CypA et FKBP12 interagissent avec Tat

Figure 46. Cyclophiline A et FKBP12 interagissent avec Tat.

(A) Les PC12 ont été transfectées par FLAG (WT, C31S ou W11Y) avant immunoprécipitation de FLAG suivie d’un Western blot anti-Cyclophiline A et anti-FKBP12. (B) Les PC12 ont été transfectées par Tat-FLAG WT et lysées avant ajout de GST-CypA, incubation à 4°C sur la nuit, GST pull-down et Western blot révélé avec des anticorps anti-Tat. (C) Les cellules PC12 ont été transfectées avec Tat-FLAG puis lysées avant d’ajouter la GST-CypA, la GST-CypA-H126Q (notée CypA*) ou GST-FKBP12, incubation à 4°C sur la nuit, GST pull-down et Western blot révélé avec des anticorps anti-Tat.

Nous avons ensuite voulu savoir si Tat pouvait interagir avec ces prolylisomérases. Après transfection des cellules avec la Tat-FLAG, nous avons montré par immunoprécipitation (anti-FLAG) suivie de Western blots, que FKBP12 et la CypA interagissent avec TatWT ou Tat-C31S mais pas avec Tat-W11Y (Figure 46A). Par conséquent, cette interaction a lieu à la membrane plasmique (car Tat-W11Y n'interagit pas) et avant la palmitoylation (car Tat-C31S n'interagit pas). Nous avons également observé cette interaction Tat-Cyclophiline A par GST pull-down (Figure 46B) et analyse protéomique de Tat immunoprécipitée à partir de PC12 transfectées (expériences de P. Tryoen-Toth et JM. Straub). Deux peptides ont été détectés, ils couvrent >25% de la séquence. FKBP12 n’a pas été détectée mais la Cyclophiline B a été mise en évidence (4 peptides, qui couvrent >18% de la séquence). Cette dernière est résidente du réticulum endoplasmique et du noyau (Le Hir et

A - B - C - Mock Tat-FLAG

Tat

Mock TatWT TatC31S TatW11Y

CypA CypA* CypB Tat

| Partie 3 Résultats 125

al., 1995; Rycyzyn and Clevenger, 2002) et l’interaction Tat-Cyclophiline B détectée pourrait être un artefact du à la lyse des cellules avant l'immunoprécipitation. Globalement ces résultats indiquent que, en accord avec sa richesse en prolines, Tat interagit avec plusieurs immunophilines, certaines l’aidant pour être palmitoylée (CypA et FKBP12).

L’interaction d’une protéine avec la CypA implique généralement le site actif de l’immunophiline et donc un nombre limité d’interactions. Les affinités résultant des complexes CypA-Substrat sont par conséquent faibles. Par exemple, l’affinité de Gag du VIH-1 pour la CypA possède un Kd d’environ 17 µM (Gamble et al., 1996; Yoo et al., 1997), et cette interaction est inhibée par la mutation H126Q dans le site actif de CypA (Braaten et al., 1997). Nous avons mesuré l’affinité de liaison de Tat aux différentes CypA purifiées, la WT et le mutant H126Q, par l’étude de la cinétique d’interaction en temps réel avec la technique du Biacore. Pour ce faire, nous avons immobilisé de manière covalente les deux versions de CypA sur des puces de type CM4 (Biacore). Après injection de Tat-GST purifiée, on observe une forte fixation de Tat sur la puce (Figure 47) que ce soit avec la CypA immobilisée (courbe bleue) ou la CypA-H126Q immobilisée (courbe rouge). Ces expériences montrent que Tat interagit directement avec CypA ou CypA-H126Q. Tat interagit donc avec le CypA-H126Q (Figure 46, GST pull-down et Figure 47, Biacore).

Figure 47. Sensorgramme de l’interaction de Tat avec CypA et CypA-H126Q en utilisant la technologie du Biacore.

GST-CypA et GST-CypA-H126Q ont été immobilisées de manière covalente à une puce CM4. La Tat-GST a été injectée (150 nM) sur la CypA (courbe bleue) ou la CypA-H126Q (courbe rouge) immobilisées et les sensorgrammes correspondants au temps d’association (180 s) et le temps de dissociation (1 000 s) ont été évalués. Les résultats sont exprimés en unité de résonance (RU pour resonance units).

126 Partie 3 Résultats |

Dans un deuxième temps nous avons voulu déterminer la force de l’interaction de Tat avec la CypA (Figure 48). Pour se faire nous avons réalisé une cinétique en utilisant différentes concentrations de Tat. La CypA a été immobilisée de manière covalente sur une puce CM4 puis Tat-GST purifiée a été injectée sur la CypA immobilisée à concentration croissante (9,4 ; 18,7 ; 37,5 ; 150 et 300 nM). Les constantes cinétiques de l’interaction Tat-CypA montre une grande affinité, caractérisée par une très faible constante de dissociation, Kd = 5,2 nM (Tableau 4).

Figure 48. Sensorgramme de liaison de Tat-GST avec CypA en utilisant la technique de Biacore.

Cinétique de Tat-GST se liant à la CypA immobilisée (6 148 RU) est montrée. Des concentrations croissantes de Tat-GST ont été injectées (9,4 ; 18,7 ; 37,5 ; 150 et 300 nM, de bas en haut). Les courbes expérimentales sont superposées avec les courbes ajustées. RU : resonance units.

ka₁ (1/M^.s) kd₁ (1/s) ka₂ (1/M^.s) kd₂ (1/s) Rmax (RU) Concentration (nM) K app (1/M) χ² 4,4×10⁴ 5,94×10^-3 9,99×10^-3 4,01×10^-4 1,92×10⁸ 0,811 75,8 9,4 51,1 18,7 61,1 37,5 64,4 75 73,6 150 92,9 300 40,3 9,4

Tableau 4. Constantes cinétiques de Tat-GST se liant à la CypA immobilisée (4 400 RU), dérivées des données montrées dans la Figure 48.

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La même expérience a été réalisée avec la CypA-H126Q immobilisée (Figure 49). Des profils similaires d’association/dissociation ont été obtenus avec un Kd de 9 nM (Tableau 5). Les paramètres cinétiques des interactions entre Tat et la CypAWT ou la CypA-H126Q sont équivalents, ce qui indique que la mutation de CypA n’a pas d'effet significatif sur l’association avec Tat.

Figure 49. Sensorgramme de liaison de Tat-GST avec CypA-H126Q en utilisant la technique de Biacore.

Cinétique de Tat-GST se liant à la CypA-H126Q immobilisée (6 148 RU) est montrée. Des concentrations croissantes de Tat-GST ont été injectées (9,4 ; 18,7 ; 37,5 ; 150 et 300 nM, de bas en haut). Les courbes expérimentales sont superposées avec les courbes ajustées. RU : resonance units.

ka₁ (1/M^.s) kd₁ (1/s) ka₂ (1/M^.s) kd₂ (1/s) Rmax (RU) Concentration (nM) K app (1/M) χ² 3,81×10⁴ 0,0139 0,0106 2,36×10^-4 1,25×10⁸ 1,88 101 9,4 100 18,7 110 37,5 118 75 126 150 145 300

Tableau 5. Constantes cinétiques de Tat-GST se liant à la CypA immobilisée (7 624 RU), dérivées des données montrées dans la Figure 49.

RU : resonance units.

Les modèles mathématiques appliqués aux cinétiques observées (Figure 48 et 49), que ce soit pour l’interaction de Tat avec la CypA ou la CypA-H126Q, indiquent un changement

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de conformation de Tat une fois fixée à la CypA ou son mutant. Pris ensembles, ces résultats indiquent que Tat est un ligand non conventionnel de la Cyclophiline A.