qRT-PCR

Les échantillons d’ADNc obtenus par RT-PCR sont dilués au 1/8^ième dans de l’H2O DEPC Treated water Pyrogen-Free (Invitrogen). 2 µl des échantillons sont ensuite déposés sur plaque 384 puits et 3 µl du mix d’amorces sont ajoutés (mix d’amorces : 2,5 µl LightCycler® 480 SYBER Green I Master Mix ; 0,25 µl amorce sens du gène à tester diluée au 1 :20 ; 0,25 µl amorce antisens de ce même gène à tester diluée au 1 :20). Les échantillons ont été analysés avec l’algorithme ΔΔCT avec des normalisations de l’efficacité de la PCR de chaque amplicon. La quantification est relative aux niveaux d’ARNm du gène de référence GAPDH au sein des cellules. Les résultats de la quantification en temps réel sont analysés avec le LightCycler 480 thermo cycler (Roche Applied Science, Myelan, France).

Les amorces pour les DHHCs (Annexe 4) ont été choisies grâce au logiciel Primer-Blast (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Après avoir rentré l’identifiant genebank du gène d’intérêt, en plus des critères par défaut de primer-blast, les critères suivants sont ajoutés: la taille maximum de l’amplicon (200 pb), l’absence d’amplification non spécifique d’autres gènes, la concentration en sels divalents (3 mM) et sels monovalents (20 mM), la concentration en dNTPs (1,2 mM) ainsi que la concentration

| Partie 5 Matériels et méthodes 155 des primers (500 nM). Les concentrations sélectionnées sont celles utilisées lors du mix PCR. Les primers sont validés par PCR afin de s’assurer : d’une efficacité de PCR proche de 2, de la robusteste des primers (fait que les primers ne forment pas de manière précoce des dimères), de l’obtention de l’amplicon attendu.

XXIII. Biacore

Le Biacore® est un système de biocapteur basé sur le principe physique de la résonance plasmonique de surface (SPR). Cette technique permet de mesurer en temps réel et sans marquage spécifique, les caractéristiques d’interaction entre deux molécules localisées sur une surface bio-spécifique (Rich and Myszka, 2003; Wu et al., 2005). Pour cela, une des molécules partenaires de l’interaction (le ligand) est immobilisée sur la surface d’une puce de détection (dîte ‘sensor chip’), ou biocapteur, de manière covalente ou non covalente. L’autre partenaire de l’interaction (analyte) est injecté en solution tamponnée sur cette surface à flux constant et continu via un système de canal qui se forme entre la cartouche micro-fluidique et le biocapteur. Il est possible de travailler sur quatre canaux simultanément ou séparement (Biacore 3000).

Figure 56. Diagramme schématique illustrant le principe du SPR.

Le principe de détection par SPR consite à quantifier les changements de l’indice de réfraction près de la surface, reliés à la variation de masse sur la surface du biocapteur, due à la formation ou à la dissociation des complexes moléculaires (Fagerstam et al., 1992). En effet, lorsqu’une lumière monochromatique et polarisée arrive à l’interface entre deux milieux d’indice de réfraction différents et que cette interface est recouverte d’une fine couche métallique, l’intensité de la lumière réfléchie est nettement réduite pour un angle d’incidence particulier (Figure 56). Ceci provient du fait qu’une composante électromagnétique de la lumière, l’onde evanescente, se propage perpendiculairement à l’interface, jusqu’à 1 µm. Les photons de l’onde evanescente entrent en résonance avec les nuages électroniques du métal

156 Partie 5 Matériels et méthodes |

(plasmon). Le faisceau réfléchi va présenter une chute d’intensité à un angle défini appelé « l’angle de résonance ». Cet angle varie notamment en fonction de l’indice de réfraction, lui-même modifié par des changements de masse à la surface de la couche de métal.

Une liaison analyte-ligand entraîne l’augmentation de la concentration de masse sur la surface de la puce, ce qui provoque un changement de l’indice de réfraction qui conduit à un changement au niveau de l’angle de résonance. La variation du signal est suivie en temps réel sous forme d’un sensorgramme. Une variation de 1 000 RU correspond à un déplacement de l’angle de 0.1° et équivaut à une fixation de 1 ng de protéine par mm².

Un cycle d’analyse se déroule de la façon suivante: un ligand est immobilisé au biocapteur, généralement de façon covalente. Le signal SPR obtenu traduit la quantité immobilisée. L’autre partenaire de l’interaction appelé analyte est injecté dans le flux dans un tampon qui passe en continu sur le biocapteur. Si l’analyte se lie au ligand, sa liaison va entraîner un signal SPR. L’augmentation du signal traduit la formation du complexe entre l’analyte et le ligand, c’est la phase d’association qui se mesure en fonction du temps. Comme la liaison est reversible, on atteint un équilibre. Le signal SPR atteint alors un plateau. L’addition d’analyte est arrêtée alors que le flux de tampon continue à circuler sur le biocapteur. Le passage du tampon provoque la dissociation du complexe en déplaçant l’équilibre, c’est la phase de dissociation. On observe alors une diminution du signal SPR en fonction du temps. A la fin de la dissociation, un traitement, le plus souvent acide ou basique permet de régénérer le biocapteur c’est-à-dire d’éliminer toutes les liaisons non covalentes pour revenir au niveau du ligand qui pourra être utilisé à nouveau, c’est la phase de régénération (Figure 57).

| Partie 5 Matériels et méthodes 157 Par conséquent, un suivi de l’angle SPR en fonction du temps permet de suivre en temps réel l’association et la dissociation ligand-analyte. Le Biacore est une technique qui permet de suivre la cinétique en temps réel des interactions des protéines (ou autres types de molécules) avec un ligand. Elle permet une quantification de l’affinité (K_D, K_A) mais surtout des données cinétiques. Cette technique est particulièrement adaptée à la détermination des vitesses d’association (k_on) et de dissociation (k_off) entre macromolécules biologiques.

Les études ont été réalisées sur un appareil Biacore 3000 (GE Healthcare), à 25°C. La CypA-GSTou son mutant ont été immobilisées de manière covalente sur une puce CM4 (GE Healthcare, BiaCore AB) par le protocole standard de couplage à un groupement amine. Un niveau d’immobilisation de 6 000 - 7 000 RU a été obtenu. Les groupements carboxyles encore actifs de la surface sont désactivés avec de l’éthanolamine 1 M pH 8,5. Comme témoin négatif, une autre piste est simplement activée puis désactivée dans les mêmes conditions. Les essais d’interaction sont ensuite effectués à un débit de 20 µl/min en tampon de course HBS-P (10 mM HEPES, 600 mM NaCl, 30 mM citrate, 20 mM NaH₂PO_, 0,5% Dextran, 0,005% surfactant P20, pH 7,4). Pour l’analyse cinétique, la Tat-GST est injectée sur les protéines immobilisées à concentrations croissantes (9,4 ; 18,7 ; 37,5 ; 75 ; 150 ; 300 nM) ou à concentration fixe (150 nM) dans ce tampon. La fixation de la protéine injectée sur la piste contrôle constitue le contrôle négatif d’interactions non spécifiques. Elle est automatiquement déduite de la courbe de fixation sur la CypA immobilisée. Entre chaque essai, la puce est régénérée avec du NaCl 1 M. Les courbes sont analysées à l’aide du logiciel BiaEvaluation 4.1 (BiaCore).