utilisation imm´ediate, ou ult´erieure apr`es stockage `a +4◦C pour une p´eriode n’exc´edant pas 5 jours.
2.1 Fluide suspendant
Nous utilisons pour suspendre les globules rouges une solution dite “iso- dense” (Roman et al., 2012 ; Roman et al., 2016) car sa densit´e est de 1.1 quand celle des globules rouges varie entre 1.09 et 1.11. La solution isodense est un m´elange de Glucose Albumin Sodium Phosphate (GASP) et d’Opti- prep (Sigma Aldrich), qui est une solution d’iodixanol, milieu utilis´e pour la s´eparation de cellules par gradients de densit´e.
Plus sp´ecifiquement, le GASP est une solution tampon phosphate salin (phosphate buffered saline, PBS, Sigma Aldrich) qui contient 2.5 mg/ml d’al- bumine s´erique bovine (bovine serum albumin, BSA, Eurobio) et 1 mg/ml de glucose. Au GASP est m´elang´e une solution stock dont 90% du volume est de l’Optiprep et les 10% restant correspondent `a du GASP concentr´e dix fois, pr´epar´e `a partir de PBS concentr´e dix fois (Fischer Bioreagents). 35% du volume de la solution isodense est compos´e par la solution stock, et les 65% restant sont du GASP. L’emploi de cette solution isodense facilite consid´erablement les exp´erimentations, en empˆechant la s´edimentation des globules rouges dans la tubulure d’alimentation.
Outre la correspondance des densit´es, il est important de s’assurer que le pH, la conductivit´e ionique et l’osmolarit´e correspondent `a celle du plasma, cette derni`ere ´etant par ailleurs ´egale `a celle de la solution cytoplasmique du globule rouge. En effet, les globules rouges sont tr`es sensible `a leur environ- nement : une solution hypertonique a pour effet de les rendre echinocytes, c’est-`a-dire avec une forme caract´eristique qui ´evoque celle de l’oursin (du grec echinos, ´epine), alors qu’une solution hypotonique peut conduire `a un gonflement du globule, voire une h´emolyse (d´echirement de la membrane du globule). Nous avons effectu´e une seule mesure de pH, conductivit´e ionique et osmolarit´e. Les valeurs alors mesur´ees de ces trois grandeurs ´etaient res- pectivement 7.5 ± 0.4, 1.5±0.4 S.m−1et 285±15 mOsm.kgH2O−1. Bien que,
par la suite, nous n’ayons pas effectu´e d’autres mesures, avant toute acqui- sition de s´equences d’´ecoulement, grˆace `a une observation sous microscope entre lame et lamelle ou directement dans nos puces microfluidiques, nous nous assurons que la forme biconcave typique du globule rouge au repos est maintenue lorsque celui-ci est suspendu dans notre solution.
2.2 Suspension de globules rouges
Afin de s´eparer les globules rouges des autres constituants du sang, 500 µl de sang total sont suspendus dans un aliquote d’une capacit´e de 2 ml conte- nant 1 ml de PBS, puis centrifug´es `a 1400 rpm pendant 3 min. Les globules rouges ´etant les cellules les plus denses du sang, ils se retrouvent “compac-
50 CHAPITRE 3. MAT ´ERIELS ET M ´ETHODES
t´es” dans le culot de l’aliquote, ce qui permet de pr´elever le surnageant, de le remplacer par du PBS puis d’effectuer un m´elange doux `a l’aide d’une micro-pipette pour resuspendre les globules rouges. Cette op´eration est r´e- p´et´ee encore deux fois. A chaque ´etape, la couleur du surnageant ´evolue du jaune au translucide, indiquant que l’aliquote ne contient plus de plasma. La derni`ere ´etape consiste donc `a pr´elever le volume souhait´e de globules rouges dans le culot et de le suspendre dans la solution isodense contenue dans un tube Falcon de 15 ml, afin d’obtenir la suspension de globules rouges `
a concentration souhait´ee. Nous prenons en compte le fait que la concentra- tion en globules rouges dans le culot n’est pas de 100%, du fait du pi´egeage d’un faible volume de fluide. Ceci est connu sous le nom de plasma trap- ping. Il a ´et´e montr´e que celui-ci n’exc`ede g´en´eralement pas 3% (Chaplin et Mollison, 1952). La concentration de la suspension ainsi obtenue est appel´ee h´ematocrite de r´eservoir.
2.3 Mise en ´ecoulement
Avant toute mise en ´ecoulement de la suspension dans une puce micro- fluidique, nous laissons s’y ´ecouler du GASP pendant 12 `a 24 heures, afin d’effectuer un d´epˆot de BSA par adsorption de la mol´ecule sur le PDMS et surtout le verre. Les globules rouges r´eagissent mal au contact avec ce dernier et prennent une forme echinocyte. Le d´epˆot de BSA a pour but de limiter voire empˆecher une telle modification des globules.
Le tube Falcon de 15 ml qui contient la suspension `a h´ematocrite de r´eser- voir est reli´e `a un contrˆoleur de pression disposant de huit voies (MFCS-8C, Fluigent) et `a la puce microfluidique, grˆace au trou pr´evu pour l’injection. Le ou les tubes de silicone (Tygon Silicone Tubing, diam`etre interne 1/32”) qui recueillent les effluents sont reli´es `a la puce et au contrˆoleur de pression. Le contrˆoleur est con¸cu de telle sorte qu’il est possible d’imposer ind´epen- damment la pression d’entr´ee et la ou les pressions de sortie. Pour nos exp´e- riences, nous avons utilis´e des pressions impos´ees par le contrˆoleur variant entre 10 et 250 mbar, ind´ependamment en entr´ee et pour chaque sortie.
2.4 Acquisition des s´equences d’´ecoulements
Selon les g´eom´etries et les r´egimes ´etudi´es, le temps caract´eristique convectif mis par chaque globule pour traverser le champ de vue du microscope est compris entre la milliseconde et la seconde. C’est pourquoi l’acquisition de s´equences `a tr`es haute cadence est n´ecessaire pour l’extrac- tion d’informations concernant le profil de vitesse des globules rouges par dual-slit (Roman et al., 2012). La cam´era pco.dimax S que nous utilisons r´epond `a ce crit`ere, du fait de sa tr`es haute fr´equence d’acquisition qui peut varier entre 1279 Hz en pleine r´esolution (2016 pixels × 2016 pixels) et 152 811 Hz, pour une r´esolution de 240 pixels × 16 pixels. La cam´era est
2.. SUSPENSIONS DE GLOBULES ROUGES ET ´ECOULEMENT 51
mont´ee sur un microscope (DMRXA2, Leica), disposant d’objectifs ×2.5, ×5, ×10, ×20, ×50. Nous pr´esentons sur la Figure 3.3 une image extraite d’une s´equence d’´ecoulement dans un canal droit, dans une bifurcation et dans un r´eseau. La taille de chaque g´eom´etrie contraint la r´esolution des images, ce dernier crit`ere allant de pair avec une fr´equence d’acquisition maximale. Ainsi, il est n´ecessaire de trouver un compromis entre la taille de la zone que nous souhaitons imager, le choix de l’objectif et la fr´equence d’acquisition.
Figure 3.3 – Images typiques d’´ecoulements obtenues dans les g´eom´etries consid´e- r´ees dans cette ´etude : canal droit simple (R = 0.5, W = 20 µm) pour lequel l’h´e- matocrite de tube vaut environ 0.18, bifurcation 10 − 10 − 10 − 90 pour laquelle l’h´ematocrite d’entr´ee vaut environ 0.15, et r´eseau mod`ele 2D (R = 2 W = 5 µm) avec un h´ematocrite d’entr´ee valant environ 0.20. Dans les trois cas, la barre jaune repr´esente 20 µm.
Dans la suite, les m´ethodes utilis´ees au cours de cette th`ese pour la me- sure des profils de vitesse des globules rouges et d’h´ematocrite sont d´etaill´ees. Les informations extraites de ces profils permettent le calcul des d´ebits de sang et de globules rouges. Dans un premier temps, nous nous int´eressons `a la mesure du profil de vitesse de globules rouges.
52 CHAPITRE 3. MAT ´ERIELS ET M ´ETHODES
3.
Mesure du profil de vitesse des globules rouges
Nous avons soulign´e dans le chapitre pr´ec´edent (voir Section 3.1.2) le principe de la dual-slit, adapt´e `a nos conditions exp´erimentales. Celui-ci repose sur la mesure du temps mis par les globules `a parcourir la distance LSqui s´epare les slits (qui sont des r´egions d’int´erˆet de largeur w choisies sur
l’image), directement `a partir d’une s´equence d’´ecoulement. La mesure de cette dur´ee est donn´ee par le calcul du maximum de corr´elation temporelle entre les profils de niveaux de gris induits dans la largeur du canal par la pr´esence des globules rouges qui “partent” de la premi`ere slit et “arrivent” `a la deuxi`eme.
En pratique, le calcul du maximum est r´ealis´e dans la largeur du canal sur des groupes de trois pixels.
La fr´equence d’acquisition, F, doit ˆetre suffisamment ´elev´ee pour que le d´eplacement Dim des globules rouges entre deux images cons´ecutives, soit
inf´erieur `a 0.6 pixels (Roman et al., 2012).
De mˆeme, un nombre minimal d’images, M, qui est fonction de la vitesse maximale des globules rouges, de la fr´equence d’acquisition et de Ls, est
requis pour permettre la convergence de l’algorithme de corr´elation. Fina- lement l’optimisation de la technique de dual-slit repose sur un choix judi- cieux de la distance inter-slit. En effet, dans certains r´egimes de confinement (R 6 0.5) un gradient significatif de vitesse des globules rouges apparaˆıt dans les directions Ox et Oy. L’id´ee derri`ere cette optimisation est de ti- rer partie de ces gradients de vitesse en choisissant la distance inter-slits de mani`ere `a ce que l’information r´esultante de la corr´elation des profils de ni- veaux de gris soit principalement celle issue des globules les plus rapides, en limitant la contribution des globules les plus lents. Cette technique permet donc l’extraction du profil de vitesse maximale des globules rouges VGRmax(x). Les grandeurs pertinentes et les relations qui les lient, n´ecessaires pour une impl´ementation optimale de la dual-slit sont r´esum´ees dans la Table 1 ci-dessous. Pour nos travaux impliquant l’usage de la dual-slit, nous avons nous aussi utilis´e ces relations.
F (images par seconde) M (images) w (pixels) LS(pixels)
Dim = Vmaxδ/F Dacq = MDim > 9000 w = 1 5 `a 10 DGR
Tableau 3.1 – Param`etres optimaux pour l’impl´ementation de la dual-slit, d’apr`es Roman et al. (2012). Vmaxest la vitesse maximale des globules rouges. δ, exprim´e en px/µm repr´esente le facteur de proportionnalit´e entre une distance mesur´ee en pixel sur l’image et sa correspondance en µm. w est la largeur des slits. DGR est le diam`etre d’un globule rouge.