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3.6.1 Aspectos Gerais sobre Validação de Métodos

Os métodos analíticos desenvolvidos devem originar resultados que sejam confiáveis. Para tanto, torna-se necessário avaliar o método proposto, quanto a sua exatidão e repetibilidade. Dessa forma, assim que desenvolvido um método de análise cromatográfica, é importante fazer a validação do mesmo para avaliar se fornece resultados confiáveis, de forma a poder ser aplicado rotineiramente em diferentes laboratórios. Um processo de validação bem definido e documentado oferece às agências reguladoras evidências objetivas de que os métodos e os sistemas são adequados para o uso desejado (PRESTES et al., 2007).

3.6.2 Parâmetros para Validação

Os parâmetros para validação de métodos têm sido definidos em diferentes grupos de trabalho de organizações nacionais ou internacionais. Infelizmente, algumas definições são diferentes entre as diversas organizações. O que se pode observar é que não há um procedimento normatizado que estabeleça como executar a validação de métodos instrumentais de separação (SILVA, 2012; RIBANI et al., 2004).

Os parâmetros analíticos devem ser baseados na intenção do uso do método e normalmente os mais encontrados para validação de métodos de separação são: seletividade; linearidade e faixa de aplicação; precisão; exatidão; limite de detecção; limite de quantificação e robustez. Estes termos são conhecidos como parâmetros de desempenho analítico, características de desempenho e, algumas vezes, como figuras analíticas de mérito (RIBANI et al., 2004).

3.6.2.1 Linearidade

A linearidade de um método corresponde à capacidade em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito de interesse, dentro de uma determinada faixa de aplicação. A determinação da linearidade pode ser realizada utilizando a relação matemática entre o sinal medido e a concentração do analito de interesse, geralmente obtida por uma equação de reta (y = ax + b), chamada de curva analítica (RIBANI et al., 2004; ARAGÃO; VELOSO; ANDRADE, 2009).

Além dos coeficientes de regressão a e b, calcula-se também o coeficiente de correlação (R) ou o coeficiente de determinação (R2), parâmetros que permitem estimar a qualidade da curva obtida. A ANVISA recomenda um coeficiente de correlação igual a 0,99 e o INMETRO um valor acima de 0,90 (ARAGÃO; VELOSO; ANDRADE, 2009), pois o valor quanto mais próximo de 1,0 considera-se evidência de um ajuste ideal dos dados para a linha de regressão (RIBANI et al., 2004; ARAGÃO; VELOSO; ANDRADE, 2009).

3.6.2.2 Limites de Detecção e de Quantificação

O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância em exame que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental. O LD pode ser calculado de três maneiras diferentes: método visual, método relação sinal-ruído, método baseado em parâmetros da curva analítica (BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004; ARAGÃO; VELOSO; ANDRADE, 2009; SILVA, 2012).

O limite de quantificação (LQ) é a menor concentração da substância analisada que pode ser determinada utilizando um determinado procedimento experimental com um nível aceitável de precisão e exatidão (BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004; ARAGÃO; VELOSO; ANDRADE, 2009; SILVA, 2012). Quando decresce o nível de concentração do LQ, a medição torna-se menos precisa. Se

houver necessidade de maior precisão, uma concentração maior deve ser registrada para o LQ (RIBANI et al., 2004).

3.6.2.3 Precisão

A precisão avalia a dispersão de resultados entre ensaio independentes de uma série de medições repetidas a uma mesma amostra, a amostras semelhantes ou a uma solução padrão, em condições definidas (RIBANI et al., 2004; SILVA, 2012). É normalmente obtida usando o valor do desvio padrão relativo (RSD%

relative standard deviation), também conhecido como coeficiente de variação (CV), e

pode ser avaliada em circunstâncias específicas de medição, como a repetitividade, precisão intermediária, reprodutibilidade (RIBANI et al., 2004; DUTRA; HOFFMANN- RIBANI; RIBANI, 2010; SILVA, 2012).

A repetitividade avalia a dispersão dos resultados de medições sucessivas usando o mesmo método sob as mesmas condições de análise. A precisão intermediária é uma estimativa da precisão do método intralaboratorial, ou seja, dentro de um mesmo laboratório, utilizando as mesmas condições, mas com analistas, equipamentos e dias diferentes. Já a reprodutibilidade avalia a precisão realizada para uma mesma amostra com as mesmas condições de análise, porém em laboratórios diferentes (BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004; LEMOS; SANTOS; SANTOS, 2010; SILVA, 2012).

3.6.2.4 Exatidão

A exatidão de um método permite verificar se os resultados individuais obtidos para uma amostra apresenta concordância com um valor de referência considerado como verdadeiro. A exatidão de um método pode ser avaliada através de ensaios de recuperação e adição de padrão (RIBANI et al., 2004).

4 MATERIAIS E MÉTODOS

O desenvolvimento experimental deste trabalho foi realizado na Central de Análises da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Câmpus Pato Branco e consistiu na realização de análises para a determinação da atividade antioxidante e antimicrobiana, utilizando métodos distintos, em três extratos de coprodutos agroindustriais coletados na região Sudoeste do Paraná (bagaço de uva - BU, engaço de uva – EU) e Oeste de Santa Catarina (bagaço de maçã - BM) e o desenvolvimento e validação de uma metodologia analítica por CLAE-DAD para identificação e quantificação de 12 compostos fenólicos nos três extratos.

O ensaio da atividade antioxidante pelos métodos ORAC e CLAE-FR-ABTS•+

on-line foram realizados no Laboratório de Bioquímica e Análise Instrumental e o

ensaio de estabilidade oxidativa pelo método Rancimat, foi realizado no Laboratório de Óleos e Gorduras. Ambos Situados no Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição (LAN) da ESALQ/USP, em Piracicaba.

A sequência utilizada para realização das análises cromatográficas e as análises de caracterização química e atividade biológica dos extratos dos coprodutos agroindustriais (BU, EU e BM), estão representados no fluxograma (Figura 10).

Figura 10 – Fluxograma das atividades de determinação de compostos bioativos provenientes de subrodutos agroindustriais.