La palmitoylation de Tat est réalisée par la DHHC20

Comme nous l’avons vu en introduction, l’acylation des protéines est réalisée par une famille de protéines appelées les DHHCs dû à la présence d’un motif Asp-His-His-Cys conservé au niveau de leur site catalytique. Nous avons donc voulu savoir la ou lesquelles de ces enzymes pouvai(en)t être responsable(s) de la palmitoylation de Tat. Dans un premier temps nous nous sommes intéressés à la localisation intracellulaire de chacune des enzymes permettant la palmitoylation en les surexprimant dans les cellules PC12. Afin d’identifier la distribution subcellulaire des 23 enzymes, chacune des DHHCs étiquetées avec une étiquette EGFP a été transfectée dans les PC12. Ces constructions réalisées dans le laboratoire de Masaki Fukata nous ont été fournies par Christophe Lamaze. Après transfection, la présence des différentes enzymes est identifiée à l’aide du signal EGFP. Seules les DHHC5 et 20 sont localisées à la membrane cellulaire dans les PC12 (Figure 37). Les autres DHHCs sont au Golgi (exemple ici avec la DHHC21) ou au RE. La superposition de la fluorescence GFP avec le marquage de la membrane, révélée par de la WGA-Cy5 confirme que ces deux enzymes se trouvent à la membrane plasmique.

0 10 20 30 40 50 Membrane Cytosol Mb+Cyto Noyau % L o cal isat io n in tr a cel lu la ir e

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Figure 37. Localisation des enzymes DHHCs dans les cellules PC12.

Les cellules ont été transfectées avec une version murine des enzymes taggées avec la GFP. 24 h après transfection, la GM130 a été révélée par immunofluorescence et les noyaux marqués avec le DAPI. Dans le cas des DHHC5 et 20 la membrane a été marquée par la WGA. Les sections optiques médianes sont montrées. Barre d’échelle, 10 µm.

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Nous avons également voulu savoir si les enzymes présentes à la membrane plasmique dans les PC12 l’étaient également dans les lymphocytes T CD4+ primaires. En effet, les DHHCs ont une distribution tissu-spécifique (Ohno et al., 2006), il se peut donc que la localisation des DHHCs observée dans les lymphocytes T primaires soit différente de celle observée dans les cellules PC12. Après transfection, la présence des différentes enzymes est identifiée à l’aide du signal EGFP. Seule la DHHC20 est localisée en périphérie cellulaire (Figure 38). En effet, tout comme la DHHC21 (utilisée comme contrôle), la DHHC5 est localisée au Golgi dans les lymphocytes T CD4+ primaires. On retrouve aussi un peu de DHHC20 au niveau du Golgi dans ces cellules mais la grande majorité est à la membrane.

Figure 38. Localisation des enzymes DHHCs dans les lymphocytes T CD4+ humains primaires.

Les cellules ont été transfectées avec une version murine des enzymes taggées avec la GFP. 24 h après transfection, la GM130 a été révélée par immunofluorescence et la membrane marquée par la WGA. Les sections optiques médianes sont montrées. Barre d’échelle, 10 µm.

Nous avons ensuite voulu savoir quelle était la DHHC responsable de la palmitoylation de Tat dans des cellules cibles, les PC12. Etant donné que la palmitoylation de Tat a lieu à la membrane plasmique, chaque DHHC présente à la membrane plasmique (DHHC5 et la DHHC20) a été co-transfectée avec la Tat-FLAG dans les PC12 (Figure 39A). La DHHC21 présente au Golgi a été utilisée comme contrôle. Pour révéler la palmitoylation, j’ai utilisé la Click chemistry. C’est uniquement lorsque Tat-FLAG est co-transfectée avec la DHHC20 qu’une bande est observable pour Tat-FLAG lors de la révélation biotine. Cela

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suggère que Tat serait palmitoylée par la DHHC20 dans les PC12. Dans les cas des DHHC5 et 21, où aucune bande n’est visible, nous avons contrôlé que Tat était bien immunoprécipitée, sa présence étant détectée par un anticorps anti-Tat. Ces résultats ont été confirmés en utilisant un siARN dirigé contre la DHHC20. Trois siRNA dirigés contre la DHHC20 ont été testés (siRNA#1 à #3) (Figure 39C). Le plus efficace, d’après les quantifications par qRT-PCR, est le siRNA DHHC20#3 qui éteint l’expression de la DHHC20 de 80% (Figure 39C). C’est ce siRNA qui a été utilisé par la suite. L’extinction d’expression de la DHHC20 mène à une inhibition complète de la palmitoylation de Tat alors que le siRNA contrôle n’a aucun effet (Figure 39B).

Figure 39. La palmitoylation de Tat est réalisée par la DHHC20.

Les cellules PC12 ont été co-transfectées (ratio 1/1) avec la Tat-FLAG et (A) les DHHC5, DHHC20 ou DHHC21 étiquetées GFP ou (B) avec le siRNA contre la DHHC20 ou le siRNA contrôle, avant l’étiquetage métabolique sur la nuit avec le 17-ODYA, l’immunoprécipitation anti-FLAG et la Click chemistry afin de révéler la Tat palmitoylée avec la biotine. (C) Effet de différents siRNA contre la DHHC20 sur son niveau d’expression. Les PC12 ont été transfectées avec le siRNA indiqué contre la DHHC20 ou le siRNA contrôle avant l’extraction ARN et la qRT-PCR. Les résultats sont exprimés en utilisant l’expression de la GAPDH pour normaliser les résultats.

B - A - C - 5 20 Biotine Tat 21 Biotine Tat Tat + siRNA Ctrl HA

^- +

- ₊

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Enfin, nous nous sommes intéressés au niveau d’expression des DHHCs dans les cellules productrices de Tat, les lymphocytes T primaires ou Jurkat, et des cellules cibles, macrophages primaires et PC12. Pour cela, nous avons réalisé des qRT-PCR dans ces différents types cellulaires (Figure 40A). On s’aperçoit que certaines enzymes sont très peu (par exemple les DHHC9 et 23) voire pas du tout exprimées (par exemple la DHHC19) et cela quel que soit le type cellulaire. Certaines DHHCs sont exprimées dans tous les types cellulaires mais beaucoup plus fortement dans l’un d’entre eux (par exemple la DHHC7). Si l’on regarde de plus près la DHHC20 (Figure 40B), nous pouvons voir que la DHHC20 est bien exprimée dans les cellules PC12 et que son expression est plus importante dans les cellules T et les macrophages que les cellules PC12.

Nous avions effectué ces expériences car nous pensions au départ que Tat était bien sécrétée par les lymphocytes infectés (Rayne et al., 2010b) car l’enzyme palmitoylant Tat était moins exprimé dans les cellules-T comparé aux cellules cibles. Il nous a donc fallu changer rapidement d’hypothèse de travail.

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Figure 40. Expression des DHHCs dans les différents types cellulaires.

(A) Expression des différentes DHHCs dans les lymphocytes T humains (primaires et Jurkat), les macrophages primaires humains et les cellules PC12. Les données de qRT-PCR sont exprimées en utilisant l’expression de la GAPDH pour normaliser les résultats. (B) Expression de la DHHC20 dans les lymphocytes T humains (primaires et Jurkat), les macrophages primaires humains et les cellules PC12 (échelle log).