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L'ARN interférence, un outil génétique

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La communauté scientifique a très vite vu en l'ARN interférence un outil potentiel pour l'étude de la fonction de gènes. La technique est aisée à mettre en oeuvre, d'une grande spécificité et les effets peuvent s'observer très rapidement.

Une limitation importante de la technique d'ARN interférence est d'identifier les séquences qui guideront ime diminution significative et spécifique du messager ciblé. La compréhension de plus en plus précise du mécardsme a permis de développer des algorithmes de sélection de siRNA très efficaces'”. Cependant, il est nécessaire de tester plusieurs siRNA choisis afin d'isoler les meilleurs. Ils doivent répondre à deux exigences fondamentales : l'atténuation efficace du messager ciblé et l'absence d'effets non spécifiques - réponse interféron (IFN) et « off-target effect » (OTE).

Hautement conservé, ce mécanisme naturel peut être exploité dans divers modèles animaux

et végétaux. Dans des systèmes non mammaliens comme Caenorhabditis elegans, Drosophila et

Trypanosoma,l'introduction de longs dsRNA (>200 pb) complémentaires du transcrit ciblé est aisée et efficace. Par contre, dans les cellules de mammifères, ü a fallu concevoir une approche différente à cause de l'induction de la réponse antivirale de type IFN. En effet, dans ces cellules, les dsRNA peuvent activer différentes voies de signalisation (PKR, 2-5A synthétase, Mx) qui conduisent à l'arrêt de la sjmthèse protéique et à une dégradation non spécifique des

ARN messagers. Cela a été surmonté par Elbashir et al^°° : contrairement à des dsRNA de 50-

500 pb, des dsRNA de 21 nucléotides, qui miment les produits de digestion de Dicer, ne déclenchent pas cette réponse. Néanmoins, certains rapports attestent que ce ne serait pas toujours le cas^o^ La liaison des siRNA au TLR3^“, au TLR7^®, leur longueur, le type cellulaire^o^ ou les vecteurs d'expression employés^®^ pourraient parfois induire l'expression d'interférons.

L'OTE se définit par la diminution de l'expression de gènes non ciblés. Il apparaîtrait qu'en fait l'hexamère en position 2-7 du brin guide (nommée région « seed ») serait déteiminant dans la spécificité du miRNA^^. L'OTE corrélerait avec l'interaction de la région « seed » avec ime séquence parfaitement complémentaire localisée dans l'UTR 3' de transcrits non ciblés 2®®. Plus la présence de cette région critique est fréquente dans rUTR3', plus l'OTE est augmenté. Et donc, moins elle est fréquente, moins l'effet est étendu^®®. Ainsi, si les siRNA générés comportent un hexamère qui se retrouve fréquemment dans des régions 3' non traduites, des milliers de gènes verraient alors leur expression s'atténuer d'un facteur 2 à 3. Ces effets non spécifiques peuvent être à l'origine de phénotypes qui n'ont aucime relation avec l'étude en cours. Ce paramètre apparaît donc critique et doit être pris en compte dans l'élaboration d'algorithmes afin d'augmenter la spécificité des siRNA sélectionnés.

Les siRNA apportés dans la cellule peuvent être directement utilisés par RISC. Pour

cela, ils sont soit synthétisés in vitro (chimiquement ; transcription de l'ADN d'intérêt,

hybridation puis clivage par vme RNase III), soit exprimés in vivo à partir d'tm plasmide (les

séquences sens et anti-sens du duplexe d'ARN sont situées l'une à la suite de l'autre, chaame sous le contrôle d'im promoteur dépendant d'tme polymérase de type HI). Une première amélioration a porté sur la stabilité de l'ARN interfèrent. Celle-ci a été augmentée grâce au développement de shRNA (short hairpin RNA)^i®^^'® et de miR-shRNA^’^. Dans le cas des shRNA, les séquences sens et anti-sens sont séparées par une boucle et placées sous le contrôle d'un unique promoteur. Une fois transcrites grâce à ime polymérase de type HI, ces petites boucles d'ARN sont clivées par Dicer pour générer des siRNA matures. Dans le cas des rmR-shRNA, les shRNA sont exprimés sous forme de pre-miRNA en incorporant la séquence cible dans la tige d'un précurseur de miRNA endogène. Une étude comparative a révélé que la même séquence interférente exprimée dans im contexte de miRNA était 80% plus efficace

-que lorsqu'elle était amenée sous forme de shRNA^i®. Puis, une nouvelle avancée a eu lieu grâce aux travaux de l'équipe de S.J. EUedge^'®. Elle a observé qu'un miR-shRNA placé dans l'UTR 3' de la séquence codant pour la GFP, elle-même sous le contrôle d'un promoteur dépendant d'ime polymérase de type H, modulait encore plus fortement l'expression de sa cible. Cette construction permet non seulement l'expression simultanée du shRNA et du rapporteur mais surtout, l'utilisation d'une polymérase de type II offre de multiples alternatives avec, à disposition, des promoteurs inductibles/répressibles, ubiquitaires, tissu- spécifiques ou régulés au cours du développement.

Il existe diverses techniques pour délivrer les petits ARN interférents dans la cellule. L'électroporation et l'usage d'agents lipidiques sont des moyens rapides et efficaces. Mais, ces apports sont limités par la nature transitoire de la réponse qu'ils autorisent et la difficulté de transfecter des cellules primaires. Le développement de vecteurs viraux notamment basés sur les lentivirus^*^' a permis d'outrepasser ces limitations. Les lentivirus présentent de nombreux avantages. Ils intègrent leur transgène de façon stable dans le génome, ce qui autorise ime répression durable du gène ciblé. De plus, ces virus ont la capacité de transduire des cellules quiescentes. Enfin, l'enveloppe des lentivirus recombinants est celle du virus de la stomatite vésiculaire qui présente im tropisme très large et offre ime grande stabilité rendant possible l'ultracentrifugation des particules virales. Il existe également des systèmes vectoriels basés sur les adénoviraux^^®' Ils sont capables d'infecter des cellules qui ne se divisent pas, mais, contrairement aux lentivirus. Us ne procurent qu'im effet transitoire car ils n'intègrent pas leur génome dans celui de l'hôte.

L'exploitation du mécanisme d'ARN interférence vise l'étude fondamentale de gènes mais constitue aussi un outil thérapeutique au potentiel énorme, pouvant toucher im large spectre de maladies. Depuis sa découverte, des progrès considérables ont été réalisés dans l'application de la technique dans l'étude et la modulation de gènes impliqués dans diverses maladies^’’^^. Certaines thérapies basées sur l'ARN interférence font aujourd'hui l'objet d'essais cliniques sur l'homme.

Au niveau purement fondamental, l'identification de la fonction de gènes in vivo semble

pouvoir trouver ime alternative rapide, moins laborieuse et prometteuse à l'invalidation par recombinaison homologue. En effet, l'élaboration des vecteurs lentiviraux a permis le développement de souris qui sous-expriment im gène d'intérêt ou souris « knock-down >>225-227

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