Gag inhibe la palmitoylation de Tat en exportant la Cyclophiline A

Il est intéressant de noter que Cyclophiline A et FKBP12 sont encapsidées par le VIH-1. En effet, chaque virion emporte avec lui environ 250 copies de Cyclophiline A (Gatanaga et al., 2006) et environ 25 copies de FKBP12 (Briggs et al., 1999). Les lymphocytes T peuvent vivre sans CypA (Braaten and Luban, 2001) et son taux n’est donc vraisemblablement pas régulé. Lorsque les cellules PC12 sont co-transfectées avec Tat-FLAG et Gag, la palmitoylation de Tat n’est plus observée (Figure 50). Nous avons pensé que le bourgeonnement viral entraîne une déplétion intracellulaire de CypA et FKBP12 et que cela pourrait être le moyen pour le virus d’arrêter la palmitoylation de Tat dans les cellules productrices de manière à ce qu’elles puissent exporter un maximum de Tat.

Figure 50. Inhibition de la palmitoylation de Tat par Gag.

Les cellules PC12 ont été co-transfectées avec Tat-FLAG et un vecteur vide ou un vecteur Gag (rapport 1 /1) ou un vecteur vide comme indiqué. La palmitoylation a été révélée en utilisant la Click chemistry. Le blot a tout d’abord été incubé avec l’avidine-peroxidase afin de détecter la biotine puis avec des anticorps anti-Tat.

L’interprétation de ces résultats n’est cependant pas simple puisque Gag ne lie pas seulement la CypA (Gamble et al., 1996) mais aussi le PI(4,5)P2 (Ono et al., 2004). L’inhibition de la palmitoylation de Tat par Gag pourrait être due au déplacement de Tat de la membrane plasmique. Cette possibilité est peu probable du fait que Tat et Gag peuvent être observées à la membrane plasmique des lymphocytes T infectés (Rayne et al., 2010b). C'est aussi le cas pour des cellules transfectées (résultats non montrés), et Gag ne déplace donc pas Tat de la membrane. Afin de savoir si l’effet de Gag est dû à sa liaison avec la CypA, nous avons préparé des mutants de Gag avec la mutation G89V dans CA pour inhiber la liaison avec CypA (Towers et al., 2003) ou les mutations K22A et R27A dans MA pour empêcher la liaison au PI(4,5)P₂ (Saad et al., 2006).

Biotine Tat

Mock + Gag seule

Tat

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Nous avons tout d’abord vérifié que ces mutations produisaient effectivement l'effet escompté. Pour cela, nous avons d'abord examiné la distribution cellulaire des mutants de Gag (Figure 52). Après transfection dans des Jurkats, la présence de Gag est révélée par l’immunofluorescence anti-Gag. Comme attendu, tout comme la GagWT, CA^Gag-G89V est localisé à la membrane plasmique (révélée par de la WGA), alors que le mutant MA^Gag -22/27A (ne fixant pas le PI(4,5)P₂) est cytosolique.

Figure 51. Localisation des mutants de Gag dans les Jurkat.

Les cellules Jurkat ont été transfectées avec GagWT ou le mutant de Gag indiqué avant de réaliser une immunofluorescence anti-Gag et un marquage de la membrane en utilisant de la WGA fluorescente. Les sections optiques médianes sont montrées. Barre d’échelle, 10µm.

Nous avons ensuite examiné l'effet de ces mutants sur la palmitoylation de Tat. Les cellules PC12 ont été co-transfectées avec Tat-FLAG et le mutant de Gag. Après immunoprécipitation de Tat-FLAG, nous avons utilisé la technique de Click chemistry afin d’observer la palmitoylation. On s’aperçoit que Tat est palmitoylée en présence des mutants de Gag (Figure 51). Pour que Gag inhibe la palmitoylation de Tat il faut donc que Gag soit à la membrane (cf effet du mutant MA^Gag-22/27A) et que Gag interagisse avec la CypA (cf effet de CA^Gag-G89V).

130 Partie 3 Résultats |

Figure 52. Inhibition de la palmitoylation par l’interaction Gag-CypA.

Les cellules PC12 ont été co-transfectées avec Tat-FLAG et GagWT, MA^Gag22/27A, CA^Gag-G89V ou un vecteur vide comme indiqué. Les mutants MA^Gag22/27A et CA^Gag-G89V sont mutés dans leur site de liaison au PI(4,5)P2

et à la CypA, respectivement. La palmitoylation a été révélée en utilisant la Click chemistry. Le blot a tout d’abord été incubé avec l’avidine-peroxidase afin de détecter la biotine puis avec des anticorps anti-Tat.

Sachant d'autre part que Tat et Gag interagissent sur des sites différents de la CypA (cf résultats de CypA-H126Q), il semble probable que Gag inhibe la palmitoylation de Tat en exportant la CypA par l’encapsidation dans les pseudo-particules virales (VLPs), résultant en une déplétion intracellulaire de CypA. Ce n'est pas un effet de titration car sinon MA^Gag -22/27A n'aurait pas d'effet.

Nous avons ensuite examiné l'effet de ces mutations sur la production des pseudo-particules virales (VLPs) par des cellules Jurkat (Figure 53). Les Jurkats ont donc été transfectées avec les différents mutants de Gag et 36 h après transfection, les surnageants ont été récupérés. Après ultracentrifugation et filtration de ces surnageants, nous avons évalué la teneur en Gag et en CypA de ces VLPs. On observe pour le mutant qui ne se fixe pas au PI(4,5)P₂, MA^Gag-22/27A, une plus faible production de VLPs avec des bandes de p24 et de CypA plus faibles que pour le WT ou les deux autres mutants. Quand au mutant CA^Gag-G89V, celui qui ne fixe pas la CypA, on observe effectivement une disparition totale de la CypA dans les VLPs. Comme attendu, CA^Gag-G89V, contrairement au WT ou MA^Gag-22/27A, n’est pas capable d’encapsider la CypA. Collectivement, ces données indiquent que la liaison de Gag à la CypA et l’encapsidation sont requises pour que Gag puisse empêcher la palmitoylation de Tat.

| Partie 3 Résultats 131

Figure 53. Analyse des VLPs formées par les mutants de Gag.

Les cellules Jurkats ont été transfectées avec un vecteur vide, GagWT ou un de ses mutants, comme indiqué. Après 36 h de transfection, les VLPs sont purifiées à partir des surnageants filtrés puis ultracentrifugés (30 000 g) sur coussin de sucrose 25%, 2 h à 4°C. Des Western blots anti-CypA puis anti-p24 (pour révéler Gag) ont été réalisés.