La nécessité de la vie commune

Os procedimentos laboratoriais para a realização da técnica imunoistoquímica foram realizados no Laboratório de Imunoistoquímica da Faculdade de Odontologia da UFBA. Inicialmente, os blocos parafinados foram seccionados (4 μm) em micrótomo e os cortes colocados sobre lâminas de vidro previamente tratadas com organosilano (281778, Sigma-Aldrich, Missouri, EUA) a 2% em acetona.

Os cortes foram desparafinizados por imersão em xilol e hidratados em porcentagens decrescentes de etanol, seguido de incubação em peróxido de hidrogênio 3% diluído em tampão fosfato-salino (PBS), por 45 minutos.

Quando utilizado o bloqueio de sítios inespecíficos, após exposição antigênica em solução de tampão citrato-fosfato 10 mM pH 6,0 em steamer a 95°C durante 20 minutos e resfriamento por 20 minutos, os cortes foram incubados conforme padronização por 10 minutos em Protein Block Serum-Free (Dako) para posterior incubação com o anticorpo primário em câmara úmida a 4°C por 18 horas. A incubação com o sistema de detecção EnVision™ Dual Link System HRP (Dako) ocorreu por 30 minutos, e do ADVANCE HRP (Dako) em duas fases com duração de 30 minutos cada.

A diluição do anticorpo primário, padronização do bloqueio de interação inespecífica e o método de detecção utilizados para cada proteína constam no Quadro 1. A revelação da reação foi feita com 3,3’-diaminobenzidina (Dako Liquid DAB Plus, Dako) e as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina de Mayer. Entre essas passagens, os cortes foram lavados duas vezes com solução tampão PBS pH 7,4 acrescido de Triton 0,1%. Os cortes foram então desidratados em cadeia ascendente de álcool por 5 min cada, e diafinizados em dois banhos de xilol. As lâminas foram então montadas em resina Permount (Fisher Scientific)

para exame ao microscópio de luz.

Os procedimentos de controle envolveram a utilização de amostra com reatividade conhecidamente positiva para cada anticorpo, funcionando como controle externo positivo da reação (Quadro 1). Como controle interno negativo, foi utilizado o mesmo tecido, onde o anticorpo primário foi substituído por soro não reativo devendo a reação ser completamente negativa.

Quadro 1. Descrição dos anticorpos primários utilizados, diluição do anticorpo primário, bloqueio de interações inespecíficas, método de

detecção e tecido controle utilizados nas reações de imunoistoquímica. Anticorpo Tipo do

Anticorpo

Animal Hospedeiro

Marca Código Clone Bloqueio Interações Inespecíficas Diluição Anticorpo Primário Kit de Visualização Tecido Controle Positivo

α-SMA Monoclonal Camundongo Dako M0851 1A4 Sem bloqueio _1:100 EnVision™ _{Systems (tec.mole)} Rato

Fibronectin Monoclonal Camundongo Abcam ab2375

1 IST-9 Protein Block Serum-Free 1:1000 ADVANCETM HRP CEB humano S100A4

(FSP1) Policlonal Coelho Abcam

ab4072 2 - Protein Block Serum-Free 1:500 EnVision™ Systems CEB humano Muscle

Actin Monoclonal Coelho Dako M0635 HHF3

5 Sem bloqueio 1:500 ADVANCETM HRP Rato (tec. mole)

Vimentin Monoclonal Camundongo Dako M0725 V9 Sem bloqueio _1:1000 ADVANCE

TM HRP

CEB humano

4.3.2 Análise Imunoistoquímica.

Para os marcadores α-SMA, Vimentina, HHF35 e Fibronectina foi considerada a imunoreatividade positiva quando células do estroma com morfologia fusiforme presentes na interface com as ilhas epiteliais neoplásicas, exibiram marcação marrom em núcleo e/ou citoplasma. Para o anticorpo FSP1 foram atribuídos os escores de acordo com a intensidade e proporção de células positivas no estroma: 1, marcação fraca em <50% ou marcação moderada em <20% de células estromais; 2, marcação fraca em ≥50%, marcação moderada em 20–50% ou marcação forte em <20%; 3, marcação moderada em ≥50% ou marcação forte em ≥20%. Casos com escore 3 foram considerados positivos para expressão da proteína FSP-1.

Dois patologistas sem conhecimento prévio dos resultados clínicopatológicos avaliaram os resultados das reações imunoistoquímica, e discutiram eventuais discrepâncias até alcançar o consenso. A análise da expressão proteica foi realizada para cada marcador individualmente e a caracterização do imunofenótipo FAC (α-SMA+/Fibronectina+/FSP1+/HHF35+/Vimentina+) foi estabelecida através da expressão aos cinco marcadores.

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

De acordo com o delineamento da pesquisa, todos os dados obtidos foram tabulados e submetidos à análise estatística através de testes não-paramétricos pelo programa GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., CA, EUA), utilizando intervalo de confiança de 95% e valor de p < 0,05. A associação da imunoexpressão proteica do fenótipo FAC com os subtipos histológicos de FAC e com os parâmetros clínicopatológicos foi avaliada utilizando o Teste do Qui- Quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher quando não houvesse condições para utilização do teste Qui-quadrado.

5. RESULTADOS

Os dados clinicopatológicos dos 34 casos de CEB analisados revelaram que a média de idade foi de 56 anos (variando de 27-89 anos, DP=13,7), sendo que 18 (58,1%) tinham menos que 60 anos e 13 (41,9%) idade igual ou superior a 60 anos. A maioria era do sexo masculino, com 25 casos, correspondendo a 80,7%. A localização principal do tumor primário foi assoalho de boca, com 14 casos (45,2%). O tamanho do tumor primário também foi um parâmetro clínico analisado, sendo que 15 (62,5%) apresentaram tamanho T1 (até 2 cm de diâmetro) ou T2 (entre 2 a 4 cm de diâmetro). Em relação a graduação histológica de malignidade, 19 (61,3%) casos foram classificados em BD, 6 (19,3%) casos MD e 6 (19,3%) PD.

De acordo com a os subtipos histológicos de FAC empregada aos casos de CEB, 16 casos (47%) foram considerados com o FAC maduro, e 18 casos (53%) como FAC imaturo (Figura 1). Nenhuma das variáveis clinicopatológicas analisadas (idade, sexo, tamanho do tumor, localização do tumor e graduação patológica) apresentou resultados estatisticamente significantes quando comparadas aos subtipos histológicos estudados (Tabela 1).

Tabela 1. Associação dos subtipos histológicos de FAC com as características

clinicopatológicas de CEB.

Características* FAC Valor de P# Imaturo Maduro 18 (53%) 16 (47%) Idade 0,293 <60 anos 12 (38,7) 6 (19,4) ≥ 60 anos 6 (19,4) 7 (22,5) Sexo 0,675 Feminino 3 (9,7) 3 (9,7) Masculino 15 (48,4) 10 (32,2) Tamanho do Tumor 1,000 T1+T2 7 (29,2) 8 (33,3) T3+T4 5 (20,9) 4 (16,6) Localização do Tumor 0,367 Assoalho de boca 7 (22,6) 7 (22,6) Língua 5 (16,1) 1 (3,2) Outros sítios 6 (19,3) 5 (16,2) Graduação Patológica 0,411 BD 8 (25,8) 11 (35,5) MD 4 (12,9) 2 (6,4) PD 4 (12,9) 2 (6,4)

*Nos parâmetros utilizados a soma pode não corresponder ao número de casos devido dados perdidos.

#

Teste Exato de Fisher, p < 0,05

Analisando a imunoexpressão dos marcadores α-SMA, Fibronectina, FSP1, HHF35 e Vimentina na interface do estroma com a neoplasia (Figura 2), encontrou-se positividade de 88,2% para α-SMA, 94,0% para Fibronectina, 82,3% para FSP1, 76,4% para HHF35 e 97,1% em relação à Vimentina. A análise da expressão desses marcadores também foi realizada comparando-se à classificação histológica dos FAC em maduro ou imaturo e houve uma associação estatisticamente significante entre a expressão positiva de α-SMA e FAC imaturos (p=0,039, Teste Exato de Fisher) (Tabela 2).

Tabela 2. Associação entre expressão de α-SMA, Fibronectina, FSP1, HHF35, Vimentina

e classificação histológica de FAC.

N (%) Subtipos Histológicos Valor de P# FAC Imaturo FAC Maduro

α-SMA Positiva 30 (88,2) 18 (52,9) 12 (35,3) 0,039 Negativa 4 (11,8) - 4 (11,8) Fibronectina 0,486 Positiva 32 (94,0) 16 (47,0) 16 (47,0) Negativa 2 (5,9) 2 (05,9) - FSP1 1,000 Positiva 28 (82,3) 15 (44,1) 13 (38,2) Negativa 6 (17,6) 3 (8,8) 3 (8,8) HHF35 0,110 Positiva 26 (76,4) 16 (47,0) 10 (29,4) Negativa 8 (23,5) 2 (5,9) 6 (17,6) Vimentina 0,470 Positiva 33 (97,1) 18 (52,9) 15 (44,1) Negativa 1 (2,9) - 1 (2,9)

*Nos parâmetros utilizados a soma pode não corresponder ao número de casos devido dados perdidos.

#

Teste Exato de Fisher, p < 0,05

Para caracterização do imunofenótipo FAC, foi analisada a reatividade aos cinco marcadores simultaneamente (α-SMA+/Fibronectina+/ FSP1+/HHF35+/Vimentina+) e em 19 (56%) dos casos, o imunofenótipo foi positivo para FAC. Em 15 casos (44%) não foi observada essa expressão e o imunofenótipo foi considerado variável.

Não houve associação estatisticamente significante quando comparado a imunoexpressão dos marcadores de FAC com parâmetros clinicopatológicos. Entretanto, foi observada uma tendência para a presença de FAC estar associada à graduação patológica, uma vez que a maioria dos casos de tumores BD apresentou imunofenótipo de FAC e o padrão PD foi encontrado com mais frequência no imunofenótipo variável (p = 0,071, Teste Exato de Fisher), Tabela 3.

Por fim, a associação da imunoexpressão dos marcadores de FAC com os subtipos histológicos dos FAC em maduro ou imaturo revelou que o imunofenótipo FAC (α-SMA+/ Fibronectina+/ Vimentina+/ HHF35+/ FSP1+) foi encontrado com mais frequência nos FAC imaturos que nos maduros, e essa associação foi estatisticamente significativa (p=0,041), como indicado na Tabela 3.

Tabela 3. Associação do Imunofenótipo FAC por coexpressão de α-SMA, Fibronectina,

HHF35, Vimentina e FSP-1 com achados clínicopatológicos e classificação histológica de FAC.

Características Total Imunofenótipo FAC Imunofenótipo Variável Valor de P# Idade* 1,000 <60 anos 18 (58,0) 10 (32,2) 8 (25,8) ≥ 60 anos 13 (42,0) 7 (22,6) 6 (19,3) Sexo* 1,000 Feminino 6 (19,3) 3 (9,7) 3 (9,7) Masculino 25 (80,6) 14 (45,1) 11 (35,5) Tamanho do Tumor* 1,000 T1+T2 15 (62,5) 6 (25,0) 9 (37,5) T3+T4 9 (37,5) 4 (16,6) 5 (20,8) Localização do Tumor* 0,669 Assoalho de boca 15 (48,4) 8 (25,7) 7 (22,6) Língua 5 (16,1) 2 (6,4) 3 (9,7) Outros Sítios 11 (35,5) 7 (22,6) 4 (13,0) Graduação Patológica* 0,071 BD 19 (61,3) 12 (38,7) 7 (22,6) MD 6 (19,4) 3 (9,7) 3 (9,7) PD 6 (19,3) 1 (3,2) 5 (16,1) Subtipos Histológicos 0,041 FAC Imaturo 18 (53,0) 13 (38,2) 5 (14,7) FAC Maduro 16 (47,0) 6 (17,6) 10 (29,4)

*Nos parâmetros utilizados a soma pode não corresponder ao número de casos devido dados perdidos.

#

6. DISCUSSÃO

O presente trabalho investigou a presença de FAC em CEB através da expressão imunoistoquímica de cinco marcadores de FAC e associou o

imunofenótipo FAC com subtipos histológicos e com parâmetros

clínicopatológicos de pacientes portadores de CEB. Em 19 casos (56%), o imunofenótipo foi positivo para FAC e em 15 casos (44%), o imunofenótipo foi variável. De acordo com a classificação histológica de FAC, 16 casos (47%) foram considerados com o fenótipo de FAC maduro, e 18 casos (53%) como fenótipo FAC imaturo. Houve associação entre a expressão positiva de α-SMA e FAC imaturo, e foi observado que o imunofenótipo FAC se associou com tipo histológico FAC imaturo nesses tumores.

Fibroblastos são as células mais abundantes e versáteis do tecido conjuntivo, mostrando uma notável capacidade de se diferenciar em outros elementos, tais como osteoblastos, condroblastos, adipócitos e células musculares lisas. Essas transformações são reguladas por hormônios e fatores de crescimento secretados pela matriz extracelular circundante. É possível coexistirem lado a lado fibroblastos “maduros”, que tem uma menor capacidade de transformação, e fibroblastos “imaturos”, que podem se desenvolver em uma variedade de tipos de células maduras. Geralmente, fibroblastos imaturos são conhecidos por mostrar tipicamente um amplo núcleo eucromático, com um ou dois nucléolos, retículo endoplasmático rugoso e aparelho de Golgi proeminentes em achados ultraestruturais. Fibroblastos imaturos frequentemente são chamados de células mesenquimais (ALBERTS et al., 2002).

Primeiramente examinamos o fenótipo FAC baseado em categorias histológicas de FAC. Segundo a classificação de HA et al. (2014), 18 (53%) casos foram classificados como FAC imaturo, definido como células fusiformes grandes, largas, com nucléolos proeminentes, e 16 casos (47%) como FAC maduro, caracterizado pela morfologia ondulada, alongada, delgada semelhante a fibroblastos normais. Resultados semelhantes foram obtidos pelo estudo prévio de HA et al. (2014) em carcinoma epidermoide esofágico (CEE), que classificou 55,2% dos casos como FAC imaturos e 44,8% dos casos como FAC maduros. Esse autor também encontrou correlação entre categorias histológicas e

desfechos clínicos: o fenótipo FAC imaturo foi fortemente correlacionado com diminuição da sobrevida global e sobrevida livre de doença. Outros fatores relacionados ao microambiente tumoral e diretamente envolvidos com a progressão do câncer, tais como aumento na densidade de microvasos, aumento de macrófagos associados a tumor e fenótipo de TEM, foram significativamente mais frequentes nos fenótipos FAC imaturos que no fenótipo maduro. Esses achados demonstraram que a classificação histológica do fenótipo FAC é clinicamente relevante e pode representar um marcador de prognóstico confiável em CEE, apesar da necessidade de uma compreensão mais detalhada do seu mecanismo molecular.

Em CEB, essa classificação necessita de avaliação quanto ao seu valor prognóstico. No presente estudo, nenhuma das variáveis clínicopatológicas analisadas (idade, sexo, tamanho do tumor, localização do tumor e graduação patológica) apresentou resultados estatisticamente significantes quando comparadas aos subtipos histológicos de FAC. Investigações futuras que incluam estudos com uma maior casuística e com dados que possibilitem estimar o prognóstico da doença (estadiamento TNM, taxas de sobrevida e metástases) são necessárias para validar a caracterização histológica como biomarcador em CEB. Até então não existe uma técnica específica de detecção de FAC. Eyden (2008) afirma que uma definição mais precisa de miofibroblastos deve incluir características ultraestruturais tais como retículo endoplasmático rugoso proeminente, miofilamentos periféricos, presença de fibronexos e junções gap, em combinação com imunofenótipo positivo para α-SMA, fibronectina e vimentina no contexto de células com morfologia fusiforme, o que destaca a importância da imunofenotipagem para caracterização de FAC.

Para caracterização do imunofenótipo FAC, analisamos a reatividade aos cinco marcadores simultaneamente, já que até o momento não foi identificada especificidade absoluta de marcadores FAC. Eyden (2008) define imunofenótipo de miofibroblastos pela expressão imuno-histoquímica de α-SMA, vimentina, fibronectina e miosina não muscular. Nós escolhemos α-SMA, Fibronectina, FSP1, HHF35, Vimentina com base em estudos anteriores que mostram valor prognóstico desses marcadores individuais em CEB ou outros carcinomas

(BELLO et al., 2011; DING et al., 2014; HERRERA et al., 2013; MARSH et al., 2011; OSAMU et al., 1997; VERED et al., 2010b).

A expressão isolada de α-SMA é amplamente utilizada na caracterização de FAC (BELLO et al., 2011; DING et al., 2014; MARSH et al., 2011; VERED et al., 2010b), entretanto devido à diversidade de origem celular de FAC e grande heterogeneidade de fenótipos FAC, marcadores adicionais são necessários para uma boa especificidade (MAO et al., 2013). Esse é o primeiro estudo a utilizar a expressão de α-SMA, Fibronectina, FSP1, HHF35 e Vimentina para caracterizar os FAC em CEB. Exceto a α-SMA, marcador mais utilizado na identificação de miofibroblastos diferenciados (BELLO et al., 2011), tentamos validar a co- expressão aos outros quatro anticorpos para caracterização do imunofenótipo FAC em CEB, e observamos com os resultados da imunohistoquímica que todos esses anticorpos foram caracteristicamente expressos em fibroblastos do estroma próximos de células neoplásicas, sugerindo co-expressão de Fibronectina, FSP1, HHF35, Vimentina como imunofenótipo característico de FAC em CEB.

A α-SMA, Fibronectina, FSP1, HHF35 e Vimentina foram expressos em 88,2%, 94%, 82,3%, 76,4% e 97,1% dos fibroblastos do estroma em CEB, respectivamente. No trabalho de HA et al. (2014) com CEE, os marcadores FAC utilizados α-SMA, FSP1, FAP, PDGFR e PDGFRB foram expressos em 82,8%, 72,4%, 61,2%, 88,8%, 54,3% dos fibroblastos estromais, respectivamente, e esse autor observou ainda expressão extremamente heterogênea aos cinco marcadores FAC em cada CEE analisado (N=116). No nosso estudo, classificamos imunofenótipo FAC com base na reatividade aos cinco marcadores simultaneamente (α-SMA+, Fibronectina+, FSP1+, HHF35+, Vimentina+) e imunofenótipo dito variável quando não foi observada essa coexpressão. Dos 34 casos de CEB analisados, em 19 (56%) o imunofenótipo foi positivo para FAC e em 15 casos (44%) foi considerado imunofenótipo variável.

Especificamente, a análise de expressão dos marcadores FAC de acordo com classificação histológica revelou que houve uma associação estatisticamente significante entre a expressão positiva de α-SMA e FAC imaturos. A α-SMA tem sido descrita como o marcador mais importante para identificar FAC (BELLO et al., 2011; DE WEVER et al., 2008; HINZ et al., 2007) e representa um importante marcador de prognóstico independente em CEB (BELLO et al., 2011; MARSH et

al., 2011; VERED et al., 2010b). Num estudo retrospectivo com 282 pacientes realizado por Marsh et al. (2011), a alta expressão de α-SMA foi preditiva de mortalidade em CEB.

O anticorpo anti-FSP1, também chamada S100A4, é reativo em fibroblastos de diferentes órgãos em remodelação de tecidos e em estroma tumoral (OKADA et al., 2000). Entre todos os marcadores conhecidos, a proteína FSP1 parece oferecer a melhor especificidade para a detecção in vivo de fibroblastos (KALLURI; ZEISBERG, 2006). A expressão aberrante de FSP1 está correlacionada à promoção do crescimento de tumores e metástases (SHERBET, 2009) e já foi demonstrado valor prognóstico signiticativo de FAC caracterizados por FSP1 em câncer colorretal (HERRERA et al., 2013; OSAMU et al., 1997) e carcinoma esofágico (HA et al., 2014). Apesar da escassa utilização desse anticorpo em CEB, foi verificada associação entre FAC positivos para FSP1 adjacentes à células neoplásicas com evidência de TEM em carcinoma de língua (VERED et al., 2010b). No presente trabalho, fibroblastos estromais exibiram positividade a FSP1 em 28 (82,3%) casos, mas não observamos associação entre expressão de FSP1 e os subtipos histológicos de FAC. Sugimoto et al. (2006) utilizando um modelo ortotópico com câncer de mama e de pâncreas, encontrou um subconjunto específico de células FSP1 positivas que não expressaram marcadores clássicos de miofibroblastos, incluindo α-SMA e desmina.

Outros autores estudaram a expressão de FSP1 em macrófagos inflamatórios e se observou que FSP1 identifica uma população única de macrófagos inflamatórios em lesão hepática, fibrose e câncer, que se sobrepõe aos marcadores α-SMA e PDGFRβ nos casos analisados (ÖSTERREICHER et al., 2010). Dos 28 casos que analisamos como positivas para FSP1, 25 (89,3%) foram também positivos para α-SMA e o subgrupo específico FSP1+/α-SMA- foi encontrado em 3 casos (10,7%) dos casos positivos para FSP1, os quais também aparesentavam fenótipo FAC maduro. Esse achado é apenas descritivo e necessita de maior investigação, mas possivelmente corrobora com nosso achado que o fenótipo FAC imaturo dependa da expressão de α-SMA. Já HA et al. (2014) demonstrou que dos cinco marcadores FAC utilizados, a expressão do FSP1 foi mais frequentemente encontrada em CEE com FAC imaturos do que com os maduros.

Tem-se reconhecido que o microambiente tumoral, o qual é composto por vários componentes da MEC, células endoteliais, células inflamatórias e FAC, tem contribuição significativa para a progressão do CEB (GOETZ et al., 2011; LI et al., 2015). Muitas vezes FAC representam a maioria das células do estroma tumoral (XING; SAIDOU; WATABE, 2010), e em geral FAC têm sido demonstrados em cerca de 50% dos CEBs (THODE et al., 2011). Uma proporção significativa de FAC particularmente em fronte de invasão já foi relatado em 73%, 60% e 54% de CEBs estudados por Lewis et al. (2004), Kellermann et al. (2007), Vered et al. (2010), respectivamente. Outros trabalhos mostraram que apesar da presença de FAC associar-se à estágios clinicopatológicos, esses não são constituintes comuns da maioria dos CEBs devido disparidade de expressão de TGF-β entre diferentes amostras de CEB utilizadas (DE-ASSIS et al., 2012; MARSH et al., 2011).

No presente estudo, a presença de FAC detectadas por imunofenotipagem foi de 56% (n=19) dos casos analisados, estando em conformidade com o que relata a maioria dos autores, e não houve associação estatisticamente significante quando comparado imunofenótipo FAC aos parâmetros clínico-patológicos utilizados. Entretanto foi observada uma tendência de associação da presença de FAC estar associada à graduação patológica, uma vez que a maioria dos casos de tumores BD apresentou imunofenótipo de FAC e o padrão PD exibiu com mais frequência imunofenótipo variável. Similarmente, outros autores encontraram um aumento da prevalência de FAC quando a diferenciação tumor aumentava de pobremente diferenciado para bem diferenciado (KELLERMANN et al., 2007; LUKSIC et al., 2015). Em contraste, o fenótipo de FAC foi menos frequente em tumores BD que PD (DE-ASSIS et al., 2012; HA et al., 2014). Mais estudos são necessários para possibilitar a associação entre FAC e graduação patológica em CEB.

Investigações recentes demonstram que a presença de FAC caracterizados por imunoistoquímica no estroma do CEB particularmente em fronte invasivo do tumor têm uma correlação significativa com parâmetros clínico-patológicos. Um

incremento de FAC detectados por α-SMA no estroma de CEB foi

significativamente correlacionado com maior estágio T, presença de metástases regionais ocultas e metástases distantes (LUKSIC et al., 2015) e FAC representou

um fator prognóstico independente para pacientes com CEB através da capacidade de promover o crescimento, proliferação, metástase e até mesmo TEM de células neoplásicas (LI et al., 2015; VERED et al., 2010b).

Previamente, outros resultados mostraram associação entre a presença de FAC e menores taxas de sobrevivência em CEB (BELLO et al., 2011; KAWASHIRI et al., 2009; MARSH et al., 2011; SOBRAL et al., 2011a). Quanto aos parâmetros clínicos, Vered et al. (2010) verificaram maior frequência de tumores com alto escore de miofibroblastos em pacientes com menos de 60 anos. Outros estudos mostraram que não houve diferença significante entre a presença de FAC no estroma de CEB afetando pacientes jovens e idosos (FONSECA et al., 2014).

Outros resultados revelam percentuais imunoistoquímicos importantes de CEB que apresentam escassa quantidade de FAC ou são considerados negativos para estes tipos celulares. No trabalho realizado por Kellermann et al. (2008), 39,48% (n=15) dos CEB foram classificados como negativos para FAC em seus estromas e 47,82% (n=11) dos casos considerados positivos revelaram escassa quantidade destes tipos celulares. Apesar disto, estes autores observaram correlação significativa entre abundante quantidade de miofibroblastos no estroma tumoral e envolvimento linfonodal regional, estadiamento clínico avançado e recorrência regional. Em outro estudo, De-Assis et al. (2012) relataram uma quantidade abundante de FAC em 15 (36,58%) de 41 casos de CEB avaliados, e a maioria dos quais apresentava alto grau histológico de malignidade. Em conjunto, os achados destes estudos revelam que FAC não estão presentes de forma abundante em todos os CEB, mas adicionalmente sugerem o envolvimento de FAC apenas em estágios mais avançados da carcinogênese oral. Portanto, a análise da quantidade desses componentes estromais pode auxiliar na identificação de lesões com comportamento biológico mais agressivo (CARNEIRO LÚCIO et al., 2013; DE-ASSIS et al., 2012; KELLERMANN et al., 2008).

As evidências de que densidade de FAC pode ser útil na previsão do prognóstico de CEB se baseiam no papel que FAC exerce de modificar o microambiente tumoral. Através da produção de fatores de crescimento e quimiocinas na MEC, FAC contribuem para tumorigênese, facilita o crescimento do tumor primário, apoia invasão e metástase das células malignas, e induz a