'antigènes et leur apprêtement sous forme de peptides associés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibüité (CMH). EUes migrent ensuite du lieu d'infection vers les organes lymphoïdes secondaires où se localisent les lymphocytes T. Cette migration s'accompagne d'un processus dit de maturation. Les cellules dendritiques expriment alors des niveaux élevés de marqueurs de maturation (CMH

n,

CD80, CD86, CD40, CCR7). De plus, le contexte inflammatoire et la nature du pathogène modulent l'information que va transmettre les ceUules dendritiques aux ceUules T. Ces facteurs environnementaux et intrinsèques les rendent compétentes pour initier une réponse spécifique de l'antigène®.

Les ceUules dendritiques doivent déUvrer trois signaux afin d'engendrer l'expansion de ceUules T effectrices®- Le premier consiste en la présentation du peptide antigènique dans tm contexte de CMH. Le deuxième est apporté par l'expression de molécules costimulatrices teUes que CD80, CD86. Enfin, le troisième est conduit par l'expression de médiateurs qui polarisent la différenciation des lymphocytes T CD4+ (ou T auxiÜaires) tels que l'interleukine- 12, les Ugands de Notch... Pour être pleinement immimogéniques (ou fonctionneUement matures®), ü semble nécessaire que les ceUules dendritiques interagissent directement avec les pathogènes - un contexte inflammatoire n'est pas suffisant^ et pourrait même entraîner la tolérance. EUes expriment un large répertoire de PRR^®. Les signaux transduits par ces récepteurs induisent l'expression de molécules (signal 3) qui orientent la réponse immune de la manière la plus appropriée pour éliminer le pathogène.

Les ceUules dendritiques instruisent les lymphocytes T CD4+ vers les voies Thl, Th2” ou Thl7’l La première voie engage une réponse de type cytotoxique en activant les ceUules effectrices T CD8+, spécialisées dans l'éviction des agents infectieux intraceUulaires. Les lymphocytes T CD8+ peuvent également être directement activés par les ceUules dendritiques via leur interaction avec le complexe antigène/CMH I. La voie Th2 solUcite les l)miphocytes B

dans l'élimination de pathogènes extracellulaires (parasites) tandis que la voie Thl7 joue un rôle crucial dans la défense de l'hôte contre des pathogènes face auxquels les cellules Thl et Th2 ne dispensent pas de réponse adéquate (bactéries extracellulaires, champignons).

La réponse adaptative marque l'organisme du souvenir de cette rencontre en développant des lymphocytes B et T de mémoire. Elle dispense donc une mémoire tmmimologique à l'infection : lors d'une deuxième rencontre, la défense s'organise plus vite, plus fortement et de façon plus spécifique.

1.2. Les cellules dendritiques, une famille hétérogène

1.2.1. Distribution tissulaire et sous-populations murines

Les cellules dendritiques comportent tout un répertoire de sous-populations aux caractéristiques particulières. Leur phénotype, leur localisation, leur génération et leur capacité à influencer le devenir des cellules T sont propres à chacune. Elles peuvent être regroupées en diverses catégories, mais il n'existe pas de classification stricte’^i®.

1.2.1.1 Les cellules dendritiques migratoires

Sous ce nom sont rassemblées les cellules de Langerhans qui se localisent particulièrement dans l'épiderme*® et les cellules dendritiques interstitielles situées dans le derme et les muqueuses*^- Elles se développeraient localement dans les tissus périphériques à partir d'xm réservoir de précurseurs immédiats. Toutefois, lors d'ime inflammation, les monocytes sanguins participeraient à leur renouvellement*’'

Les cellules dendritiques migratoires échantillonnent leur environnement en permanence. En conditions non inflammatoires, elles collectent les moindres traces de cellules sénescentes et apoptotiques qu'elles apprêtent en association aux glycoprotéines du CMH^*-^. Elles voyagent .via le réseau lymphatique afférent pour atteindre les ganglions drainants^, en adoptant un phénotype de cellules dendritiques semi-matures^^. Le trafic vers les ganglions requiert l'expression du récepteur CCR7“. Là, elles peuvent présenter les antigènes endogènes aux cellules T. Elles participent ainsi continuellement à la tolérance périphérique^®-^*'.

Dans un contexte inflammatoire, leur migration s'accélère, les marqueurs de maturation s'expriment plus fortement, elles perdent leur capacité d'endocytose et deviennent fonctionnellement aptes à activer les cellules P®.

Nous ne savons pas encore si elles activent elles-mêmes directement les lymphocytes T. En effet, elles seraient capables de transférer les antigènes puisés en périphérie aux cellules dendritiques qui résident dans les organes lymphoïdes secondaires^’ ®^. De plus, ime fois dans

Introduction : Les cellules dendritiques ^-3^-

les ganglions, elles enclencheraient xm processus d'apoptose^^-ss. Les cellules dendritiques résidant là pourraient alors endocyter ces corps apoptotiques et les présenter, amplifiant ainsi la réponse (Figure 1 et Figure 2).

La mobilisation des cellules dendritiques migratoires diffèrent selon les conditions expérimentales^®. Les cellules de Langerhans rejoindraient les ganglions plus tardivement que les cellules dendritiques interstitielles, alors que la réponse serait déjà établie et probablement initiée par les secondes^^- 3®. De plus, au sein des ganglions lymphatiques, les deux sous- populations ont des localisations distinctes qui seraient dictées par leur phénotype et leur statut de maturations^. Cela leur permettrait d'exercer des fonctions non redondantes dans la réponse immxme. Ces fonctions ne sont pas encore précisément définies. Les cellules de Langerhans pourraient avoir vm rôle central dans l'initiation de la réponse ou jouer im rôle knmimorégulateur en entretenant cette réponse.

I.2.1.2 Les cellules dendritiques résidant dans les organes lymphoïdes ou cellules dendritiques conventionnelles (cDC)

En plus des cellules dendritiques migratoires qui les visitent continuellement via la lymphe afférente, les ganglions renferment des cellules dendritiques résidentes. Elles se développent à partir de précurseurs médullaires arrivant par les vaisseaux sanguins^® et résident dans les organes lymphoïdes.

En absence d'infection, les cellules dendritiques résidentes maintiennent un phénotype immature tout au long de leur vie, ce qui les distingue des cellules dendritiques migratoires.

Par contre, la rencontre avec des produits pathogènes ou des signaux inflammatoires cause leur maturation in

La rate ne comportant pas de réseau lymphatique, les cellules dendritiques migratoires n'y ont pas accès. Dans cet organe, tout comme dans les ganglions lymphatiques, les cellules dendritiques résidentes peuvent se subdiviser en deux sous-populations majeures. Elles ont en commxm ime forte expression de l'intégrine CDllc et de la molécule CMFi II : les CDllb' CD8a* CD4' CD205* se trouvent principalement dans la zone des cellules T alors que les CDllb"^ CD8a- CD4"^ CD205' se localisent majoritairement dans la zone marginale^- Cette dernière population, la plus nombreuse, regroupe également les cellules double-négatives CD8a- CD4'. EUes sont communément appelées cDC CD8a+ et CD8a-. Elles diffèrent dans leur fonction immune” incluant la production de cytokines et la présentation des antigènes^®.

Les cDC CD8a- sont spécialisées dans la présentation via le CMH II tandis que les cDC CD8a+ dans la présentation dans le contexte de CMH I. Les cDC CD8a+ sont les seules capables de cross-présentation, c'est-à-dire présenter im antigène exogène dans le contexte de CMH I^. EUes joueraient également un rôle majeur dans la tolérance périphérique^®.

Dans une rate au repos, les cellules dendritiques résidentes ne naissent pas des monocytes.

Des observations indiqueraient que leurs précurseurs résident dans la zone marginale, tels des cellules dendritiques immatures, permettant vm renouvellement local^- Le Flt3-L (FMS- related tyrosine kinase 3 Ligand)"*^ et la lymphotoxine-a^ contrôlent leur remplacement homéostatique (Figure 1 et Figure 2). Dans un contexte inflammatoire, les cellules dendritiques résidentes deviennent matures et se mobilisent de la zone marginale vers la zone T de manière CCR7-dépendante'‘^'

Le thymus comprend aussi des cellules dendritiques résidentes. Leur rôle principal est d'induire la tolérance centrale en présentant des antigènes du soi aux thymocytes en développement^^' La plupart des cellules dendritiques thymiques sont des cDC CD8a+.

Elles seraient générées localement à partir de progéniteurs précoces. Cependant, des travaux récents suggèrent que des cellules dendritiques circulantes peuvent entrer dans le thymus et seraient impliquées dans la tolérance centrale et l'induction de cellules T régulatrices^^-

Figure 1 : Cellules dendritiques migratoires et conventionnelles: brève histoire d'une vie.

Les DC migratoires immatures surveillent en périphérie où elles sont renouvelées localement. Elles échantillonnent leur envirormement et rejoignent les ganglions lymphatiques drainant via la lymphe afférente en adoptant un phénotype de DC semi-matures. Lors d'une inflammation (+), les monocytes sanguins participent à leur renouvellement et elles adoptent un phénotype mature au cours de leur migration. Dans les ganglions, soit elles interagissent directement avec les lymphocytes T, soit elles transfèrent leur capture aux DC résidentes. Les cDC se renouvellent à partir de précurseurs qui résident dans l'organe même. Le Flt3-L et la lymphotoxine-a réguleraient leur homéostasie. Les cDC présentent un phénotype immature toute leur vie, à moins d'être stimulées. En ce cas, elles subissent le processus de maturation et gagnent les zones où se localisent les lymphocytes T. Adapté de Villadangos et al. (2007)^.

Introduction : Les cellules dendritiques -5-

1.2.1.3 Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC)

Le groupe de Shortinan définit les pDC comme des cellules dendritiques circulantes.

Elles voyagent en effet dans le réseau sanguines- ^ et se retrouvent dans la moelle osseuse, la rate, le thymus, les ganglions et le foie (Figure 2). Les pDC CDllc'°'^ CDllb" B22Cb LyéC"^

pDCAl^ se distinguent des cDC car elles requièrent des étapes développementales de façon à acquérir la morphologie caractéristique des cellules dendritiques et leur pleine fonction. Elles y parviennent après activation, suite à xme exposition à des virus, des bactéries ou des agonistes de certains TLR (Toll Like Receptor, vme variété de PRR)'®.

En situation non inflammatoire, elles tiennent un rôle dans la surveillance des pathogènes.

Une fois activées, elles produisent des chimokines et des cytokines inflammatoires dont des quantités massives d'interférons de type I (cette caractéristique leur est unique)^’’. Elles sont ainsi capables d'alerter les acteurs du système inné. De plus, elles adoptent une fonction de cellules dendritiques et ont le potentiel d'activer les cellules De part ces critères qui les définissent, elles sont considérées comme d'importants médiateurs liant le système inné et le système adaptatif.

Le temps de vie des pDC différenciées dans la rate et les ganglions est très court. Elles doivent être continuellement renouvelées via le sang^®. Elles peuvent être générées à partir du même précurseur médullaire que les cDC du moment que le progéniteur exprime le récepteur Flt3®’.

Figure 2 : Distribution tissulaire des cellules dendritiques murines.

Les DC CD103+ et CD103- sont des sous-populations de DC interstitielles. Les pourcentages représentent la fréquence de ces sous-populations par rapport à la totalité des cellules hématopoïétiques nucléées. Les jours (d) indiquent le temps de renouvellement d'environ 50% de la population considérée. *ganglions drainant la peau; **épiderme; + présentes mais nombre exact inconnu; f présentes lors d'une inflammation. Extrait de Merad & Manz (2009)''*.

Environmental Contact Sites

Immune Priming Sites

1.2.1.4 Les cellules dendritiques inflammatoires

Enfin, ü existe des cellules dendritiques qui se différencient exclusivement en conditions inflammatoires. Il s'agit des Tip-DC qui sécrètent de fortes doses de TNF-a et d'iNOS. Elles ont été identifiées dans la rate de souris infectées par Listeria monocytogenes^'^.

Suite à une infection®^ ou ime inflammation^, elles se différencient à partir de monocytes sanguins^' et sont recrutées au niveau des organes lymphoïdes secondaires grâce à un mécanisme dépendant de CCR2.

Les cellules dendritiques générées in vitro à partir de cellules de moelle osseuse dérivées en présence de GM-CSF leur correspondraient^.

1.2.2. Développement des cellules dendritiques

L'hématopoïèse est contrôlée par les effets combinés de facteurs de croissance qui induisent la prolifération cellulaire et de facteurs de transcription qui activent les gènes spécifiques d'une lignée. La sélection d'une lignée implique le choix entre des voies alternatives et l'activation d'une voie serait accompagnée par la suppression d'une autre.

1.2.2.1 Progéniteurs

Les cellules souches hématopoïétiques donnent naissance à des progéniteurs qui perdent la capacité de se renouveler et resserrent progressivement leurs options développementales pour aboutir à une lignée cellulaire.

L'équipe du professeur Weissman a identifié les progéniteurs clonogérdques précoces qui ont le potentiel de donner les branches hématopoïétiques lymphoïde (comprenant en définitive les lymphocytes B, T, les NK...) et myéloïde (granulocytes, macrophage, érythrocytes...). Il s'agit des progéniteurs cormnuns lymphoïdes (CLP, tin- IL7R+ ckiti) et myéloïdes (CMP, lin- ILTR- ckiti)®^- Le transfert adoptif de ces progéniteurs dans des souris congéniques irradiées a révélé leur capacité à se développer, indistinctement, en toutes les sous-populations de cellules dendritiques*’'’’^ Cette propriété serait due à l'expression du récepteur Flt3. Les CLP et CMP l'expriment en effet de façon hétérogène. Or, seules les fractions Flt3+ se différencient efficacement en cDC et pDC’^'^^.

Plus récemment, il a été montré que le progéniteur Lirr cKit""* Flt3"^ M-CSFR* CX3CR1*, appelé MDP (Macrophage and Dendritic cell Progenitor), pouvait donner naissance aux monocytes, macrophages, cDC et pDC. Il se situerait en aval des CLP et CMP car ses options

Introduction : Les cellules dendritiques ^-7^-

développementales sont davantage restreintes à la voie de différenciation des cellules dendritiques^®'

Un autre progéniteur, nommé CDP (Common Dendritic cell Progenitor’^ ou encore pro-DO®), partage un phénotype de surface similaire aux MDP. Toutefois, ce progéniteur génère seulement des cDC et pDC. Son potentiel de différenciation étant plus réduit, il représenterait un précurseur plus tardif que les MDP^^- ®®.

Enfin, le précurseur pre-cDC^®- a la capacité de se différencier en cDC mais pas en pDC (Figure 3).

I.2.2.2 Cytokines

Le rôle principal des cytokines dans l'hématopoïèse est la régulation des chemins adressant les progéniteurs à des destinées particulières.

Le Flt3-L apparaît indispensable au développement des cellules dendritiques. Comme mentionné précédemment, seuls les progéniteurs hématopoïétiques exprimant son récepteur se différencient en cellules dendritiques. N. Onai et al.^ ont même montré que la transduction de Flt3 dans des progéniteurs Flt3- suffit à instruire la différenciation de cDC et pDC. D'autre part, son absence (invalidation ou utilisation d'inhibiteurs) ou celle du facteur de transcription STAT3, membre crucial de la cascade de signalisation via le récepteur Flt3, entraîne vme diminution drastique des sous-populations de cellules dendritiques®®^. A l'inverse, sa surexpression augmente leur nombre®®. Des niveaux de Flt3-L bioactif sont mesurables dans le sérum de souris naïves et augmentent en conditions inflammatoires ou de stress hématopoïétique. Ses niveaux sont ajustés via xme boucle régulatrice qui assure rme production suffisante de cellules dendritiques à l'état de repos et sur demande^^.

Au contraire, le GM-CSF ne semble pas jouer un rôle prépondérant dans la génération des cellules dendritiques. Bien qu'fn vitro ü inhibe le développement des pDC®’’ et induise la différenciation de cellules dendritiques à partir de progéniteurs de moelle osseuse®®, son invalidation ou celle de son récepteur n'occasionne pas de défaut in vivo dans leur développement en conditions non inflammatoires. Inversement, des souris transgéniques surexprimant du GM-CSF ne présentent que des changements très modérés dans le nombre de cellules dendritiques®®' ®’. Par contre, alors qu'U n'est pas détectable dans le sérum de souris naïves, à la différence du Flt3-L, il augmente durant l'inflammation®®. Plusieurs études relatent sa probable importance dans le développement et l'activation des cellules dendritiques inflammatoires®®' ^®' ®®.

Cependant, xme étude récente rapporte que Flt3-L et GM-CSF pourraient agir de concert dans l'homéostasie des cellules dendritiques in vivo, en absence de signaux inflammatoires. La double invalidation Flt3-L-/-GM-CSF-/- induit en effet xme diminution massive du nombre des

progéniteurs MDP et CDP, supérieure à celle observée dans les souris FltS-L ^' (elle n'est pas significative dans les souris GM-CSF'^ ). Le nombre de cellules dans certaines sous-populations de cellules dendritiques interstitielles est également diminué de façon synergique. Ainsi, les auteurs suggèrent que le GM-CSF, bien que difficilement détectable in vivo sans stimulation, pourrait être impliqué dans le développement et/ou la maintenance des cellules dendritiques^*.

L'étude des souris (op/op), déficiente pour M-CSF (ou CSF-1), n'a révélé qu'une très faible influence de ce facteur de croissance sur le développement des cellules de Langerhans^^

A l'opposé, les souris déficientes pour son récepteur ne présentent ni monocytes ni cellules de Langerhans. Les travaux menés sur cette souris ont montré que les cellules de Langerhans dériveraient des monocytes de façon M-CSF dépendante. L'hormone serait cruciale pour la survie et la différenciation des monocytes et serait donc requise au développement des cellules de Langerhans, et ce en situation inflammatoire ou non^».

La connaissance actuelle des différentes sous-populations de cellules dendritiques et de leurs caractéristiques particulières a remis en question nos connaissances sur les propriétés intrinsèques et physiologiques des cellules dendritiques générées in vitro à partir de progéniteurs médullaires et sur l'utilisation que nous en avions. Il est désormais admis que les cultures additiormées de Flt3-L permettent de produire des cellules équivalentes aux cDC CD8a+, CD8a- et pDC tandis que les cellules générées en présence de GM-CSF correspondent aux cellules dendritiques inflammatoires^-

I.2.2.3 Facteurs de transcription

Un résumé succinct des facteurs de transcription impliqués dans le développement des sous-populations de cellules dendritiques est repris dans le Tableau 1 page suivante et dans la Figure 3.

Introduction : Les cellules dendritiques -9-

Tableau1:Facteursde transcriptionintervenant dans le développementdes sous-populationsde cellulesdendritiques

Facteur de

transcription Technique cDC CD8a+ cDCCDSa- pDC LC DCinfl : culture in

vitro + GM-CSF Notes Ref.

StatS"'^*'”' X Tie2-Cre: déplétion dans les cellules U U il Non requis Appartient à la voie de signalisation via Flt3-l. 83

hématopoïétiques Requis durant la transition CMP/CLP-MDP

STAT3 Surexpression et activation de STAT3 dans progéniteurs hématopoïétiques Flt3*

Rétablies Rétablies Rétablies Indispensable au développement des DC via Flt3-I. 82

+ + + ND -

SM5 ^ t Rôle fondamental dans l'inhibition du développement des 278

STAT5 pDC via le C.M-CSF: GM-CSF—ST/1T5-| IRFS—pDC

- - - ND

IRF2 Irp' U ^{4 LC CD4+ 279}

- + - +/- ND

Irfé ' U ²⁸⁰

1RF4 U 1 U ²⁸¹

- +/- ND

U U ²⁸¹

IRF8 IrfS* U U Développement et trafic des LC altérés 282

i Cuit. GM-CSF: phénotype immature, défaut de migration 283

+ - + +/- -

Spi-B siRN A dans progénileurs CD34+ humains î T U ²⁸⁴

- - + ND ND

RelB RelB^ U ²⁸⁵

- + ND - ND

PU-1 ' il Pas différenciation 286

PU-1 siKN A dans progéniteurs CD34+ humains U il U ²⁸⁴

Expression ectopique de PU-1 dans MEP Différenciation Différenciation Différenciation 82

+/- + + ND +

Id2 idi" U U TCFfi-ldl^DCi TGfp-.M2-| LB 288

+ - - ND

Gfi-l ■' U ^il U î Pas différenciation 288

+ + + - +

Batf3 Balp' U ²⁸⁹

+ - - ND ND

Ikaros dIv U U ^{ND 290}

Ikaros Ikaros Ik : très faible expression d'Ikaros Normales Normales U ²⁹¹

+? +? + ND ND

—I inhibe; 4 diminution; jj diminution massive; î augmentation; + requis; +/- partiellement requis; - non requis; ND non déterminé cDC: DC conventionnelles; pEX!^: EXT plasmacytoïdes; LC: Cellules de Langerhans; Dcirtfl: IXT inflammatoires

Ikaros

pre-cDC

Figure 3 : Développement des cellules dendritiques.

Les cellules dendritiques jouent donc un rôle primordial dans l'orchestration d'une réponse immime et dans la tolérance. De nombreux traitements thérapeutiques tentent d'exploiter leurs capacités intrinsèques afin d'orienter, accentuer ou réfréner ces réponses. Il nous est donc apparu important d'approfondir nos connaissances quant à la biologie de ces cellules, notamment par l'étude de leur transcriptome. Or, l'ARN interférence est im nouveau moyen d'explorer la fonction d'un gène.

Introduction : Les cellules dendritiques ^-11^-

IL L'ARN interférence

L'ARN interférence est un mécanisme eucaryote conservé au cours de l'évolution, par lequel un petit ARN double brin non codant®^ guide, en général, la répression post- transcriptionnelle de TARN messager qui lui est complémentaire. « En général » car la régulation peut également s'exercer au niveau transcriptionneP^ et à l'encontre de toute attente, elle peut même conduire à une activation de la transcription’* et de la traduction’^.

II.l, Les petits ARN non codants

Les petits ARN non codants jouent des rôles essentiels dans divers processus biologiques tels que le développement, la différenciation cellulaire, la maintenance de la stabilité du génome et la défense antivirale. Chez les animaux, trois types de petits ARN ont été décrits’®' ” : les micros ARN (miRNA), les petits ARN interférents (siRNA ou short interfering RNA) et les piRNA (Piwi-interacting RNA). Leur biogenèse (sources, voie de synthèse), les protéines avec lesquelles ils s'associent et leur taille permettent de les distinguer.

II.l.l. Sources

A peu près la moitié des gènes codant pour les miRNA dérivent d'unités de transcription indépendantes. Pour l'autre moitié, ils sont regroupés en amas. Un transcrit polycistronique permet alors de produire plusieurs miRNA distincts”-’®’. Leur localisation génomique les divise en quatre catégories, selon qu'ils se situent dans un intron ou un exon d'une unité de transcription codant pour une protéine ou non (Figure 4).

Unité de transcription non codante A miRNA intronique

DLEU2

1__ _______________ ___K _______

iSj

^.

miR-155 B miRNA exonique

BIC

Unité de transcription codante

miR-25-93-106b

Figure 4 : miRNA: localisation génomique et struchue des gènes.

Les gènes des miRNA sont soit isolés soit regroupés en amas. Ils se partagent en quatre catégories dépendant de leur localisation:

dans l'intron (A) ou l'exon (B) d'un gène non codant; dans l'intron (C) ou l'exon (D) d'un gène codant pour une protéine. Des miRNA connus et les gènes dans lesquels ils se situent sont donnés en exemple pour chaque catégorie. Adapté de Kim et al. (2009)®^.

Ainsi, certains se localisent dans les introns de gènes codant pour des protéines. De ce fait, ils dépendent de l'activité et de la régulation de leurs promoteurs. Le précurseur primaire du miRNA (pri-miRNA), qui a une structure en tige-boucle avec plusieurs bosses de mésappariements, est cHvé avant l'excision des introns’“ pour donner le pre-miRNA. Certains miRNA introniques, plus rares, appelés mirtrons, ne contiennent pas les séquences du pri- miRNA qui permettent ce clivage. Ces derniers sont excisés au cours de l'épissage et rejoignent la voie d'interférence après leur exportation dans le cytoplasme’“3-i05 (Figure 5).

Enfin, lorsque les loci des miRNA se trouvent dans des régions exoniques de gènes codant pour une protéine, le clivage du pri-miRNA peut déstabiliser le transcrit « hôte » et réduire sa traduction.

Gène miRNA

C

Transcription

pre-mRNA mirtron

Spliceosome Spl

X

^Epissage

mRNA mature

pre-mirtron

pre-miRNA

î

Figure 5 : Biogenèse des miRNA.

A) La plupart des gènes codant pour des miRNA sont transcrits par une ARN polymérase de type II (et parfois de type III) en transcrits primaires (pri-miRNA). Ceux-ci sont pris en charge par un complexe multiprotéique, appelé Microprocesseur, constitué de la RNase III Drosha et de la protéine DGCR8 chez l'homme. Il génère des précurseurs -70 nucléotides: les pre-miRNA. B) Un miRNA intronique est transcrit en même temps que l'ADN hôte et est clivé via le Microprocesseur avant l'épissage pour produire le pre-miRNA.

L'ARN restant est épissé et devient un ARN messager mature. C) Les mirtrons, qui ressemblent aux pre- miRNA, sont générés via le spliceosome. Adapté de Kim et al. (2009)^.

Pareillement aux miRNA, les siRNA ont une longueur de 21-24 nucléotides. Ils résultent du clivage d'un précurseur d'ARN double brin (dsRNA) parfaitement apparié - ou presque. Ils se divisent en deux populations : les exo-siRNA’® et les endo-siRNA’°®. Tandis que les premiers dérivent d'acides nucléiques invasifs tels que les virus, les seconds découlent de différentes sources génomiques notamment les éléments répétés^®^.

De façon plus exhaustive, les endo-siRNA peuvent provenir de transcrits endogènes présentant des structures en épingle à cheveux. Ils se distinguent des pri-miRNA par leur longueur plus conséquente et par l'absence de prise en charge par la même ribonucléase. Les dsRNA peuvent se former suite à la transcription de séquences répétées inversées comme des

Introduction : L'ARN interférence -13-

transposons ou des pseudogènes, suite à la transcription bidirectionnelle d'un élément transposable ou suite à la transcription convergente de deux gènes adjacents donnant des transcrits se recouvrant. Enfin, il a été montré que des transcrits de pseudogènes étaient capables de générer des siRNA en s'appariant au transcrit du gène fonctionnel apparenté^“®

(Figure 6).

Transcription de séquences répétées inversées

—^^—

---►

( Pseudoaène

1 ---►

Transcription convergente

Transcription bidirectionnelle

Trans-interaction Gène aoDarenté Pseudoaène --- rrOii III ■^iiifVn---

Figure 6 : Soiuces génomiques des dsRNA à l'origine des endo-siRNA.

Les flèches pleines représentent l'orientation tandis que les noires indiquent la transcription. Adapté de Ghildiyal &

Zamore (2009)’®.

Les piRNA sont les plus longs parmi les petits ARN non codants avec 25-27 nucléotides. Ils s'expriment spécifiquement dans les cellules germinales où ils interagissent avec les protéines Argonautes Piwi, d'où leur nom. Ils seraient produits à partir de précurseurs simple brin, ce qui les différencie des mi/siRNA. Ces transcrits proviendraient de régions génomiques dépourvues de gènes codant pour des protéines et enrichies en transposons et autres séquences répétées, arrangées en amas. Elles correspondraient à de l'hétérochromatine’°’.

La biogenèse des piRNA mammaUens reste encore hypothétique, celle des miRNA et siRNA sera développée ultérieurement, au chapitre n.2.1.

II.1.2. Fonctions

Les miRNA régulent l'expression d'ARN messagers impliqués dans divers processus biologiques”“. Maints mécanismes sont employés à cette fin : dégradation du messager, répression traductionnelle, activation de la transcription ou de la traduction (cf chapitre II.2.2).

Des études de prédiction par analogie de séquences augurent que plus du tiers des gènes humains serait la cible de miRNA”’. Un large panel est déjà décrit pour leurs fonctions critiques dans la biologie des cellules du système immunitaire et dans les réponses immunes’”'

Leurs rôles majeurs nécessitent par conséquent un contrôle précis afin de maintenir les fonctions cellulaires normales. Une dérégulation des miRNA est en effet souvent associée à des maladies humaines telles que le cancer”^”®.

Les siRNA jouent im rôle prépondérant dans la défense contre les virus”^. Chez les plantes, les siRNA générés à partir des dsRNA viraux servent de support à une ARN pol5rmérase dépendante de l'ARN qui amplifie leur nombre. Ces siRNA sont transportés dans le réseau vasculaire de la plante permettant une réponse systémique à l'infection initiale”^.

Lorsque le virus a été éliminé grâce au mécanisme d'interférence, les siRNA sont détruits. Il en reste toutefois quelques-ims dans la circulation. Ils servent de mémoire, rendant la plante résistante à une nouvelle infection par le même virus ou par des virus comportant des séquences similaires"®. Ce processus de mémoire rappelle inévitablement la réponse immvme adaptative développée chez les vertébrés. D'aüleurs, la question de savoir si la machinerie d'interférence intervient pour combattre les virus chez les mammifères est toujours un sujet de débat"’- Ces derniers possèdent des systèmes alternatifs de défense encore plus efficaces qui aurait pris le pas sur le mécanisme d'interférence: la réponse interféron qui se traduit par l'arrêt de la synthèse protéique et une dégradation non spécifique des ARN messagers de la cellule; et la réponse immrme adaptative, plus élaborée, qui offre une élimination spécifique et à mémoire d'un virus donné (cf chapitre I.l). Cependant, la réponse interféron serait absente dans les oocytes et les cellules souches embryonnaires, laissant supposer que la voie d'interférence pourrait alors prendre le relais"^'

Outre les agressions extérieures, les organismes doivent garder une attention particulière à leur propre génome. Il renferme en effet pour ime grande partie des réminiscences d'invasions passées par des virus et des éléments transposables. Certains transposons sont encore actifs et sont potentiellement dangereux pour leur hôte. L'ARN interférence semble activement limiter leur mobilité et leur nombre avec les endo-siRNA comme médiateurs dans les cellules somatiques. Dans les cellules germinales, les piRNA se joignent à eux dans cette survedlance^”. La protection du génome y est d'autant plus cruciale que les mutations causées par la transposition risquent de se propager aux générations suivantes. Les siRNA offriraient ime réponse rapide en dirigeant la dégradation des transcrits.

Les piRNA, quant à eux, guideraient la formation d'hétérochromatine par méthylation de l'ADN des transposons procurant une solution plus robuste et permanente^^^^.

Il est à noter qu'en ce qui concerne la surveillance de l'intégrité du génome et la défense antivirale, les sources des petites molécules d'ARN se révèlent souvent être à la fois inducteurs et cibles de la voie d'ARN interférence. Enfin, ü est intéressant d'envisager que les pseudogènes pourraient avoir un rôle régulateur en réprimant leur homologue fonctionnel par un mécanisme d'interférence.

Introduction : L'ARN interférence -15-

11,2. Biogenèse des miRNA/siRNA et mécanisme d'interférence

II.2.1. Biogenèse des miRNA/siRNA

Les gènes codant pour des miRNA sont transcrits par des ARN pol5Tnérases de type II ou Iir^*'’^® en longs transcrits primaires (pri-miRNA) contenant des structures en tiges-boucles locales imparfaites. Ces pri-miRNA sont subséquemment clivés dans le noyau par une ribonucléase de type lll nommée Drosha'^® en précurseurs d'environ 70 nucléotides (pre- miRNA). Drosha interagit avec la protéine DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Région Gene 8 chez l'homme ou Pasha chez la drosophile et C. elegans) qui contient deux domaines de Liaison aux dsRNA, pour former le complexe protéique appelé Microprocesseur^^^^^.

Les précurseurs des endo-siRNA naissent aussi dans le noyau. Néanmoins, le mécanisme par lequel ils sont transportés dans le cytoplasme est inconnu.

Les pre-rruRNA sont activement exportés dans le cytoplasme via le récepteur nucléaire Exportine 5 de manière RanGTP-dépendantei^' C'est également dans le cytoplasme que se localisent les longs dsRNA à l'origine des siRNA. Là, les différents précurseurs sont reconnus par la RNase

ni

Dicer’^. Elle génère des duplexes d'ARN exposant un groupement phosphate en 5' et 2 nucléotides débordant en 3' - pareillement à Drosha et caractéristiques des produits de clivage de ces endonucléases.

Le pre-rrûRNA est cHvé par Dicer à environ 22 nucléotides à partir de l'extrémité préexistante'^. Ainsi, Drosha prédétermine les séquences des miRNA matures en générant ime des terminaisons tandis que l'autre est créée par Dicer.

Plusieurs organismes contiennent plus d'im gène codant pour Dicer. Il semblerait alors que chaque protéine soit préférentiellement responsable de la prise en charge d'un précurseur d'une origine particulière'^®. Chez les mammifères, seul im gène est connu à ce jour. Cela laisse supposer que, dans ce cas, Dicer pourrait reconnaître différentes sources de dsRNA.

Les petits ARN non codants sont par la suite réarrangés dans le complexe multiprotéique RISC (RNA-Induced Silencing Complex) afin qu'ait lieu l'ARN interférence proprement dite. Bien que les deux brins soient capables de diriger l'interférence'^^, seul l'im d'eux entre dans le complexe'^. Les duplexes d'ARN doivent être dissociés afin de pouvoir guider la recherche du messager correspondant. En fait, ces petits dsRNA se composent d'un brin dit « guide ou anti-sens » complémentaire du messager ciblé et d'xm brin « passager ou sens ». La sélection du brin incorporé dans RISC serait gouvernée par le profil thermodynamique des terminaisons 5'. Les duplexes sont en effet, pour la grande majorité, dits asymétriques avec une plus faible stabilité au niveau de la terminaison 5' du brin guide'^'- '^. La séparation des brins est donc plus efficace de ce côté.

Ainsi, suite à la production des si/miRNA, Dicer dimérise avec une protéine contenant des domaines de liaison aux dsRNA (TRBP/PACT chez l'homme, R2D2/Loquacious chez la drosophile, RDE-4 chez le nématode C. elegans'*^) pour former le RISC-Loading Complex.

Tandis que Dicer interagirait avec le dsRNA au niveau de la terminaison de plus faible stabilité, son partenaire lierait la plus stable. L'hétérodimère faciliterait de la sorte le chargement directiormel du petit ARN double brin sur la protéine Argonaute qu'ü recrute'^.

Cette dernière détruirait le brin passager'^^^^’’ provoquant la libération du brin guide qui lui est stablement accroché et l'activation de RISC. Celui-ci peut alors retrouver l'ARN messager complémentaire et le réguler (Figure 7).

miRNA mature

Cytoplasme I I I

/ pri-miRNA

I Noyau .^^Drosha

•AAAAA

DGCR8

^ '/O,

siRNA mature

Gènes miRNA

/

mirtron

Spliceosome

dsRNA à l'origine des endo-siRNA (cf Fig. 6)

dsRNA à l'origine des exo-siRNA (virus)

Identification et régulation de la cible

Figure 7 : Biogenèse des mi/siRNA.

Dans le noyau, les gènes codant pour des miRNA sont transcrits en pri-miRNA puis sont pris en charge par le complexe Drosha-DGCR8. Drosha les clive en précurseurs nommés pre-miRNA. Dans le cas des mirtrons, le précurseur est clivé par le spliceosome. Les pre-miRNA sont ensuite activement transportés dans le cytoplasme grâce à l'exportine-5. Les endo-siRNA rejoignent le cytoplasme via un mécanisme encore inconnu.

Une fois dans le cytoplasme, pre-miRNA et dsRNA sont clivés par Dicer en petits duplex d'une vingtaine de nucléotides: miRNA et siRNA. Les brins sont dissociés dans le RISC-Loading Complexe. Seul le brin guide est conservé, entraînant l'activation du RISC qui peut alors identifier l'ARN messager ciblé et le réguler.

Introduction : L'ARN interférence -17-

La sous-unité principale de RISC est la protéine Ago. Elle appartient à la fairdlle des protéines Argonautes qui se divisent en deux sous-familles : les protéines ubiquitaires Ago et les protéines Piwi, restreintes aux cellules germinales. Elles se définissent par la présence de trois domaines hautement conservés : PAZ (Piwi-Argonaute-ZwUle), MID et PIWI. PAZ est un domaine de liaison à l'ARN qui recormaîtrait particulièrement les 2 nucléotides débordant en 3' du brin anti-sens des si/miRNA alors que MID se lierait au 5' phosphate. Le domaine PIWI, quant à lui, est impliqué dans l'interaction avec d'autres protéines telles que Dicer et aurait une activité RNase H chez certaines protéines Ago'^ (Figure 8). Chez l'homme, seule Ago2 possède cette activité^^’. Chez la drosophile, Agol et Ago2 la présentent : Agol serait caractéristique du clivage des ARN messagers guidé par les miRNA alors qu'Ago2 s'occuperait de celui dirigé par les siRNA.

Figure 8 : Domaines protéiques de la protéine Argonaute Ago.

Les protéines Ago contiennent trois domaines différents: PAZ se lie aux nucléotides débordant en 3' du brin guide des si/miRNA ; MID se lie au 5'P de ce brin ; PIWI a xme activité RNase H et cliverait le messager ciblé.

MID renferme un domaine MC qui se lie à la coiffe de l'ARN messager, empêchant ainsi l'initiation de la traduction.

II.2.2. Mécanismes d'interférence

Les protéines Argonautes jouent un rôle prépondérant dans les mécanismes de régulation des gènes. Ce sont des acteurs clefs de l'ARN interférence’^ qui peut s'exercer à différents niveaux : en général, elle peut jouer sur la stabilité du messager ou la répression de sa traduction’^. Les si/miRNA ont le même potentiel de régulation. Celui-ci reposerait sur le degré de complémentarité qu'ils présentent avec l'ARN messager spécifique et ne dépendrait pas de leur origine’®’- ’®2.