Palmitoylation de Tat sur la cystéine 31 après fixation au PI(4,5)P 2

Figure 30. Palmitoylation de Tat dans les PC12.

Les cellules PC12 ont été transfectées avec Tat-FLAG avant un étiquetage métabolique avec le 17-ODYA, l’immunoprécipitation avec (A) un anti-FLAG et la Click chemistry comme décrite dans la Figure 29, après traitement (+) ou non (-) de 5 h avec 100 µM 2-bromopalmitate (2-BP) ou (B) une immunoprécipitation anti-FLAG et l’Acyl Biotin Exchange (ABE). Les échantillons ont été traités (+) ou non (-) avec de l’hydroxylamine (HA). Le blot a tout d’abord été incubé avec l’avidine-peroxidase afin de détecter la biotine puis avec des anticorps anti-Tat.

Les neurones sont des cellules cibles importantes pour la Tat du VIH-1 (Li et al., 2009). L’équipe a récemment mis en évidence que Tat affecte fortement la neurosécrétion. Après son endocytose par les cellules PC12, la Tat exogène disparaît dans le cytosol avant d’être recrutée par le PI(4,5)P₂ au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique (Tryoen-Toth et al., 2013). Afin d’étudier en détail la palmitoylation de Tat, nous l’avons transfectée dans ce type cellulaire. L’étiquette His₆ ne s’est pas révélée satisfaisante dans ce cas à cause d’un fort bruit de fond lors de la révélation de la palmitoylation. Cela est probablement dû à la fixation de protéines contenant des séquences polyhistidines sur la résine de Nickel. J’ai donc utilisé la protéine TatWT étiquetée avec une étiquette FLAG (Tat-FLAG). Pour détecter la palmitoylation, nous avons utilisé la technique de la Click chemistry ainsi que l’ABE. A la fois la technique de la Click chemistry (Figure 30A) et la technique de l’ABE (Figure 30B) montrent que la TatWT-FLAG transfectée est palmitoylée dans les PC12. La palmitoylation est empéchée par l’addition de 2-bromopalmitate (2-BP) (Figure 30A), un

B - A - Mock Tat-FLAG Biotine Tat HA - + - + Mock Biotine Tat 2-BP Tat-FLAG + -

104 Partie 3 Résultats |

inhibiteur de la palmitoylation (Resh, 2006). La sensibilité de la chaîne acyl de la liaison acyl-Tat à l’hydroxylamine (HA) (Figure 30B) montre que la liaison est une liaison thioester et que le palmitate est attaché à au moins une des sept cystéines de Tat.

Afin d’identifier la cystéine modifiée, j’ai préparé les différents mutants (cystéine → sérine) de Tat-FLAG. Les sept cystéines ont donc été mutées ainsi que le doublet 30/31. En effet, dans le cas des doublets de Cys, la mutation de la Cys modifiée peut parfois amener à la palmitoylation aberrante de la cystéine restante (Abrami et al., 2006). J’ai ensuite examiné la capacité de ces mutants à être palmitoylés dans les cellules PC12. Pour révéler la palmitoylation, j’ai utilisé la technique d’ABE. Une bande est observable pour Tat-FLAG en présence d’hydroxylamine pour les mutants C22S, C25S, C27S, C30S, C34S et C37S lors de la révélation biotine. Ces mutants sont donc palmitoylés. Pour les mutants C31S et C30/31S aucun signal n’est visible en révélation biotine. Nous avons contrôlé que la protéine recombinante était bien immunoprécipitée, la présence de Tat-FLAG étant détectée par un anticorps anti-FLAG. Ces résultats suggèrent que Tat serait palmitoylée sur la cystéine 31. Tous les mutants sont exprimés à des niveaux similaires, mais celui dépourvu de Cys31 n’est pas palmitoylé (Figure 31), indiquant que Tat est palmitoylée sur la Cys31. Des analyses de spectrométrie de masse effectuées par Petra Tryoen-Toth et Jean-Marc Straub à Strasbourg ont confirmé que seule la Cys31 de Tat est palmitoylée. Ces analyses ont également indiqué qu’il existe deux populations de Tat, une population non palmitoylée et une population palmitoylée sur la Cys31.

Figure 31. Palmitoylation de Tat sur la Cystéine 31 et nécessité de la liaison au PI(4,5)P2.

Les cellules PC12 ont été transfectées avec les mutants Tat-FLAG Cys (Cys→ Ser) ou W11Y, avant de réaliser l’ABE. Le blot a tout d’abord été incubé avec l’avidine-peroxidase afin de détecter la biotine puis avec des anticorps anti-Tat. HA : Hydroxylamine.

22 Biotine Tat HA

^- +

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

-

+ - + - +

| Partie 3 Résultats 105

Afin de savoir si la palmitoylation de Tat nécessitait la liaison au PI(4,5)P2, nous avons utilisé le mutant Tat-W11Y qui a une très faible affinité pour le PI(4,5)P2 (Rayne et al., 2010b). Ce mutant a une activité transactivatrice identique à la protéine Tat native, indiquant que la mutation n’affecte pas la conformation de Tat (Yezid et al., 2009). Tat-W11Y, comme observé dans les cellules T (Rayne et al., 2010b), est cytosolique dans les cellules PC12 (Figure 32). De façon cohérente, Tat-W11Y n’est pas palmitoylée (Figure 31) indiquant que la liaison au PI(4,5)P2 est une condition essentielle pour la palmitoylation de Tat et que cette modification a lieu à la membrane plasmique.

Nous avons examiné la distribution subcellulaire des 8 mutants de Tat Cys→Ser dans les PC12. Après transfection, les cellules exprimant les différents mutants de Tat sont identifiées à l’aide du signal EGFP dans les cellules (EGFP non fusionnée à Tat) et la localisation de la protéine Tat est elle-même révélée par l’immunofluorescence anti-Tat. De manière cohérente, tout comme la TatWT, tous les mutants à l’exception des mutants Tat-C31S et Tat-C30/31S sont localisés à la membrane plasmique. La superposition du marquage anti-Tat avec le marquage de l’actine corticale, révélée par de la phalloïdine-Cy5 confirme que cette série de mutants se trouve sur la membrane cellulaire. Ceci suggère que le remplacement d’une cystéine par une sérine pour les positions 22, 25, 27, 30, 34 et 37 n’a pas d’influence majeure sur la localisation de Tat dans les cellules PC12. Par contre, une large fraction (~60%) de Tat-C31S et Tat-C30/31S s’accumule dans le cytosol (Figure 32). Ces mutants ne sont donc pas associés à la membrane plasmique contrairement à la protéine TatWT. En d’autres termes, l’absence de palmitoylation sur le résidu 31 affecte la localisation de Tat dans les cellules PC12. Inversement, l’efficacité du déplacement de Tat vers le cytosol par la mutation C31S indique qu’une forte proportion de la Tat intracellulaire est palmitoylée dans les PC12.

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Figure 32. Localisation des mutants de Tat-Cys et Tat-W11Y dans les PC12.

Les cellules PC12 ont été transfectées avec le mutant Tat-Flag indiqué avant de réaliser une immunofluorescence anti-Tat et un marquage de la F-actine en utilisant de la phalloïdine fluorescente. Les sections optiques médianes sont montrées. Barre d’échelle, 10 µm.

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Cette observation n’indique pas seulement que la palmitoylation de Tat est requise pour sa localisation à la membrane plasmique mais aussi qu’une importante fraction de Tat est palmitoylée dans les PC12. Nous avons voulu vérifier, en utilisant un test de transactivation, si la mutation C31S n’affectait pas la structure de Tat. Après construction et production de ce mutant, nous avons procédé à l’évaluation de sa fonction biologique, par la mesure de son activité de transactivation d’un promoteur LTR en amont d’un gène codant pour la luciférase. En effet, cette activité transactivatrice implique une interaction directe de Tat avec plusieurs partenaires cellulaires de nature protéique ou acide nucléique, faisant intervenir plusieurs domaines de Tat (Jeang et al., 1999). Ce test constitue donc un bon indicateur de la conservation de la structure et de la réactivité du mutant de Tat. Nous n’avons observé aucun effet (Figure 33).

Figure 33. Mesure de l’activité transactivatrice du mutant C31S de Tat transfecté.

Cet essai sert à la vérification de la conformation du mutant de Tat (Tat-C31S) et de son activité. Les cellules PC12 sont co-transfectées par des vecteurs Tat ou Tat-C31S et des gènes rapporteurs luciférases. Le premier code pour la luciférase Firefly, derrière un promoteur LTR-VIH-1 et le second pour un gène luciférase Renilla, sous contrôle d’un promoteur CMV indépendant de Tat (Tyrosine kinase). La transactivation est mesurée après 24 h et le facteur de transactivation est calculé avec le ratio activité Firefly/activité Renilla.

En fait cette mutation est naturellement présente dans le sous-type C du VIH-1 trouvé en Inde et qui est tout autant virulent dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMCs) (Arien et al., 2007), montrant que la mutation C31S n’affecte pas de manière significative la fonction et le repliement de Tat. Pris ensembles, ces résultats montrent que Tat est palmitoylée sur la Cys31 et que cette modification est importante pour la localisation à la membrane plasmique dans les cellules PC12 et qu’une fraction importante de Tat est palmitoylée dans ces cellules. Ces résultats ont été confirmés en utilisant une Tat-C31S exogène qui entre de manière efficace dans les cellules (Figure 34). Après incubation des cellules PC12 pendant 18 h avec du 17-ODYA et les différentes versions de Tat-His6 (WT,

0 20 40 60 80 100 120 WT C31S Transactivation T a t

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W11Y et C31S), celles-ci ont été récupérées à partir des lysats cellulaires en utilisant des billes de Nickel (Ni²⁺) (Figure 34), avant révélation du 17-ODYA par Click chemistry. On observe que seule la TatWT est marquée par le 17-ODYA contrairement à la Tat-W11Y (qui ne peut fixer le PI(4,5)P₂) et la Tat-C31S (qui ne peut être palmitoylée).

Figure 34. La Tat-C31S extracellulaire n’est pas palmitoylée.

Les cellules Jurkat ont été traitées sur la nuit avec 100 µM 17-ODYA et 50 nM Tat-His6 soit la WT, la C31S ou W11Y. Après lyse cellulaire, Tat a été isolée sur une résine Ni-NTA-agarose avant SDS/PAGE et Western blot. Le blot a été incubé dans un premier temps avec l’avidine-peroxidase pour détecter la biotine, puis des anticorps anti-Tat.

En parallèle, nous avons observé la localisation des mutants Cys de Tat dans les lymphocytes T CD4+ primaires humains. Après transfection des cellules avec les différents mutants, la localisation de Tat est révélée par une immunofluorescence anti-Tat. La membrane plasmique et le Golgi sont révélées par la WGA. Tous les mutants, même le C31S, sont observés à la membrane plasmique dans les lymphocytes T CD4+ primaires humains (Figure 35). Le mutant 31, alors qu’il était largement cytoplasmique dans les PC12, est ici présent à la membrane plasmique. Le double mutant est présent à la fois à la membrane et dans le cytosol selon les cellules (Figures 35 et 36). Il semble que la palmitoylation, en absence de la Cys 31, ait été transférée sur la Cys voisine (Cys30) du doublet 30/31 permettant ainsi au mutant Tat-C31S d’être localisé à la membrane plasmique dans les lymphocytes T primaires humains.

Mock WT W11Y C31S

Biotine Tat

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Figure 35. Localisation des mutants de Tat-Cys dans les lymphocytes T CD4+ primaires humains.

Les lymphocytes T CD4+ primaires humains ont été transfectés avec le mutant Tat-FLAG indiqué avant de réaliser une immunofluorescence anti-Tat et un marquage de la membrane en utilisant de la Wheat germ agglutinine (WGA) fluorescente. Les sections optiques médianes sont montrées. Barre d’échelle, 10 µm.

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Figure 36. Répartition intracellulaire du double mutant cystéine Tat-C30/31S dans les lymphocytes T CD4+ primaires humains.

Les lymphocytes T CD4+ primaires humains ont été transfectés avec le mutant Tat-C30/31S afin de réaliser une immunofluorescence anti-Tat et un marquage de la membrane en utilisant de la Wheat germ agglutinine (WGA) fluorescente. La distribution intracellulaire du mutant a été analysée avec le logiciel ImageQuant. Plus de 30 cellules ont été comptées.

Dans le cas des cellules T, la palmitoylation de Tat n’est donc pas strictement requise pour sa localisation membranaire contrairement au cas des PC12.