5.6 Déroulement des Simulations
5.6.4 Périodes d’estimation et périodes de backtesting
A atividade das enzimas SOD, POD, PAL, teor de Fenóis e PPO foram influenciados pela interação dos fatores locais da planta e dia após a inoculação (DAI) (Tabelas 13, 15, 16, 17 e 18), enquanto que a atividade da enzima CAT foi influenciada somente pelo fator dia após a inoculação (Tabela 14).
A maior atividade da enzima SOD (1,82 U g-1 proteína) ocorreu nos tratamentos Local da enxertia e Abaixo da enxertia não-inoculados aos 15 DAI (Tabela 13). Tanto neste dia, quanto aos 2 DAI, estes tratamentos apresentaram maior atividade da SOD que os demais (Tabela 13).
Tabela 13. Atividade da enzima SOD (U g-1 proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 1,32 aB 1,32 bB 1,51 aA 1,51 aA 1,51 aA 1,52 cA Local enxertia inoculado 1,34 aB 1,32 bB 1,52 aA 1,49 aA 1,49 aA 1,49 cA Abaixo enxertia inoculado 1,33 aB 1,32 bB 1,52 aA 1,51 aA 1,51 aA 1,53 cA Enxerto PF inoculado 1,33 aB 1,32 bB 1,51 aA 1,50 aA 1,52 aA 1,51 cA Porta-enxerto PF inoculado 1,32 aB 1,31 bB 1,52 aA 1,51 aA 1,50 aA 1,51 cA Enxerto PF não-inoculado 1,32 aB 1,33 bB 1,52 aA 1,50 aA 1,51 aA 1,51 cA Porta-enxerto PF não-inoculado 1,33 aB 1,34 bB 1,51 aA 1,49 aA 1,52 aA 1,52 cA Acima enxertia não-inoculado 1,34 aC 1,35 bC 1,52 aB 1,51 aB 1,53 aB 1,68 bA Local enxertia não-inoculado 1,34 aC 1,55 aB 1,49 aB 1,51 aB 1,53 aB 1,82 aA Abaixo enxertia não-inoculado 1,34 aC 1,52 aB 1,52 aB 1,53 aB 1,50 aB 1,82 aA
CV (%) = 2,49 F = 10,05* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A interação dos fatores locais da planta e DAI não influenciaram na atividade da enzima CAT (Tabela 14). Ao analisar os fatores separadamente, foi observado influencia do fator DAI e de forma significativa (Tabela 14).
Independente do local da planta, a maior atividade da CAT foi observada aos 0 e 2 DAI. A menor atividade ocorreu aos 15 DAI, entretanto, não diferiu das atividades observadas aos 4, 6 e 8 DAI (Tabela 14). Apesar de não ocorrer diferença estatística entre os dias com menores atividades, pode-se observar tendência à diminuição da atividade da CAT ao longo do tempo após a inoculação (Tabela 14).
Tabela 14. Atividade da enzima CAT (μmol H2O2 min-1 mg-1 proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação de R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Fatores Médias
Locais da planta CAT1
Acima enxertia inoculado 6,9 x 10-10 a Local enxertia inoculado 7,9 x 10-10 a Abaixo enxertia inoculado 7,3 x 10-10 a Enxerto PF inoculado 7,2 x 10-10 a Porta-enxerto PF inoculado 7,7 x 10-10 a Enxerto PF não-inoculado 7,5 x 10-10 a Porta-enxerto PF não-inoculado 6,5 x 10-10 a Acima enxertia não-inoculado 7,3 x 10-10 a Local enxertia não-inoculado 7,0 x 10-10 a Abaixo enxertia não-inoculado 7,2 x 10-10 a
Dias após a inoculação (DAI) CAT1
0 1,0 x 10-09 a 2 1,0 x 10-09 a 4 5,9 x 10-10 b 6 6,1 x 10-10 b 8 5,7 x 10-10 b 15 5,3 x 10-10 b CV (%) = 17,34 F = 30,19* 1 Dados originais transformados em 1/√X
* Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A maior atividade da POD (0,15 μmol H2O2 min-1 mg-1 proteína) ocorreu no local da enxertia das plantas enxertadas inoculadas com R. solanacearum no dia da inoculação ( DAI). Esta atividade ainda foi maior que os demais tratamentos aos 2 e 15 DAI, porém não diferiu do local da enxertia não-inoculado aos 4, 6 e 8 DAI (Tabela 15).
Estes resultados mostram que houve aumento da atividade da POD no local de enxertia logo após a inoculação, porém a diferença entre o local da enxertia com e sem R. solanacearum não foi tão representativa (Tabela 15). Este aumento após a inoculação também foi observado por Mandal et al (2011), entre 0 e 3 DAI em plantas pé-franco de tomateiro resistentes com relação as suscetíveis. As plantas enxertadas do estudo em discussão, apresentaram maior nível de resistência a R. solanacearum que as plantas pé-franco do enxerto (Tabela 9 e 10) e, segundo Mandal et al. (2011), plantas de tomateiro com resistência podem apresentarem sistema antioxidante mais eficiente, menor taxa de peroxidação lipídica e deposição de lignina na parede celular, que podem contribuir para resistência destas plantas a R. solanacearum.
A ausência de diferença na atividade da POD no local da enxertia, entre os 4 e 8 DAI (Tabela 15), sugere que a elevada atividade dessa enzima neste local com e sem a presença da R. solanacearum, durante este período, pode não ser devido a bactéria e sim ao processo de enxertia. O melhor desenvolvimento de plantas enxertadas de tomateiro pode estar relacionado à melhoria da fotossíntese e aumento da atividade de enzimas antioxidantes, dentre elas a peroxidase (HE et al., 2009).
O local abaixo da enxertia não-inoculado em interação com os 15 DAI ocasionaram a menor atividade da POD (0,05 μmol H2O2 min-1 mg-1 proteína). Porém, neste dia, este local da planta não diferiu dos locais acima da enxertia, abaixo da enxertia, enxerto PF, porta-enxerto PF, ambos inoculados e porta-enxerto PF e acima da enxertia não- inoculados (Tabela 15), apesar de estes tratamentos terem apresentado atividade da CAT um pouco acima da atividade apresentada pelo abaixo enxertia não-inoculado.
Tabela 15. Atividade da enzima POD (μmol H2O2 decomposto min-1 mg-1 proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 0,08 cA 0,08 cdAB 0,07 bABC 0,06 bC 0,06 bBC 0,06 cdC Local enxertia inoculado 0,15 aA 0,14 aAB 0,12 Ac 0,13 aBC 0,12 aC 0,12 aC Abaixo enxertia inoculado 0,08 cdBC 0,08 cdB 0,07 bBC 0,13 aA 0,06 bC 0,06 cdC Enxerto PF inoculado 0,08 cA 0,08 cdA 0,07 bA 0,07 bA 0,07 bA 0,07 cdA Porta-enxerto PF inoculado 0,08 cAB 0,08 cA 0,07 bB 0,07 bB 0,07 bB 0,07 cdB Enxerto PF não-inoculado 0,06 dB 0,08 cdA 0,06 bB 0,07 bAB 0,07 bAB 0,07 cAB Porta-enxerto PF não-inoculado 0,08 cAB 0,08 cdA 0,06 bBC 0,06 bC 0,07 bABC 0,07 cdABC Acima enxertia não-inoculado 0,08 cA 0,08 cdAB 0,07 bABC 0,07 bBC 0,06 bC 0,06 dC Local enxertia não-inoculado 0,13 bA 0,12 bAB 0,13 aA 0,12 aA 0,12 aA 0,10 bB Abaixo enxertia não-inoculado 0,08 cA 0,07 dAB 0,06 bBC 0,07 bAB 0,06 bABC 0,05 dC
CV (%) = 9,46 F = 6,35* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Independente dos dias em que foram coletadas as amostras do caule, quase todos os locais das plantas infectados com R. solanacearum apresentaram maiores atividades da PAL que os locais das plantas não-inoculados, exceto o porta-enxerto inoculado (Tabela 16).
O local da enxertia das plantas inoculadas apresentou maiores atividades da enzima PAL que os demais tratamentos em todos os dias após a inoculação (Tabela 16). A maior atividade da PAL (12,35 μmols min-1 mg-1 de proteína) deste local da enxertia infectado ocorreu aos 2 DAI (Tabela 16).
Esta maior atividade da PAL, pode estar relacionada com a resistência da planta enxertada ao patógeno, e isto faz com que a enzima PAL aumente sua capacidade catalisadora para formação de fenóis. Shou et al. (2005) e Vanitha et al. (2009) apontaram a enzima PAL como marcador bioquímico na resitência/suscetibilidade de tomaterio a R. solanacearum, baseados no aumento da atividade desta enzima em plantas pé-franco de tomateiro resistentes em relação as suscetíveis. Porém, não foi encontrado estudos relacionando esta resistência à R. solanacearum em plantas enxertadas de tomateiro.
Quando ocorre aumento da atividade da enzima PAL, também ocorre aumento da formação de ácido trans-cinâmico na rota do ácido chiquímico e aumento no teor de fenóis (ENGELBERTH, 2009) em resposta a infecção com R. solanacearum em tomateiro pé-franco (MANDAL et al., 2011). Entretando o aumento no teor de fenóis (Tabela 17) não acompanhou o aumento da atividade da PAL (Tabela 16) neste estudo com tomateiro enxertado e R. Solanacearum.
A atividade da PAL pode ser alterada por fatores ambientais, tais como baixos teores de nutrientes, luz e infecção por patógenos. A presença de fenóis em plantas e sua síntese em resposta à infecção estão associadas com resistência a doenças (WHETTEN & SEDEROFF, 1995). Isto tornou a enzima PAL uma das mais estudadas no metabolismo secundário de plantas (ENGELBERTH, 2009), principalmente em pesquisas com tomateiro pé-franco e R. solanacearum (BYTH, et al., 2001; SHOU et al., 2005; SILVA et al., 2007; VANITHA et al., 2009).
As menores atividades da PAL ocorreram nas plantas não-inoculadas com a bactéria e também nas plantas do porta-enxerto PF inoculado (Tabela 16). Sendo que a
menor atividade da PAL (5,60 μmols min-1 mg-1 de proteína) ocorreu abaixo da enxertia nas plantas não-inoculadas aos 15 DAI (Tabela 16).
Tabela 16. Atividade da enzima PAL (μmols min-1 mg-1 de proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R.
solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 10,25 abA 10,17 bAB 9,19 bBCD 9,42 bABC 8,37 bcD 8,51 bCD Local enxertia inoculado 11,31 aB 12,35 aA 10,96 aB 11,18 aB 10,69 aB 10,87 aB Abaixo enxertia inoculado 9,75 bAB 9,91 bA 8,70 bC 8,99 bABC 8,78 bBC 9,10 bABC Enxerto PF inoculado 10,14 bA 9,96 bAB 9,15 bABC 9,06 bBC 7,82 bcdD 8,57 bCD Porta-enxerto PF inoculado 7,78 cABC 7,22 cBC 6,88 cC 7,75 cABC 8,28 bcA 8,18 bAB Enxerto PF não-inoculado 6,76 cAB 7,01 cA 6,52 cAB 6,14 eAB 6,47 eAB 5,84 cB Porta-enxerto PF não-inoculado 7,44 cA 7,27 cAB 6,16 cC 6,28 deBC 6,32 eBC 5,93 cC Acima enxertia não-inoculado 7,41 cA 7,23 cA 6,95 cA 6,77 cdeA 7,01 deA 6,50 cA Local enxertia não-inoculado 7,31 cA 6,58 cAB 7,26 cA 7,03 cdeAB 6,79 deAB 6,11 cB Abaixo enxertia não-inoculado 7,24 cA 6,76 cA 6,93 cA 7,32 cdA 7,40 cdeA 5,60 cB
CV (%) = 6,12 F = 3,81* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A maior produção do teor de fenóis (0,95 mg g-1 massa fresca) ocorreu também no local da enxertia das plantas inoculadas, porém no quarto dia após a inoculação (4 DAI). É importante destacar ainda que o teor de fenóis neste local da planta aos 4 DAI, só diferenciou estatisticamente do local abaixo da enxertia inoculado, que apresentou a menor produção de fenóis (0,86 mg g-1 massa fresca) (Tabela 17).
Esta maior produção de fenóis no local da enxertia das plantas inoculadas aos 4 DAI (Tabela 17) foi precedida pela maior atividade de PAL observada aos 2 DAI (Tabela 16), além de coincidir com alta atividade desta enzima aos 4 DAI (Tabela 15). A PAL é responsável pela síntese de fenóis relacionados à defesa da planta à patógenos.
As classes mais abundantes de compostos fenólicos ou fenóis em plantas são derivadas da fenilanina, por meio da eliminação de uma molécula de amônia (NH3) para formar ácido trans-cinâmico. Essa reação é catalisada pela PAL, a qual está situada em um ponto de ramificação entre os metabolismos primário e secundário e é uma etapa reguladora importante na formação de muitos fenóis (ENGELBERTH, 2009).
O menor teor de fenóis (0,84 mg g-1 massa fresca) foi observado aos 15 DAI acima da enxertia em plantas não-inoculadas(Tabela 17). Porém neste dia só diferiu dos tratamentos abaixo da enxertia, enxerto PF inoculados e enxerto PF não-inoculado que apresentaram teores de fenóis superiores (Tabela 17).
Tabela 17. Teor de fenóis (mg g-1 massa fresca) em função da enxertia e do dia após a inoculação de R. solanacearum. UNESP- FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 0,84 bB 0,89 aAB 0,90 abAB 0,90 aAB 0,89 aAB 0,91 abcA Local enxertia inoculado 0,85 bC 0,91 aAB 0,95 aA 0,87 aBC 0,91 aAB 0,88 abcBC Abaixo enxertia inoculado 0,84 bC 0,90 aAB 0,86 bBC 0,92 aA 0,92 aA 0,91 aAB Enxerto PF inoculado 0,82 bB 0,92 aA 0,92 abA 0,93 aA 0,91 aA 0,91 abA Porta-enxerto PF inoculado 0,84 bC 0,89 aABC 0,92 abA 0,90 aAB 0,92 aA 0,86 abcBC Enxerto PF não-inoculado 0,87 abB 0,91 aAB 0,93 aA 0,92 aAB 0,92 aAB 0,92 aAB Porta-enxerto PF não-inoculado 0,92 aA 0,91 aA 0,92 abA 0,93 aA 0,89 aA 0,90 abcA Acima enxertia não-inoculado 0,92 aA 0,93 aA 0,91 abA 0,91 aA 0,89 aAB 0,84 cB Local enxertia não-inoculado 0,92 aA 0,93 aA 0,93 aA 0,92 aA 0,92 aA 0,85 bcB Abaixo enxertia não-inoculado 0,92 Aa 0,91 aA 0,90 abA 0,91 aA 0,92 aA 0,87 abcA
CV (%) = 3,13 F = 3,32* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A maior atividade da PPO (15,86 µmol catecol oxidado min-1 µg-1 proteína) ocorreu no local abaixo da enxertia inoculado, no segundo dia após a enxertia (2 DAI), quando é observado aumento do teor de fenóis em relação ao dia da inoculação. A atividade da PPO neste local das plantas inoculadas ainda foi maior que os demais locais nos 0, 4, 6 e 15 DAI (Tabela 18), exceto aos 8 DAI.
O fato da maior atividade da PPO ter ocorrido abaixo da região de enxertia, pode ser devido a oxidação de compostos fenólicos, catalisada pela PPO (THIPYAPONG et al., 2007) no porta-enxerto próximo ao local da enxertia. Isto pode ser devido o porta-enxerto ser resistente a bactéria R. solanacearum.
A PPO tem participação na defesa da planta contra patógenos, porém existem poucos relatos do seu papel nesta defesa (VANITHA, et al., 2009). Os resultados deste estudo com plantas enxertadas e pé-franco infectadas com R. solanacearum mostram essa relação da PPO com a defesa do tomateiro à esta bactéria, assim como, os encontrados por Chen et al. (2003) e Vanitha et al. (2009), que relacionaram o aumento na atividade da PPO com as alterações do metabolismo das plantas de tomateiro e resistência a R. solanacearum.
A combinação local da enxertia não-inoculado e 15 DAI ocasionou a menor atividade da PPO (6,18 µmol catecol oxidado min-1 µg-1 proteína). Porém neste dia, este valor só diferiu do valor obtido para o local abaixo da enxertia inoculado (Tabela 18).
Tabela 18. Atividade da enzima PPO (µmol catecol oxidado min-1 µg-1 proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 7,54 bA 10,01 bA 9,54 bcA 7,77 bA 8,64 aA 8,07 bcA Local enxertia inoculado 7,53 bB 10,46 bA 10,15 bcAB 9,21 bAB 8,54 aAB 8,35 bcAB Abaixo enxertia inoculado 14,44 aA 15,86 aA 15,13 aA 15,19 aA 10,38 aB 13,41 aA Enxerto PF inoculado 6,88 bB 9,51 bAB 10,45 bA 8,44 bAB 8,46 aAB 8,41 bcAB Porta-enxerto PF inoculado 7,67 bA 10,05 bA 7,95 bcA 8,04 bA 10,38 aA 7,82 bcA Enxerto PF não-inoculado 8,32 bA 8,36 bA 8,29 bcA 9,36 bA 8,29 aA 8,54 bcA Porta-enxerto PF não-inoculado 9,19 bA 8,07 bA 7,64 bcA 7,94 bA 10,38 aA 9,44 bA Acima enxertia não-inoculado 8,24 bA 8,96 bA 8,99 bcA 8,84 bA 7,81 aA 6,62 bcA Local enxertia não-inoculado 8,36 bA 8,65 bA 7,92 bcA 7,51 bA 7,52 aA 6,18 cA Abaixo enxertia não-inoculado 8,12 bA 8,87 bA 7,07 cA 8,34 bA 8,09 aA 7,31 bcA
CV (%) = 15,55 F = 2,20* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
7.3 EXPERIMENTO 3: Produção do tomateiro em função de três métodos de