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l. Découverte des gènes

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Résultats et Discussion

I. l. Découverte des gènes

Le projet fut amorcé vers la fin des années 90. A ce moment là, la méthode d'analyse de transcrits différentiels qui est apparue la plus accessible est l'Hybridation Soustractive Suppressive^^®. Basée sur la RT-PCR, cette technique permet de générer ime banque d'ADN complémentaires (ADNc) exprimés préférentiellement dans xme population choisie (Annexe III). Pascal Mettens, en collaboration avec Fabienne Andris, a par ce biais comparé le transcriptome des cellules dendritiques matures à celui des lymphocytes B et T afin de mettre en évidence des gènes exprimés de manière spécifique dans les cellules dendritiques. La banque qu'il a préparée renferme environ 200 fragments de gènes non redondants. L'enrichissement en ADNc propres aux cellules dendritiques a été validé par l'absence de fragments codant pour des gènes de ménage et la présence de certains fragments caractéristiques du transcriptome des cellules dendritiques matures (tels que la molécule de costimulation CD86 et l'interleukine 12). Qiaque séquence isolée a été analysée par voie bio­ informatique et leur surexpression dans les cellules dendritiques de nouveau confirmée par RT-PCR.

Parmi les candidats, deux fragments de gènes dont la spécificité semblait la plus probante ont alors été sélectionnés (Figure 10). Aujourd'hui, leur appellation officielle est

tbcld4 (TBCl domain family, member 4 ou AS160 - Akt Substrate 160 kDa) pour le preirder et

ankrd57(A57 - Ankyrin repeat domaine 57) pour le second. La présente étude avait donc pour

finalité d'essayer de caractériser et d'identifier la fonction de ces deux gènes.

TBCld4 Ankrd57 HPRT 27,30,33 cycles ■m mDC LB LT

Figure 10 : Expression préférentielle de TBCld4 et Ankrd57 dans les cellules dendritiques.

Des cellules dendritiques et des lymphocytes B et T sont purifiés à partir de la rate de souris C57BL/6. L'ARN total en est extrait et rétrotranscrit. Le niveau d'expression de l'ARNm de TBCld4 et Ankrd57 est ensuite évalué par PCR semi-quantitative. Les échantillons sont normalisés via l'expression du gène de ménage HPRT.

La première partie du travail a consisté à retrouver la séquence contenant la région codante complète de chacun des gènes. Actuellement, cela peut paraître dérisoire étant donné la quantité prodigieuse de données exhaustives à disposition sur les banques informatiques. Mais, le séquençage des génomes murin et humain s'est achevé plus d'vm an après le début de cette recherche. L'obtention de ces séquences s'est donc révélée laborieuse et a nécessité une reconstitution de proche en proche.

A cette fin, Laurent Fraga a construit ime banque d'ADNc de cellules dendritiques spléniques murines (en collaboration avec le Dr Pierre van der Bruggen et le Prof. Thierry Boon du Ludwig Institute for Cancer Research, Brussels Branch). De multiples criblages de la banque susnommée, l'extension en 5' par l'utilisation de sondes correspondantes ou de la technique de race PCR et la consultation des banques de données bio-informatiques (telles que NCBI, TIGR, ENSEMBL, EXPASY, etc...) ont abouti à l'identification des phases ouvertes de lecture (ORF) complètes pour les deux clones retenus. Leur existence a été validée tout au long de la recherche par RT-PCR et séquençage et, leur expression préférentielle a été à nouveau vérifiée par RT-PCR quantitative entre différentes cellules du système immimitaire (Figure 11). En accord avec les objectifs de ce travail, le taux d'ARN messagers (ARNm) des deux gènes est plus élevé dans les cellules dendritiques que dans les lymphocytes B et T. De plus, ces gènes sont plus exprimés dans les cellules dendritiques matures que dans les immatures.

Figure 11 : Expression préférentielle de TBCld4 et Ankrd57 dans les cellules dendritiques.

Des cellules dendritiques et des lymphocytes B et T sont purifiés à partir de la rate de souris C57BL/6. Les cellules dendritiques immatures (iDC) sont fraîchement purifiées tandis que les matures (mDC) ont incubé une nuit à 37°C. L'ARN total extrait est rétrotranscrit et la quantité d'ARNm de TBCld4 (A) et Ankrd57 (B) est analysée par PCR quantitative. Les échantillons sont normalisés via l'expression du gène de ménage RPL13 dans les expériences 1 et 2, et RPL32a dans les expériences 3 et 4. Le taux d'ARNm est fixé à 100 dans les iDC.

Résultats et Discussion : Découverte de nouveaux gènes préférentiellement exprimés dans les cellules

-1.2. Tbcld4

Le gène codant pour TBCld4 (NCBI GenelD : 210789) se localise sur le chromosome 14 murin. Il est composé de plusieurs exons dont le nombre oscille entre 19 et 23 selon la source de données. Tandis qu'Ensembl suggère Texistence probable de 4 variants, MGI et NCBI ne lui reconnaissent qu'un transcrit (Figure 12).

Chromosome 14 Brin + loz.'oo Mb _ 101.90 Mb Transcrit MGI NM_00I0al27S-MGI:24296S0-Tbcld1 Transcrit NCBI Cm 10:210789-71x164 Transcrits ENSEMBL ENSMUST0000004l648-ncI64 ENSHUSTOOOOOl 10799-Tbcl 64 —_--4J--- ---Brin ■

Figure 12 : Tbcld4: Exons et transcrits putatifs rapportés selon différentes sources de données.

Aussi, afin de vérifier la possibilité d'tm épissage alternatif, nous avons mené des expériences de Northern Blot sur de l'ARN total de cellules dendritiques. Nous avons utilisé deux sondes différentes. La première couvre quasiment toute l'ORF et la seconde l'UTR 3' (Figure 13A). Ces deux sondes permettent chacxme de visualiser xm seul ARNm, de taiUe avoisinant les 6 kilobases (kb) (Figure 13B). Nous pouvons préstimer qu'ü s'agit du même transcrit et que TBCld4 ne présente donc qu'un seul variant dans les cellules étudiées. Nous avons également observé qu'il en était de même au niveau des lymphocytes B et des RAW (non montré). En revanche, nous n'avons pas exploré le phénomène au sein d'autres tissus où ü pourrait en être autrement.

Figure 13 : Tbcld4 présente un transcrit unique dans les cellules dendritiques.

A) Représentation schématique de l'ARNm TBCld4 et des sondes utilisées pour le Northern Blot. Le rectangle quadrillé représente le fragment de départ. B) Analyse de TBCld4 par Northern Blot sur des extraits d'ARN total de cellules dendritiques spléniques matures. Les membranes ont été hybridées indépendamment avec les deux sondes sjjédfiques de TBCld4. UTR5' B < Sonde UTR3'y ^__Sonde ORF ^

I ■■ M

UTR3' ORF mDC 9.5 7.5 -4.4 -

f

2.4 1.4

L'ADNc isolé contient une ORF de 3731 paires de bases qui code pour une protéine de 1243 acides aminés (Annexe I). D'après les banques de données bio-informatiques, la protéine TBCld4 contient deux motifs PTB (PhosphoTyrosine-Binding domain) et tm motif

(Tre-2, Bub2p, CDC16) hautement conservé qui interviendrait dans l'activation des petites GTPases et notamment des Rab GTPases. Ces dernières sont connues pour jouer divers rôles dans les trafics vésiculaires^^®. De plus, la protéine murine présenterait 89% d'identité de séquence avec la protéine humaine du même nom.

Dans le but de vérifier l'existence in vivo de cette protéine retrouvée in silico, nous

avons, dans un premier temps, contrôlé que l'ADNc isolé était bien traduit en une protéine de masse moléculaire estimée à 160 kDa. Nous avons cloné l'ORF supposée dans le vecteur d'expression eucaryote pCMV-SPORT6 et l'avons transfectée de manière transitoire dans des fibroblastes murins appartenant à la lignée cellulaire NIH-3T3. En parallèle, nous avons transfecté des cellules 3T3 avec im même plasmide comportant ime séquence codant pour la GFP. Ces cellules témoin nous ont permis de déterminer l'efficacité de transfection 48 heures plus tard par cytométrie de flux (Figure 14A). Les extraits protéiques totaux issus de toutes les cellules transfectées ou non ont été analysés par western blot. Afin de détecter la protéine TBCld4, nous avions au préalable généré des anticorps polyclonaux en immunisant des lapins avec tm peptide de synthèse correspondant aux 15 derniers acides aminés de la protéine, couplé à l'antigène porteur KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) (Annexe III). Malgré une reconnaissance aspécifique de nos anticorps (suggérée par la présence de plusieurs bandes identiques dans toutes les conditions) (Figure 16), ils permettent de visualiser ime protéine de masse moléculaire supérieure à 150 kDa, présente seulement dans les cellules surexprimant TBCld4 (Figure 14B).

A

B

TBCld4 Actine _ 250 kDa -150 kDa

Figure 14 : L'ADNc isolé coderait effectivement pour TBCld4.

Des cellules de la lignée N1H-3T3 ont été transfectées avec un plasmide contenant l'ORF putative de TBCld4 ou une séquence codant pour la GFP. A) Analyse du taux de transfection après 48h par cytométrie de flux effectuée sur les cellules transfectées avec la GFP. B) Analyse des extraits protéiques totaux par western blot. La protéine TBCld4 est reconnue grâce à des anticorps polyclonaux générés au laboratoire. L'actine est utilisée comme contrôle de chargement.

Résultats et Discussion : Découverte de nouveaux gènes préférentiellement exprimés dans les cellules

-Dans un deuxième temps, nous avons à nouveau réalisé cette expérience mais en présence ou non d'ARN interférents dirigés contre TBCld4, pour consolider les arguments indiquant que nous observons bien la protéine d'intérêt. Comme contrôle, nous avons utilisé des ARN interférents ciblant spécifiquement l'ARNm codant pour les protéines Ankrd57 et CDllc - polypeptide qui dimérise avec la molécule CD18 pour former l'intégrine pl50,95, caractéristique des cellules dendritiques. Ces ARN interférents ont été générés sous forme de shRNA clonés dans le vecteur lentiviral pSicoR (Figure ISA). La construction présente à la fois le gène rapporteur GFP, situé en aval d'un promoteur dépendant d'une pol5anérase de tjqje H, et l'ARN interfèrent, placé sous le contrôle d'un promoteur dépendant de la polymérase III. De cette manière, nous pouvons augurer que les cellules exprimant la GFP produisent également les ARN interférents. Comme observé Figure 15B, seul l'ARN interfèrent dirigé contre TBCld4 induit ime réduction de la protéine de plus de 150 kDa apparue dans les cellules surexprimant l'ORF. Il s'agirait donc bien de la protéine d'intérêt TBCld4.

A

Vecteur pSicoR loxP loxP — 51TR CPPT ihKHA- IH WPRE |-|a31Tr

[-B

TBCld4 Actine .(T oiT .6^ Kir

Figxire 15 : Modulation de l'expression de TBCld4.

A) Représentation schématique du vecteur lentiviral pSicoR dans lequel ont été clonés des ARN interférents dirigés contre TBCld4, Ankrd57 et CDllc. B) Des fibroblastes NIH-3T3 ont été co-transfectés ou non (NTF) avec les constructions précitées et le plasmide contenant l'ORF de TBCld4 comme cible. Les plasmides exprimant les ARN interférents ont été introduits deux fois en excès par rapport au plasmide exprimant TBCld4. Les extraits protéiques totaux ont été analysés par western blot, l'actine servant de contrôle de chargement.

Nous avons dès lors souhaité étudier le profil d'expression de la protéine endogène dans les cellules du système immunitaire. Malheureusement, les essais se sont révélés infructueux. Nous avons imaginé que son expression était trop faible et que sa visualisation requérait une méthode de détection plus sensible. Finalement, immtmoprécipiter la protéine endogène et l'identifier par spectrométrie de masse nous est apparu comme l'étape suivante et déterminante afin de valider l'approche en génétique inverse que nous avions choisie aux prémices de ce projet.

Ces expériences ont été effectuées sur une lignée de cellules dendritiques - la lignée FSDC^“. L'étude par western blot d'une partie des échantillons indique que l'anticorps itnmunoprécipite, entre autres, une protéine de masse moléculaire pouvant correspondre à TBCld4. L'autre partie des échantillons a été colorée au SYPRO Ruby (molécules fluorescentes très sensibles), puis, les bandes de gel intéressantes ont été excisées en vue d'ime identification au MALDITOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Light, réalisée en collaboration avec le Laboratoire de Protéomique, Biovallée). Les réponses apportées par l'expérience se sont montrées très concluantes : tout d'abord, notre anticorps reconnaît de manière moins spécifique quelques protéines murines telles que la thymopoiétine (Tableau 2) et surtout, la spectrométrie de masse identifie bien la protéine à 160 kDa que nous immunoprécipitons spécifiquement comme la protéine murine TBCld4 (Figure 16).

Excision Nom complet officiel Symbol officiel GenelD

A B/E

!

Myosin, heavy polypeptide 9, non-muscle [Mm] Myh9 17886

C No determined

F TBCl domain family, member 4 [Mm ] Tbcld4 210789

G Myosin IF [Mm ] Myolf 17916

H Myosin IG [Mm ] Myolg 246177

I Thymopoietin [Mm ] Tmpo 21917

I Gelsolin [Mm ] Gsn 227753

J Hematopoietic cell spécifie Lyn substrate 1 [Mm ] Hcisl 15163

3 Heat shock protein IB [Mm ] Hspal 15511

K No determined

L Actin

1 OK

2 OK

Tableau 2 : Protéines recoimues par les anticorps polyclonaux anti-TBCld4 produits au laboratoire.

(N + 4-» O 01 4-> a 4-» ’fô L. 4-» Z <u X û-(/) LU oi c 'l. ro û. (N CP HH O 1 O L. 3 ÿ. 3 Z2 U û. U Q.Z

Figure 16 : Etude de TBCld4 par spectrométrie de masse.

L'immunoprécipitation est effectuée sur un extrait protéique total de cellules FSDC. Suite à l'électrophorèse, l'ensemble des protéines est coloré au SYPRO Ruby, puis, les bandes de gel intéressantes (encadrées et annotées de A à L) sont excisées en vue d'une identification au MALDITOF. Les bandes 1 et 2 servent de blanc.

190 98 63 50 39 28 18 14 200 116.3 97.4 66.3 55.4 36.5 31 21.5 14.4

Résultats et Discussion : Découverte de nouveaux gènes préférentiellement exprimés dans les cellules

-34-Par la suite, nous avons abordé l'étude fonctionnelle de la protéine. Pour cela, nous avons choisi de moduler son expression en recourant aux ARN interférents, apportés dans les cellules par infection lentivirale. La cassette contenant le shRNA spécifiquement dirigé contre TBCld4 (pSicoR-shTBCld4, Figure 15) s'intégre de façon aléatoire dans le génome de la cellule hôte. Par conséquent, les cellules infectées portent chacune l'insert à un endroit différent et forment ime population polyclonale. Le phénotype observé n'est donc pas biaisé par l'influence du site d'insertion du transgène.

Nous avons ainsi atténué l'expression de TBCld4 dans des cellules dendritiques générées in

vitro à partir de progéniteurs myéloïdes (BMDC) - l'efficacité des ARN interférents avait été testée au cours des études protéiques. Les cellules exprimant la GFP (et supposément les ARN interférents) ont été triées par cytométrie de flux et cultivées soit en présence de lymphocytes

Tcd4+ allogéniques, soit avec des lymphocytes Tcd4+ de souris transgéniques OT-II (environ

90% de leurs lymphocytes Tcd4+ expriment un récepteur antigénique spécifique du peptide 323

à 339 de l'ovalbumine de poule, ou peptide OT-II). La première expérience nous informe sur la capacité des BMDC à stimuler des lymphocytes, indépendamment de leur aptitude à capturer et apprêter l'antigène. Ces compétences sont éprouvées grâce aux expériences OT-II pour lesquelles deux variantes sont appliquées. Pour Time, les BMDC sont chargées^ au préalable avec le peptide OT-II qui se fixe directement aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité présentes à leur surface, par compétition avec les peptides qui y sont déjà associés. Pour l'autre, la protéine ovalbumine (OVA) est ajoutée dans le milieu de culture. Les BMDC doivent capturer la protéine, la dégrader en peptides et les présenter dans le contexte des molécules du CMH.

Ces expériences n'ont montré aucime différence fonctionnelle par rapport aux cellules contrôles infectées avec les virus recombinants dont le génome contient la séquence codant pour la GFP mais pas d'ARN intéférent (Figure 17), aux cellules GFP- issues de la même culture - qui n'ont pas intégré le transgène -, aux cellules non infectées ou aux cellules Mock (non montré). Des expériences d'allo-MLR ont également été réalisées avec des FSDC infectées et ont montré des résultats similaires (non montré).

Nous avons aussi généré des souris chimériques en reconstituant des souris syngéniques létalement irradiées avec de la moelle osseuse sous-exprimant TBCld4, Ankrd57 ou CDllc. Malheureusement, nous n'avons pas pomsuivi l'analyse de ces souris à cause du très faible pourcentage de cellules GFP+ retrouvées après reconstitution.

B

E

ai c Z

Figure 17 : L'atténuation de TBCld4 ou Ankrd57 n'occasionne pas de défaut dans les capacités inununo- stimulatrices des BMDC.

Des cellules dendritiques ont été générées à partir de progéniteurs de la moelle osseuse de souris C57BL/6 dérivés en présence de GM-CSF. Au troisième jour de culture, les cellules sont infectées avec des lentivirus (MOI 15) dont le génome contient soit la séquence codant pour la GFP seule soit celle-ci et im ARN interfèrent spécifiquement dirigé contre TBCld4 ou Airkrd57. Au huitième jour de culture, les BMDC sont sélectioimées par cytométrie de flux sous base de l'expression de la GFP. Elles sont ensuite cultivées avec des l)onphocytes TCD4+ allogéniques ou issues de souris transgéniques OT-II. Pour le test OT-Il, les BMDC sont soit chargées au préalable avec le peptide OT-Il soit incubées avec la protéine OVA au moment de la culture. La prolifération (A) et la sécrétion d'IFNy (B) sont mesurées après 72H de culture. Ces résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes. Les graphiques représentent la moyenne ± la déviation standard.

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-Nous avons alors décidé de générer des souris qui sous-exprimeraient TBCld4, par transgenèse lentivirale. Comme énoncé dans l'introduction (chapitre Ü.3.), en 2005, l'équipe de SJ. Elledge^^® a conçu un système d'interférence dans lequel vm shRNA choisi est introduit dans un contexte de miRNA lui-même placé dans l'UTR 3' artificiel d'un rapporteur GFP dépendant d'ime polymérase de type II. Ainsi, les cellules produisent simultanément GFP et ARN interférents par le biais d'im promoteur fort. Mais, les nouveaux ARN interférents ciblant TBCld4, que nous avions sélectionnés et testés dans ce contexte, se sont avérés peu efficaces (Figure 18). Les clonages des nouveaux ARN interférents étant menés en parallèle pour Ankrd57, nous avons décidé de poursuivre seulement la caractérisation de cette dernière.

B

TBCld4

Actine

^ ^ ^ ^

Figure 18 : Mauvaise efficacité des mir-shRNA sélectionnés afin de moduler l'expression de TBCld4. A) Représentation schématique du vecteur lentiviral pWPXLd dans lequel ont été clonés des interférents dirigés contre TBCld4 et Ankrd57, placés dans un contexte de miRNA. B) Des fibroblastes NIH-3T3 ont été co­ transfectés ou non avec les constructions précitées et le plasmide contenant l'ORF de TBCld4 comme dble. Les plasmides exprimant les interférents ont été introduits deux fois en excès par rapport au plasmide exprimant TBCld4. Les extraits protéiques totaux ont été analysés par western blot, l'actine servant de contrôle de chargement.

Par ailleurs, cette même année, plusieurs articles relatifs à TBCld4 ont été publiés. Ils ont révélé son rôle, au niveau des adipocytes et des cellules musculaires, dans la rétention de GLUT4 à la membrane de vésicules spécialisées dans son transport, dans im modèle insuhno- dépendant^^-^^ (Figure 19). L'étude de TBCld4 restant cependant toujours prometteuse au niveau des cellules dendritiques et de leur trafic vésiculaire, elle est actuellement en cours d'évaluation au laboratoire.

Figure 19 : TBCld4 participe à la régulation du trafic intracellulaire de GLUT4.

En réponse à une élévation de la glycémie, les cellules p des îlots de Langerhans du pancréas sécrètent de l'insuline. Cette hormone entraîne l'absorption des sucres par les tissus adipeux et musculaires, grâce au recrutement de transporteurs de glucose (GLUT) au niveau de la membrane plasmique. La translocation de l'isoforme GLUT4 à la membrane est régulée par des petites GTPases monomériques de la famille des Rab. Ces protéines sont associées à divers processus de trafics vésiculaires. Elles oscillent entre leur forme inactive GDP-liée, contrôlée par des protéines qui stimulent leur activité GTPasique intrinsèque (GAP), et leur forme active GTP-liée qui est contrôlée par les facteurs d'échange nucléotidique (GEF). TBCld4, de par son domaine TEC, a une fonction de Rab-GAP qui maintient la GTPase impliquée dans la redistribution de GLUT4 à la membrane sous sa forme inactive. 11 agit donc comme un régulateur négatif de ce trafic à l'état basal. L'interaction de l'insuline avec son récepteur entraîne une cascade de phosphorylations qui aboutit à l'inhibition de l'activité GAP de TBCld4 et ainsi à l'activation de la protéine Rab et l'exocytose de GLUT4. RI : Récepteur à l'insuline ; 1RS : Insulin Receptor Substat ; PI3K : Phosphatidylinositol 3-Kinase ; PtdIns(4,5)Pi : Phosphatidylinositol 4,5-bisphophate ; PtdIns(3,4,5)P2 : Phosphatidylinositol 3,4,5 trisphophate ; PTEN : Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome ten ; PDKl : Phosphoinositide-Dependent protein Kinase-1 ; Akt : protein kinase B ; IRAP : Insulin-Responsive Amino Peptidase; GDI : GDP Dissociation Inhibitor ; GSP; GLUT4 Storage Vesicle.

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-1.3. Ankrd57

Le gène codant pour Ankrd57 (NCBI GenelD: 268301) est situé sur le chromosome 10 murin et est constitué d'un unique exon. L'ADNc isolé, d'xme longuexrr totale d'environ 4,5 kb, renferme ime ORF de 1538 paires de bases dont la traduction donne ime protéine hypothétique de 512 acides aminés (Annexe H). Cette protéine murine présenterait 69% d'identité de séquence avec la protéine humaine portant le même nom. Les fonctions de ce gène demeurent encore inconnues à ce jour aussi bien chez l'homme que chez la souris. Des analyses bio-informatiques de la séquence protéique indiquent la présence de motifs Ankyrine (domaine en référence duquel elle a été nommée) et d'ime séquence d'instabilité

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