Phénotypage des souris transgéniques

Malgré les difficultés abordées au chapitre

n.l,

même révélée efficace. Nous avons en effet réussi à générer des souris « knock-down » et des souris surexprimant fortement Ankrd57.

In vitro, les deux ARN interférents choisis affichaient ime efficacité très légèrement différente ; TARN interfèrent shA57.1 atténuait xm peu moins bien l'expression d'Ankrd57, plus particulièrement au niveau protéique (Figure 25AB). Cette moindre efficacité s'est vue

accentuée in vivo (Figure 25CD) avec des niveaux d'expression de la protéine équivalents à

ceux des souris non transgéniques. Nous n'avons donc pas utilisé les lignées TgshA57.1 pour l'étude fonctionnelle d'Ankrd57. En revanche, l'ARN interfèrent shA57.2 semble bien

diminuer l'expression de la protéine in vivo (Figure 25CD). Cette observation montre la

nécessité de tester plusieurs ARN interférents que ce soit in vitro et in vivo.

A r> in ■g C < E Z < 1. PC-A57 2. pc-A57+shA57.1 3. pc-A57+shA57.2 4. pc-A57+shTBCld4.1 B Ankrd57 Actine

-En ce qui concerne les souris TgA57, elles présentent effectivement une augmentation du niveau d'expression de la protéine en comparaison des souris contrôles (Figure 25CD). Cependant, l'expression du transgène est très variable, fluctuant du niveau endogène à plus de dix fois celui-ci. Le nombre d'animaux utilisables s'avère limité et la sélection des individus surexprimant le transgène se montre donc plus laborieuse que pour des souris transgéniques générées avec d'autres méthodes de transgenèse. Elle exige d'évaluer le niveau de surexpression pour chaque souris lentigéniques.

Ensemble, ces trois lignées devraient nous permettre d'éviter des erreurs d'interprétations dues à des phénotypes insertionnels : les deux lignées qui surexpriment devraient nous donner des informations dans le même sens et celles-ci devraient trouver leur opposé avec les souris « knock-down ». Nonobstant cela, nous sommes bien conscients qu'une simple atténuation du niveau de notre protéine pourrait ne rien révéler si l'expression d'Ankrd57 reste dans des normes physiologiques suffisantes pour que sa fonction soit remplie.

En tout premier Heu, nous avons abordé des tests « classiques », permettant d'évaluer les capacités intrinsèques des ceHules dendritiques à induire une réponse immime : capturer l'antigène, l'apprêter, migrer vers les gangHons lymphatiques et stimuler les lymphocytes T.

Tout d'abord, de manière à confirmer les expériences effectuées auparavant avec les BMDC infectées, nous avons purifié les cellules dendritiques spléniques de souris non transgéniques et de souris TgshA57.2. Nous les avons cultivées soit en présence de lymphocytes TCD4+ allogéniques, soit avec des lymphocytes TCD4+ de souris transgéniques OT-Il afin d'examiner leur capacité à stimuler des lymphocytes T et à présenter un antigène.

La diminution du niveau d'expression d'Ankrd57 n'a occasionné aucrune différence, comme le rapportent la prolifération normale des ceUules T et le dosage équivalent des cytokines sécrétées par les lymphocytes T suite à leur stimulation (Figure 26).

Ensuite, nous avons contrôlé si, in vivo, im environnement appauvri en Ankrd57 pouvait

affecter ces aptitudes. Pour ce faire, nous avons injecté l'antigène KLH mélangé à l'adjuvant complet de Fretmd (CFA, très fortement immimogène) dans les coussinets plantaires de souris non transgérdques et de souris « knock-down ». Cinq jours après l'immunisation, les gangHons lymphatiques drainants les sites d'injection sont récoltés et les ceUules sont mises en culture en présence de doses décroissantes de KLH.

La prolifération des l3Tnphocytes T et les doses de cytokines qu'ils ont sécrétées étaient

semblables entre les deux groupes (Figure 27). Dans ces conditions, les ceUules dendritiques et les lymphocytes T ne semblent pas affectés par ime diminution de la protéine d'intérêt.

Figure 26 : L'atténuation d'AnkrdS? n'occasionne pas de défaut dans les capacités immuno-stimulatrices des cellules dendritiques.

Des cellules dendritiques sont purifiées à partir de la rate de souris contrôles ou de souris sous-exprimant Ankrd57. Elles sont ensuite cultivées avec des lymphocytes TCD4+ allogéniques ou issues de souris transgéniques OT-Il. Pour le test OT-Il, les cellules dendritiques sont soit chargées au préalable avec le peptide OT-Il soit incubées avec la protéine OVA au moment de la culture. La prolifération (A) et la sécrétion d'IFNy (B) sont mesurées après 96H. Ces résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. 2 souris par groupe ont été testées individuellement et les graphiques représentent la moyenne ± la déviation standard.

B

Figure 27 : Réponse normale des cellules dendritiques et des cellules T suite à l'injection de CFA-KLH dans les souris sous-exprimant Ankrd57.

2.5 |ug de KLH émulsiormés dans du CFA sont injectés dans les coussinets plantaires de souris knock-dov/n pour Ankrd57 et de souris non transgéniques. Les ganglions drainants les sites d'injection sont récupérés 5 jours plus tard et les cellules ganglionnaires sont cultivées en présence de doses croissantes de KLH. La prolifération (A) et la production d'IFNy (B) sont mesurées après 96H. Ces résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes. 2 souris par groupe ont été testées individuellement et les graphiques représentent la moyerme ± la déviation standard.

-75-Dans un deuxième temps, nous avons examiné si les populations du système immunitaire étaient normalement représentées dans les souris TgA57. Pour ces expériences, nous avons sélectionné les souris appartenant aux lignées "a", "b" ou "a+b" (cf chapitre II.l) qui exprimaient des taux élevés d'AnkrdS? (entre 4 et 10 fois supérieurs à ceux des souris non transgéniques contrôles). Le phénotypage a été réalisé par cytométrie de flux sur des suspensions cellulaires de moelle osseuse, de thymus et de rate. La technique nous a permis de déterminer le nombre de cellules associé à différents marqueurs caractéristiques des populations et sous-populations cellulaires recherchées. Considérant l'état sanitaire variable et les différences d'âge des souris utilisées, nous avons choisi de comparer chaque souris transgénique à son contrôle pour chaque expérience (Figure 28).

in P-0,0007 P= 0,0024 P= 0,0244 P- 0,0105 O fD_ O (/) V) fD C U) n>

Figure 28 : La siu'expression d'Ankrd57 entraîne une augmentation du nombre de cellules dendritiques, de macrophages et de lymphocytes B spléniques.

Sur ces graphiques, nous visualisons le rapport entre le nombre de cellules de la population indiquée en abscisse dans les souris qui surexpriment Ankrd57 et les souris contrôles. Ces populations cellulaires ont été identifiées par cytométrie de flux dans les organes notés à droite des graphiques. Le rapport du nombre total de cellules dans les organes entre TgA57 et non transgéniques est aussi rapporté. La ligne en pointillés à 1.0 représente la valeur attendue chez les souris contrôles. Nous avons utilisé le test statistique de Wilcoxon pour données pairées.

pDC: CDllc'^CDllb-BllO*, cDC: CDlW‘i*<CDllb\ cDC(A): CDnc*“s*‘CDllb^CD8a\ cDC(B): CD8a et Mcp: CDlld^’CDllb^'*''

Ainsi, dans la moelle osseuse des souris transgéniques, le nombre total de cellules B220+ diminue d'environ 20% en moyenne. Dans le thymus, nous n'observons pas de différence. Par contre, le nombre total de cellules de rate augmente de 25% en moyenne dans les souris transgéniques. Cette augmentation s'explique par un nombre plus élevé de lymphocytes B (+ 20% en moyenne), de macrophages (+ 25% en moyenne) et de cellules dendritiques (+ 30% en moyenne). Au sein des cellules dendritiques, le nombre de cellules de toutes les

sous-R

a

populations examinées - plasmacytoïdes (pDC) et conventionnelles (cDC) - est plus élevé que dans les souris contrôles (Figure 28). Bien que ces augmentations soient faibles, elles sont constantes et statistiquement significatives, suggérant qu'elles pourraient être la conséquence d'une surexpression de la protéine Ankrd57.

Nous avons été étonnés d'observer que la surexpression d'AnkrdSZ pourrait avoir un effet au niveau des lymphocytes B, considérant l'approche de sélection au commencement de ce travail. Le fait que les lymphocytes T ne semblent pas touchés renforce l'idée que le phénotype observé serait bien dû à la surexpression de la protéine Ankrd57. Il est à noter que le taux d'ARNm d'Ankrd57 est 2 à 6 fois plus élevé dans les lymphocytes B que dans les T (Figure 29) et de 10 à 30 fois moins élevé que dans les cellules dendritiques immatures.

Figure 29 : Expression d'AnkrdS7 dans les lymphocytes B et T.

Des lymphocytes B et T sont purifiés à partir de la rate de souris C57BL/6. L'ARN total extrait est rétrotranscrit et la quantité d'ARNm d'Ankrd57 est analysée par PCR quantitative. Les échantillons sont normalisés via l'expression du gène de ménage RPL13 dans les expériences 1 et 2, et RPL32a dans les expériences 3 et 4. Ce graphique reprend les données représentées Figure 11 mais l'échelle est réduite de manière à mieux observer les différences. Pour rappel, le taux d'ARNm est fixé à 100 dans les iDC.

Nous n'avons rétmi que peu d'informations sur cette protéine cytoplasmique qui ne comporte qu'im domaine d'interaction avec d'autres protéines. Les résultats préliminaires nous amènent à formtiler trois hypothèses sur le rôle présumé d'Ankrd57.

La première repose sur l'observation du nombre augmenté de cellules dans la rate des souris TgA57 et sur le fait que les BMDC « knock-down » sont moins nombreuses en fin de culture que les BMDC sauvages (chapitre I.3.). La protéine Ankrd57 pourrait intervenir dans l'hématopoièse : elle pourrait jouer im rôle dans le développement d'un précurseur commrm aux lignées des lymphocytes B, des cellules dendritiques et des macrophages ; ou elle pourrait agir, directement ou indirectement, sur im facteur de transcription commim aux trois types cellulaires touchés. Des arbres représentant les lignées cellulaires et les facteurs de transcription et de croissance impliqués dans leur développement se dessinent peu à peu, mais, beaucoup de variantes existent et les connaissances qui s'y rapportent sont im domaine

en plein essor2^2-26s_ Lgg mêmes facteurs de transcription peuvent agir dans différentes lignées

et à différents moments du développement. Leur quantité peut également affecter la détermination d'ime ügnée^^. Il nous est donc difficile de cibler im facteur commun auquel la fonction d'Ankrd57 serait rattachée. Des études de transfert de moelle osseuse dans des souris

-congéniques létalement irradiées nous indiqueraient déjà si Ankrd57 joue un rôle au niveau hématopoïétique et si l'environnement transgénique a ime influence. Par ailleurs, il faudrait examiner si le nombre de progéniteurs est affecté dans la moelle osseuse des soixris TgA57. Toutefois, dans le cadre de cette hypothèse, nous aurions pu nous attendre à ce que le nombre de cellules CDllb+, CDllc+ et B220+ dans la moelle osseuse des souris TgA57 soit également légèrement augmenté. Or, ce n'est pas le cas. Au contraire, le nombre de cellules B220+ semble diminué.

Une deuxième hypothèse serait alors que la protéine Ankrd57 interviendrait dans la mobilité des lymphocytes B, des cellules dendritiques et des macrophages, se définissant par une mobilisation accrue au niveau de la rate et peut-être au niveau d'autres organes périphériques. Le nombre de cellules B220+ serait diminué dans la moelle osseuse des souris TgA57 car elles seraient retenues en périphérie. Ankrd57 pourrait avoir un rôle dans l'adhésion ou le détachement de ces cellules ou dans la réponse à certains facteurs de recrutement. Il faudrait alors considérer les chimokines et les voies de signalisation impliquées dans ces processus. De plus, son expression est plus forte au cours de la maturation et plus encore lorsque les cellules sont stimulées avec des agents pathogènes (et des cytokines pro-inflammatoires, non montré). Peut-être existerait-il une corrélation entre l'augmentation de l'expression d'Ankrd57 au cours de la maturation et la plus forte mobilisation des cellules. Il serait éventuellement intéressant d'examiner si ce nombre est encore plus grand suite à xm stress ou à l'injection d'un agent inflammatoire. Par ailleurs, nos souris sont élevées dans une animalerie conventionnelle. Il serait appréciable de vérifier si ce phénotype se retrouve dans des souris maintenues en conditions stériles.

Enfin, xme dernière hypothèse pourrait être qu'Ankrd57 joue un rôle dans la survie de ces

types cellulaires. Ceci pourrait être testé in vitro, par exemple en mesurant, à différents temps

de culture, l'incorporation d'iodure de propidium dans des lymphocytes B purifiés à partir de la rate de souris transgéniques et contrôles. Dans ce cas, il serait peut-être informatif d'évaluer l'expression de différents facteurs pro- et anti-apoptotiques dans ces cellules.