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Texte intégral

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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Ghysdael, J. (1979). Etude et caractérisation des produits de traduction du génome des virus de la myéloblastose aviaire et de la leucose bovine enzootique (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Département de Biologie moléculaire Laboratoire de Chimie Biologique

ÉTUDE ET CARACTÉRISATION DES PRODUITS DE TRADUCTION DU GÉNOME DES VIRUS

DE LA MYELOBLASTOSE AVIAIRE ET DE LA LEUCOSE BOVirJÉ ENZOOTIQUE

Mémoire présenté pour l’obtention du grade de

Docteur en Sciences Chimiques

Année Académique 1978-1979 Jacques GHYSDAEL

(3)

2. ■

SfBLIOTHÈQUE DE

^ A

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Département de Biologie molécuiaire Laboratoire de Chimie Biologique

ÉTUDE ET CARACTÉRISATION DES PRODUITS DE TRADUCTION DU GÉNOME DES VIRUS

DE LA MYELOBLASTOSE AVIAIRE ET DE LA LEUCOSE BOVINE ENZOOTIQUE

Mémoire présenté pour l’obtention du grade de

Docteur en Sciences Chimiques Jacques GHYSDAEL

Année Académique 1978-1979

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des plantes supérieures sont conservés sous forme de mRNA "masqués" et contiennent une information génétique spécificpie de la germination.

(5)

A. Ghysen - Thèse annexe.

Il serait possible d’obtenir, sous forme pure, un site de régulation négative (opérateur) et un site de régulation positive par unr technique simple:

1'autohybridâtion.

(6)

Je tiens à exprimer à Monsieior le Professe-ur GHANTRENNE ma profonde reconnaissance pour l'accueil qu'il m'a réservé dans son laboratoire et l'intérêt qu'il a manifesté aux évolutions de ce tra­

vail .

Je remercie vivement Messieurs Arsène BURNY, Gérard MARBAIX et Georges HUEZ qui ont guidé, chaque jour, la progression de ce tra­

vail. Tous ceux qui ont eu la chance de les connaître savent leur serviabilité et leur disponibilité constante. Leur aide précieuse m'a permis d'éviter bien des écueils.

Que le Docteur C. MOSCOVICI (Tumor Virology Lab., V.A.

Hospital, Gainesville, Pla., U.S.A.) et G. MOSCOVICI trouvent ici l'expression de ma gratitude pour leur accueil inoubliable au sein de leur laboratoire.

Je suis reconnaissant à tous ceux qui, par leur aide directe et leurs conseils, ont permis de mener à bien de nombreuses expériences.

Je pense tout particulièrement au Professeur D. DEKEGEL (institut Pasteur du Brabant), au Docteur M. MAMMERICKX (institut National Vété­

rinaire), P. BEX, Y. CLEUTER, R. KETTMANN, M. LECLERCQ, R. LEGA3 et D. PORTETELLE.

Enfin, je remercie l'Institut pour 1'Encouragement de la Recherche Scientifique dans l'Industrie et l'Agriculture (l.R.S.I.A.) et le Ponds cancérologique de la Caisse Générale d'Epargne et de

(7)

Retraite pour l'aide financière qu'ils m'ont accordé et le Ponds National de la Recherche Scientifique (P.N.R.S.) pour l'octroi d'-une bourse qui m'a permis un séjour de trois mois aux U.S.A., dans un laboratoire spécialisé.

*

(8)

INTRODUCTION G-ENERALE 3

I. Morphologie des oncovirus à RNA 4

II. Structure physique et génétique du génome viral 6 III. Réplication des oncovirus à RNA exogènes 11

1 . Synthèse et intégration du DNA proviral 1 l 2. Transcription du DNA proviral intégré 14 3. Traduction de l'information virale intégrée 16

IV. Le gène "ONG" 25

1. Les virus de sarcome 26

2. Les virus de leucémie 29

V. Antigènes de surface induits par les oncovirus à RNA 32 VI. Origine et transmission des oncovirus à RNA 34

VII. Objet et but du travail. . 37

RESULTATS EXPERIMENTAUX ET DISCUSSIONS 33

1 ère Partie : Traduction du RNA du virus de la myéloblastose aviaire standard dans les systèmes de synthèse protéique hété­

rologues 39

I. Bref aperçu de la transformation leucémique induite

par le virus de la myéloblastose aviaire 39

II. Matériels et méthodes 40

III. Résultats expérimentaux 45

1. Distribution des séquences virales dans les

myéloblastes. de poussins leucémiques 45

(9)

51 2. Traduction du RNA du virus de la myéloblastose

aviaire standard

3. Le génome viral porte 1'information qui correspond à l'activité enzymatique impliquée dans le clivage

complet de Pr 76 59

IV. Discussion générale 64

2ème Partie : Structure génétique du RNA du virus de la

leucémie bovine 69

I. La maladie et son agent 69

II. But du travail 75

III. Matériels et méthodes 76

IV. Résultats expérimentaux 79

1. Les protéines du virus de la leucémie bovine 79 2. Polypeptides précurseurs des protéines structurales

du virus de la leucémie bovine 87

3. Traduction des RNA virioniques du virus de la leucémie bovine dans les systèmes de synthèse protéique hétéro­

logues 92

V. Discussion générale I4I

CONCLUSIONS GENERALES 148

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 153

(10)

AVANT - PROPOS

Dès 1908, ELLERÎVIAN et BA.NG- démontraient que des extraits de cellules leucémiques filtrés de façon à éliminer les bactéries trans­

mettent la leucémie du poulet. La leucémie n'étant pas considérée, à l'époque, comme une forme de cancer, leur découverte n'eut pas

l'impact qui suivi la démonstration, trois ans plus tard, par P. R0U3, qu'un extrait filtré d'un sarcome "spontané" du poulet était capable de bransmettre la maladie. Malgré la confirmation de ces résultats par d'autres laboratoires, le monde scientifique et médical de l'épo­

que ne les prit pas en considération.

Pendant les décades suivantes, de nouveaux virus furent isolés et les maladies qu'ils induisent, caractérisées. Ainsi, en 1936,

BITTNER démontrait qu'un facteur du lait présent chez certaines sou­

ches de souris transmettait le carcinome mammaire de la souris.

BITTNER, en 1942 et, plus tard, ANDERVONT et BRYAN (1944) démontraient que cet agent était vin virus. D'autre part, l'établissement de lignées consanguines chez la souris permit l'identification de nombreuses

souches de virus de leucémie et de sarcome chez la souris (revu par

&R0SS, 1970).

Depuis ces premiers travaux, de nombreux autres virus impli­

qués dans diverses formes de cancers (leucémies, sarcomes, carcinomes) ont été mis en évidence dans de nombreuses autres espèces animales (chats, rats, hamsters, bovidés, reptiles, primates...). Tous ces virus ont vine structure morphologique semblable (sphère de 80-120 nm de diamètre) et leur matériel génétique, localisé dans un nucléoïde central, est une molécule de RNA (CRAWPORD, 1961).

(11)

2

L'étude de la biologie de ces virus oncogènes à RNA (appelés également oncornavirus, oncovirus à RNA, rétrovirus... . ) prit son essor par la mise en évidence, au début de 1970, d'une DNA polymérase RNA dépendante dans les particules virales extracellulaires (MIZUTANI et al., 1970; BALTIMORE, 1970). Depuis cette époque, de nombreux

groupes se sont attachés à élucider les différentes étapes du cycle d'infection des oncovirus à RNA et les mécanismes molécvilaires im­

pliqués dans leurs propriétés oncogènes.

Dans le Chapitre Introductif de ce mémoire, nous avons tenté de résumer les connaissances acquises dans ces domaines sans négliger de mentionner les questions qui restent encore obscures.

*

(12)

INTRODUCTION G-ENERALE

(13)

4

I. MORPHOLOGIE DES ONCOVIRUS A RNA

Depuis les premières études par microscopie électronique (D. SHARP et al., 1952; W. BERNHARDT, 1958) qui décrivaient les par­

ticules des oncovirus comme des particules sphériques d'environ 100 nm de diamètre, de très nombreux autres travaux ont précisé les observa­

tions originales et ont amené au modèle représenté dans le schéma 1 (D. BOLOGNESI et al., 1978).

Les différentes sous-structures de ces particules sont les suivantes (oncovirus aviaires) :

- le complexe ribonucléoprotéique (RNP) ou nucléoxde formé par l'association du RNA viral, de plusieurs milliers de molécules d'ime phosphoprotéine de poids moléculaire 12.000 (pp12) et de plusieurs molécules de transcriptase inverse (p91 et p64),

- une membrane entourant ce complexe ribonucléoprotéique, formée de sous-unités arrangées hexagonalement et composée de plusieurs milliers de molécules d'une protéine de poids moléculaire 2J.000

(p27)- L'ensemble de ces deux sous-structures forme le noyau de la particule virale. Une protéine de poids moléculaire 15-000

(pi 5) est également associée au noyau mais sans localisation pré­

cise ,

- une membrane entourant le noyau et formée de plusieurs milliers d'exemplaires d'une phosphoprotéine de poids moléculaire 19.000

(pp19). Un très faible pourcentage des pp19 de la particule virale semble également associé au RNA viral (SEN et al., 1977),

- une enveloppe externe formée d'\me double couche lipidique déri­

vée de la cellule productrice et de protubérances formées par l'association, par ponts disulfures, d'environ ■un millier de molécules de deux glycoprotéines de poids moléculaire 55-000

(gp35) et 85.000 (gp85).

(14)

Les oncovirus d'oiseau.x sont donc constitués, outre le génome viral et la transcriptase inverse, de 4 protéines internes appelées p27» pi 9» pi 5 et pi 2 et de deux glycoprotéines d'enveloppe dénommées gp85 eb gp35-

Le modèle représenté dans le schéma 1 est essentiellement va­

lable pour les oncovirus de mammifères mais dans ce cas, le poids moléculaire des différents constituants est \m peu différent : p30, p12, p15(C), plO et gp70, p15(e).

Enveloppe externe:

Protubérances (gp85etgp35)

Enveloppe interne Enveloppe du nucléoïde

Nucléoï de

Schéma 1 - Représentâtion schématique de la structure des particules d'un oncovirus aviaire (d'après BOLOG-NESI et al., 1978).

(15)

6

II. STRUCTURE THISIQUE ST GENETIQUE DU GENOME VIRAL

Le composant majeur des RNA extraits par les méthodes classi­

ques de préparation purifiées d'oncovirus sédiments en gradients de saccharose avec une constante de sédimentation de 60 à 70 3 (ROBINSON et al., 1965). Traité par différents agents dénaturants (chaleur, formamide...) le RNA 60-70 S se dissocie en sous-imités de constante de sédimentation 30-40 3 (DUESBERG, 1968).

L'analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide de ces sous-unités permet d'estimer plus précisément leur taille et montre qu'elles ont \in poids moléculaire variable pour différents groupes d'oncovirus : 3*3 x 10 pour les virus de sarcome aviaires,2.8-3 x 10^

6 6

pour les virus de leucémie aviaires et murins non défectifs et 1 .6- g

2.5 X 10 pour lesvirus de sarcome ou leucémie défectifs dont une plus ou moins grande partie du génome est délétée (revu par VOGT, 1977) .

Les sous-unités 30-40 S ont les caractéristiques générales des mRNA: elles possèdent une séquence polyadénylique d'environ 200 nucléotides à leur extrémité 3' terminale (RHO et al., 1974) et \me structure communément dénommée "CAP" à leur extrémité 5’ terminale, structure dans laquelle une 7 méthylguanosine est reliée par \in lien

, 7 5'

5'-5' triphosphate à im second nucléoside 2'-0-méthylé (m G ppp Nm Np...; KEITH et al., 1975» ROSE et al., 1976). Elles peuvent d'ail­

leurs servir de messagers dans différents systèmes de synthèse pro­

téique hétérologues (voir section III.3).

L'analyse du rendement molaire et de la composition des grands oligonucléotides obtenus par digestion du RNA viral par la ribonu­

cléase Tl a permis de montrer que la complexité génétique du génome des oncoviras était identique à la longueur de la sous-unité 30-40 3

(BILLETER et al., 1974! BEEMON et al., 1976). Ce génome est donc

(16)

polyploïde. Des études récentes par microscopie électronique suggè­

rent une stracture diploïde, les deux sous-unités étant appariées à leur extrémité 5' par une structure en Y appelée "dimer linkage structure" (Schéma 2A.; KUNGr et al., 1 976; DUBE et al., 1976).

Structure génétique du virus de sarcome de Rous

Le virus de sarcome de Rous a été mis en évidence en 1911 par P. ROUS à partir d'vin sarcome spontané du poulet. Depuis lors de nombreuses autres souches de ce virus ont été isolées et toutes in­

duisent des sarcomes quand elles sont inoculées à de jeunes poulets susceptibles et transforment des fibroblastes d'embryons de poulets mis en culture (revu par TOOZS, 1973). Cette propriété permet de doser l'activité transformante de ce virus dans différentes prépara­

tions et, dans le cas d'infections solitaires, de le cloner. Les

particules virales obtenues après clonage sont infectieuses eb trans- f ormantes "in vivo" et "in vitro" ce que l'on exprime en disant que le virus du sarcome de Rous est un viirus transformant "helper" indé­

pendant ou non défectif pour la réplication et la transformation.

Cet exemple d'un virus de sarcome non défectif pour sa répli­

cation est xme particularité des virus d'oiseaux. Les virus de sar­

come de mammifères connus (virus de sarcome murins et félins) sont défectifs pour leur réplication c'est-à-dire que,"une fois clonés, ils sont non infectieux: ils transforment les fibroblastes mais ne s'y répliquent pas. La cellule est dite non productrice (NP). La surinfec­

tion par un virus non sarcomatogène (virus "helper") permet de "récu­

pérer" un virus sarcomatogène sous la forme d'un pseudotype c'est-à- dire d'une particule qui est un mélange phénotypique du génome "sar­

come" et des protéines non défectives du virus surinfectant.

L'existence d'un test de transformation "in vitro" d'une part et le caractère non défectif de sa réplication ont fait du virus de sarcome de Rous un cas particulièrement favorable à son étude génétique.

(17)

8

O V O

GAG

I I I I I I

0 1 2 3 4 5

ENV

---L

SRC C R

Nucléotides «10* -3

I I I

8 9 10 '

Schéma 2 - A. Représentâtion de la structure du génome diploïde des

oncovirus observée par microscopie électronique : deux sous- unités 30-40 S identiques sont appariées à proximité de leur extrémité 5' par l'intermédiaire d'un structure de nature mal connue ("dimer linkage structure").

B. Représentât ion de la structure génétique d'une sous--unité du génome des virus de sarcome aviaires (ASV).

segment polyadénylique localisé à l'extrémité 3' de la molécule.

■ chapeau ("cap") localisé à l'extrémité 5' de la molécule.

R segment de 21 nucléotides réitérés aux deux extrémités de la molécule.

0 séquence d'environ 1000 nucléotides commune à toutes les souches d'oncovirus aviaires.

G-AG-, POL, ENV, SRC ; gènes spécifiant la synthèse respecti­

vement des protéines de structure internes, de la trans­

criptase inverse, des glycoprotéines d'enveloppe et de la (des) protéine(s) responsable(s) de la transformation.

(18)

En effet, il a été possible, dans plusieurs laboratoires, d'isoler de nombreux mutants - mutants par délétion ou mutants thermosensibles - et de définir les grandes fonctions biologiques de ce virus (revu par VOG-T, 1977). De ces nombreuses études, il ressort que le génome des ASV (Avian Sarcoma Virus), d'-une longueur d ' environ 10.000 nucléo­

tides contient au moins 4 éléments génétiques dénommés "GAG", "EEV",

"POL" et "SRC" qui spécifient respectivement la séquence en acides aminés des protéines de structure internes, les glycoprotéines d'enve­

loppe, la DNA polymérase-RNA dépendante (transcriptase inverse) et la (ou les) protéines responsables de la série complexe d'évènements amenant à la transformation de la cellule. Les détails de la bio­

synthèse des protéines dont 1'information est contenue dans ces dif­

férents gènes seront envisagés dans la section III.3.

La carte génétique des virus de sarcome aviaire a été établie par analyse des oligonucléotides obtenus après digestion du RNA viral à la ribonucléase Tl. La position de chaque grand oligonucléotide Tl a été déterminée par rapport au poly(A)de la molécule de RNA par analyse comparative de fragments du génome viral sélectionnés par la présence d'un po ly(A)d 'une part (chromatographie sur oligo (dT)-cellulose ) et par leur taille d'autre part (sédimentation en gradients de saccha­

rose ) .

La comparaison des cartes ainsi obtenues d'ASV non défectifs, de mu­

tants complètement ou partiellement délétés dans l'un des 4 gènes ou de recombinants a permis d'établir que l'ordre des gènes dans le génome viral est 5'- GAG - POL - ENV - SRC - C - poly(A) -3' (schéma 2B; VOGT et al., 1977), où C (= constant) est une région hétéropoly- mérique dont la séquence est très conservée chez tous les oncovirus aviaires.

Les virus de leucose (ALV : Avian Leucosis Virus) et les va­

riants td des ASV (mutants défectifs pour la transforrnation) possè­

dent la même séquence de gènes excepté que le gène "SRC" est totale­

ment ou partiellement délété. Le même genre de techniques appliquées

(19)

1 0

à la souche de Moloney du virus de la leucémie de la souris suggèrent Tin ordre similaire des différents gènes dans le génome de ce virus

(PARKS et al., ^9l6). On considère maintenant généralement que les virus non défectifs ont la séquence de gènes décrite dans le schéma 2 où "ONG" est le nom générique des gènes de transformation ("SRC" chez les virus de sarcome, "LUK" chez les virus de leucémie, "CARC" chez les virus de carcinomes).

Outre le génome viral, d'autres RNA d'origine cellulaire sont incorporés dans les particules virales. Certains RNA ne sont pas

associés au RNA viral. C'est le cas des RNA ribosomiaux 28S, 183, 53 et de la majorité des RNA 4S. Ces RNA 4S ont les propriétés de struc­

ture (PARA3 et al., 1973) et l'activité acceptrice d'acides aminés caractéristique des tRNA (ERICZ30N et al., 1970).

D'autres séquences ribonucléiques, dont certaines peuvent être mes­

sagères (voir 2ème partie des "Résultats"), sont associées au

RNA 60-70 S. Un des tRNA associés au 60-70 3 a une fonction particu­

lièrement importante ; il sert d'amorce lors de la transcription in­

verse du génome viral (VERMA, 197l). De tRNA servant d'amorce n'est pas quelconque; il s'agit toujours d'-un tRNA chez les viTRP 3rus aviai- res (HARADA et al., 1975) et d'un tRNA chez les virus murins PRO

(dAHLBERG- et al., 1975).

Le tRNA amorce est associé par liaisons hydrogènes à lone séquence proche de l'extrémité 5' de la molécule de RNA 30-40 3 s'étendant du résidu 103 à 118 du génome des A3V (HA3ELTINE et al., 1977). Le tRNA est fixé au RNA viral par son extrémité 3' terminale (branche accep­

trice) par une séquence de 16 nucléotides adjacentes à l'avant der­

nière base (CORDELL et al., 1976). Le tRNA amorce interagit forte­

ment avec la transcriptase inverse (PANET et al., 1975).

(20)

L ' inf ect ion d'xme cellule par un oncovirus n'iniiibe pas les fonctions cellulaires normales et ne provoque pas la lyse de la cel­

lule. La synthèse des RNA viraux et des protéines virales ne repré­

sente qu'une très faible partie des synthèses cellulaires totales.

La détection des macromolécules virales dans la cellule infectée re­

quiert donc l'utilisation de techniques très sensibles d'analyse qui seront détaillées ultérieurement. Un schéma général de l'infection d'une cellule par un oncovirus à RNA est représenté dans le Schéma 3.

Les différentes étapes du cycle d'infection sont résumées dans ce qui suit.

III.1. Synthèse et intégration du DNA proviral

Après pénétration de la particiile virale dans la cellule par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques, le RNA viral est libéré dans le cytoplasme de la cellule, associé à la transcriptase inverse.

L'enzyme transcrit le RNA (+) viral en un DNA monocaténaire complé­

mentaire (DNA (-)). Cette synthèse démarre sur une amorce tRNA située à 100-150 nucléotides de l'extrémité 5' du génome viral (TAYLOR et al., 1975). Comme 1'allongement de la chaîne polynucléotidique se fait de 5'---» 3' (SMOLER et al., 1971 ), la polymérase atteint rapide­

ment l'extrémité 5' du génome (le fragment de cDNA ainsi formé est appelé "strong stop c.DNA"). Il faut bien admettre que, pour obtenir une copie complète du RNA viral, la chaîne polydeoxyribonucléique en voie de synthèse passe de l'extrémité 5' à l'extrémité 3' du génome

(JUNGHANS et al., 1977).

(1) Il existe dans le DNA de la plupart des espèces animales des sé-_

quences correspondant à des oncovirus à RNA endogènes. Les modalités d'expression de ces oncovirus endogènes sont différentes de celles décrites dans ce chapitre; elles seront envisagées ultérieurement.

(21)

Schéma 3A - Etapes de l'infection cellulaire par un oncovirus exogène:

synthèse du DNA proviral (explications détaillées dans le texte).

_______, RNA ( + );---, DNA (-); ---, DNA ( + )

1 Adsorption et pénétration de la particule virale.

2 Démarrage de la transcription du RNA viral (+) en DNA (-) par la transcriptase inverse. Un tRNA, associé au RNA viral, est utilisé comme amorce. La séquence redondante

terminale (abc) est transcrite (a'b'c').

5 Continuation de la synthèse du DNA proviral après apparie­

ment de a'b'c' à la séquence complémentaire 3', abc.

4 Synthèse discontinue du DNA (+) complémentaire au DNA (-) et circularisation.

5 - 6 Formation du DNA proviral double-brin, circulaire et fermé ; translocation dans le noyau et intégration dans le DNA cellulaire.

: 3 '-poly ( a) , a : 5 '-CAP, Y • "t^^anscriptase inverse, n;tRNA amorce.

(22)
(23)

13

Ce modèle a acquis énormément de consistance depuis qu'on a établi l'existence d'une séquence de nucléotides identiques et de même

orientation aux deux extrémités du génome. Cette redondance terminale du RNA viral, d'abord démontrée chez le virus de sarcome de Rous

(HASELTINE et al., 1977; SCHWARTZ et al., 1977) a été observée égale­

ment chez les virus de leucémie aviaires (STOLl et al., 1977) et murins (COPPIN et al., 197S). Elle permet d'imaginer que le "strong stop cDNA" forme hybride avec la séquence redondante complémen­

taire située à l'extrémité 3' de la molécule de RNA et permet ainsi à la polymérase de continuer la transcription du génome viral.

Le brin RNA de l'hybride RNA.DNA ainsi formé serait alors dégradé, vraisemblablement par l'activité RNase H associée à la transcriptase inverse, et une fibre DNA (+) est synthétisée sur la fibre DNA (-) selon un mécanisme discontinu (revu par WEINBERG, 1977).

L'ensemble de ces évènements se déroule dans le cytoplasme de la cellule infectée de 0 à 6 heures après l'infection (VARMUS et al., 1974) et dépend, outre de l'existence d'une transcriptase inverse fonctionnelle, de facteur(s) cellulaire(s) mal connus (VARMUS et al., 1977). La forme provirale libre détectée dans le noyau environ 9 heures après l'infection est une molécule de DNA en double brin, cir­

culaire et fermée. Cette molécule a une taille de 5•5 x 10^ daltons et représente donc une copie du génome viral; elle est infectieuse dans les expériences de transfection (GUNTAKA et al., 1976; GIANNI et al., 1976). On pense généralement (WEINBERG, 1977) que cette forme est le précurseur immédiat de la forme provirale intégrée dans le génome cellulaire.

Bien que le fait qu'il y ait intégration soit expérimentalement établi depuis plusieurs années (VARMUS et al., 1973; HILL et al., 1974), le mécanisme de ce phénomène est toujours hypothétique.

L'intégration ne semble se faire que dans les molécules de DNA en voie de réplication (VARMUS et al., 1977) et le fait que seule une

(24)

partie du DNA proviral soit intégrée dans le DNA cellulaire (KHOURY et al., 1976; KESHET et al., 1978) suggère que 1'intégrâtion se fait en un nombre de sites limités par l'intermédiaire de séquences spé­

cifiques (STOLL et al,, 1977)* Des études actuellement en cours dans différents laboratoires combinant les techniques de découpage du DNA cellulaire par les nucléases de restriction respectant le DNA provi­

ral et la caractérisation (par d'autres nucléases de restriction et/ou par détermination de séquences) des séquences cellulaires adjacentes au DNA proviral permettront de répondre définitivement à ces questions.

Une fois intégré, le provirus, soumis aux régulations cellu­

laires, se réplique avec le DNA cellulaire et permet la transmission de l'information génétique virale dans la descendance de la cellule

infectée.

III. 2 . Transcription du DNA -proviral intégré

Le mécanisme de la transcription du DNA proviral intégré est similaire à celui de la transcription des mRNA cellulaires.

Le démarrage de la transcription dépend de l'intégration du DNA pro­

viral dans le génome cellulaire (HUMPHRIES, 1972). A l'état de régime, les RNA viraux ne représentent que 0.5 - 2 ‘fo des RNA totaux de la cellule infectée et leur détection nécessite la mise en oeuvre de techniques très sensibles. La méthode la plus utilisée est l'hybrida­

tion moléculaire des RNA extraits de la cellule avec ime copie DNA (^H) faite "in vitro" sur le génome viral par la transcriptase inverse (revu par VERMA, 1977).

Les RNA viraux intracellulaires sont de même polarité que le génome viral (COPEIN et al., 1972) et possèdent un poly(A) à leur extrémité 3' et un "CAP" à leur extrémité 5' (WEISS et al., 1977).

Ils semblent être répartis en 2 compartiments métaboliques indépen­

dants , l'un destiné à la production de mRNA, l'autre à l'exportation dans les particules virales en voie de formation (LEVIN et al., 1976).

(25)

15

Les RNA viraux isolés à partir des polysomes de cellules in­

fectées peuvent être divisés, selon leur taille, en 3 classes discrè­

tes : les RNA associés aux polysomes libres ont une taille correspon­

dant à celle du génome viral tandis que ceux associés aux polysomes liés aux membranes ont une taille de 22-28 3 et 14-20 S (PAN et al.,

1973; GIELKBNS et al., 1974; HAYWARD, 1977). Dans le cas de cellules infectées par le virus du sarcome de Rous, le contenu génétique de chacune des classes de RNA cytoplasmique a été caractérisé (WEISS et al., 1977). Le mRNA 38 S contient les 4 gènes viraux "GAG- - POL - EN7 - SRC", le mRNA 28 S contient les gènes "ENV - SRC" tandis que le mRNA 21 S ne contient que le gène "SRC". Le mRNA 38 S est celui qui est engagé dans la synthèse des protéines codées par "GAG" et

"POL", le mRNA 28 S est engagé dans la synthèse des protéines d'enve­

loppe et le mRNA 21 S dans la synthèse du produit de traduction du gène 'SRC" (voir Section III.3). La régulation de l'expression des différents gènes s'effectue donc essentiellement au niveau de la trans­

cription .

Les deux espèces subgénomiques possèdent des séquences nucléo­

tidiques au moins partiellement homologues à celles trouvées à l'ex­

trémité 5' du génome viral (MELLON et al., 1977). Une liaison cova­

lente entre produits de transcription non adjacents du génome ("spli- cing") a également été observée pour le mRNA 21 S extrait de cellules infectées par un virus de leucémie murine (ROTHENBERG et al., 1977).

Les résultats expérimentaux connus actuellement suggèrent que les messagers subgénomiques sont formés par clivage endonucléolytique d'un produit de transcription primaire suivi de diverses étapes de maturation ("splicing", "capping", polyadénylation) plutôt que par transcription de séquences de DNA discontinues dans le provirus

intégré ou par transcription de provinus subgénomiques. En effet, des

(26)

expériences récentes montrent que le inRNA des glycoprotéines d'enve­

loppe des oncovirus d'oisea-ux peut être activé par clivage endonucléo lytique du RNA virionique quand celui-ci est injecté dans le noyau cellulaire (STACET et al., 1978). En accord avec cette hypothèse, PAN (1977) a montré que le produit initial de la transcription est un RNA de constante de aédimentation '58 S, identique en taille au génome viral. L'enzyme impliqué dans la transcription semble être une RNA polymérase II (RYMO et al., 1974).

II1.3. Traduction de 1'information virale intégrée

Contrairement à ce que l'on observe dans le cycle réplicatif de la plupart des virus à RNA animaux:, l'infection d'une cellule par les oncovirus à RNA n'inhibe pas les synthèses protéiques cellulaires La mise en évidence des polypeptides viraux requiert donc le déve­

loppement de techniques spécifiques de détection. Les méthodes les plus utilisées sont basées sur l'emploi d'antisera spécifiques prépa­

rés contre des particules virales solubilisées (antisera polyvalents) contre les différentes protéines virales purifiées (antisera monospé­

cifiques) ou contre des tumeurs induites chez des hôtes hétérologues (par exemple, tumeurs induites chez les mammifères par les virus de sarcome aviaires), dans diverses techniques immunologiques (fixation du complément, radioimmunoprécipitations, radioimmunoessais) de sen­

sibilité et de potentialité différentes. Ces techniques seront décri­

tes dans "Matériels et Méthodes".

A. Le_gène_"GAG"

Ce gène contient 1 ' inf ormation génétique qui correspond a\ix protéines possédant des sites antigéniques communs à tous les onco­

virus d'une même espèce (ou groupe; GAG = group antigens). Ainsi, la majorité des déterminants antigéniques communs à tous les virus de

(27)

17

leucose et sarcome d'oiseaux ou à tous les virus de leucose et sar­

come de souris sont localisés dans ces protéines. Elles sont au nom­

bre de 4 et sont localisées à l'intérieur de la particule virale.

Chez les viras aviaires, elles sont dénommées p27, p19, p15» pi 2 et chez les viras murins p30, pi 5» p12, plO (où "p" signifie "protein"

et le nombre le suivant représente le poids moléculaire x 10 déter­

miné par filtration moléculaire en présence de chlorhydrate de guani­

dine (AUG-UST et al., 1974)). Leur localisation, dans la particule virale, a été décrite dans la Section I.

Ces protéines sont synthétisées dans la cellule infectée sous forme d'un précurseur de haut poids moléculaire (polyprotéine) qui est ensuite clivé par un ensemble de processus protéolytiques comple­

xes en protéines "G-AG" individuelles qui forment le virion. Chez tous les oncovirus à RNA étudiés jusqu'à présent les protéines "GAG" sont synthétisées par l'intermédiaire d'une polyprotéine. Cela a été

démontré chez les virus aviaires (VOGT et al., 1973), murins (SHAPIRO et al., 1976; VAN ZAANE et al., 1976; ARCEMENT et al., 1976), bovins

(GHYSDAEL et al., 1977) et félins (OZASINSKY et al., 1977).

Dans les cellules infectées par les virus aviaires, cette polyprotéine a \m poids moléculaire de 76 000 (Pr 76). Par des expériences de mar­

quage selon la technique de "pulse-chase" et par analyses des pepti­

des trypsiques des précurseurs intermédiaires et des produits finals, un schéma complet du clivage a été proposé. Le traitement des cellu­

les infectées par la pactamycine suivi de marquages courts à diffé­

rents moments après le traitement a permis de déterminer que les pro­

téines "GAG" étaient ordonnées sur Pr 76 selon la séquence H^N-pl9- p12-p27-p15-COOH (VOGT et al., 1975).

Ces travaux montrent aussi que le clivage de Pr 76 n'a lieu qu'à par­

tir de molécules complétées car pi 5, localisée à l'extrémité CO^H du précurseur est la première à être clivée.

Deux polyprotéines ont été détectées dans les cellules infectées

(28)

par la souche Rauscher du virus de la leucémie de la souris : un com­

posant majeur de poids moléculaire 65 000 (Pr 65) et composant mi­

neur de poids moléculaire 75 000 (Pr 75). Aucune relation précurseur- produit n'a pu être mise en évidence entre ces deux polypeptides par des expériences cinétiques de "pulse-chase". Cependant, la présence, lors d'un "puise" d'un analogue de l'arginine, la canavanine, permet la détection de polyprotéines nouvelles, de poids moléculaire plus élevé (70-80 000; SHAPIRO et al., 1976; ARCEMENT et al., 1976;

VAN ZAANE, 1976) ce qui suggère que Pr 65 ne serait pas le produit primaire de traduction mais dériverait d'un précurseur plus grand, clivé extrêmement rapidement - peut-être même au niveau des polysomes.

Des polypeptides de poids moléculaire 250 000 et 350 000 contenant les déterminants antigéniques de "GAG-", "ENV" et "POL" ont été dé­

crits dans ce système par certains groupes (SHAPIRO et al., 1976;

ARCEMENT et al., 1976). Il ne semble pas que ces énormes polypeptides soient les précurseurs des protéines "GAG" mais leur fonction dans l'infection reste inconnue. La séquence des protéines "GAG" des virus de souris a été ordonnée sur Pr 65 dans le sens H^N-pl5-p30-p12-p1O-COOH

(BARBACID et al., 1976).

Le RNA 30-40 S du virus de sarcome de Rous est traduit dans le sys­

tème acellulaire de cellules de tumeur d'ascites en un polypeptide de poids moléculaire 75 000 - 80 000 possédant des déterminants antigè­

niques et des peptides trypsiques en commun avec les protéines "GAG"

du virion (VON DER HELM, 1975; PAWSON et al., 1976) et probablement identique au Pr 76 observé dans la cellule infectée. Cette protéine est également synthétisée dans les oocytes de X. laevis injectés avec le RNA 30-40 S du virus de la myéloblastose aviaire et, dans ce sys­

tème, le précurseur est fonctionnel et clivé complètement et

(29)

1977). Le RNA d' correc'tenien't en pro"béine "G-AG" (GHY3DABL ei: al., 1977) • Le RNA d'un viras infectant peut aussi servir de RNA. messager immédiatement après l'infection (GALLIS et al., 1976); la signification de cette syn­

thèse précoce est inconnue.

Le RNA viral des oncovirus murins a également été traduit "in vitro"

en précurseur des protéines "GAG" (KBRR et al., 1976; SALDEN et al., 1976; PHILIPSON et al., 1978).

Dans la cellule infectée, les protéines "GAG" sont synthéti­

sées sur \m mRNA messager indiscernable du RNA génomique extrait de virions (PAWSON et al., 1977; MUELLER-LANTZCH et al., 1976).

Le (les) enzyme(s) impliqué(s) dans le clivage des précur­

seurs des protéines "GAG" commencent à être caractérisées. Cet aspect de la biologie des oncovirus sera discutée"in extenso"dans le chapitre

"Résultats".

B. Le gène "POL^

Ce gène contient 1 ' inforrnation génétique qui correspond à la DNA polymérase RNA-dépendante (transcriptase inverse) caractéristique des oncovirus. Cette enzyme possède deux fonctions catalytiques bien

caractérisées: une activité DNA polymérase sur des modèles RNA et DNA en présence d'une amorce adéquate (qui est un tRNA dans les virions, voir section II) et xme activité RNase H qui est une acbivité proces­

sive capable d'hydrolyser spécifiquement le brin RNA d'im hybride RNA.DNA. Les deux activités enzymatiques sont associées au même poly­

peptide mais ont des sites fonctionnels différents (revu par VERMA, 1977).

La polymérase purifiée à partir des virus aviaires est formée de de-ux sous-unités, appelées «< (poids moléculaire 65 OOO) et (poids moléculaire 95 OOO) (KACIAN et al., 1971 ). Les deux sous—unités pos­

sèdent des peptides en commun (GIBSON et al., 1 974) et peut être

(30)

produite par traitement ménagé de

/J

à la chymotrypsine; \m traitement prolongé de la sous-unité •< la clive en deux polypeptides dont l'im possède l'activité RNase H (lAI et al., 1978).

La transcriptase inverse purifiée à partir des virions d'oncovirus de mammifères a un poids moléculaire de 70 000-85 000 (VBRMA, 1977)*

L'isolement de mutants thermosensibles pour l'activité ou la synthèse de la polymérase et de mutants par délétion indiquent que cette enzyme est codée par le génome viral (revu par VOGT, 1978).

Dans la cellule infectée marquée à temps court par les acides aminés radioactifs, les déterminants antigéniques et les peptides trypsiques de la polymérase sont toujours associés à ceux des protéi­

nes "GAG" sous forme d'une polyprotéine géante de poids moléculaire 180 000 chez les vi2rus aviaires ( Pr 180*'^"^*^“^*^^; ' OPPERMAN et al., 1977) et 200 000 chez les virus murins ( Pr 200^^^~^*^^; JAMJOOM et al., 1977).

Cette polyprotéine est détectée dans les systèmes de synthèse protéi­

que acellulairesprogrammés par le RNA 50-40 S viral (PATERSON, 1977;

MURPHY et al., 1978).

Elle est synthétisée en quantité pondérale 20 à 25 fois moindre que le précurseur des protéines "GAG" (Pr 76 aviaire et Pr 75 murin) et semble produite par la suppression intermittente du codon de termi­

naison du gène "GAG" et translocation du ribosome dans le gène "POL"

S©it'

voisin. En effet, l'addition d'im tRNA de levure suppresseur

d'ambre (AUG) a un système de synthèse protéique "in vitro" programmé par le RNA 50-40 3 de la souche Moloney des virus de leucémie de la

G’ POIi

souris augmente le taux de synthèse de Pr 200 “ aux dépens de AP

celai de Pr 75 (PHILIPSON et al., 1978).

La fréquence de suppression observée "in vivo" détermine la produc­

tion différentielle des protéines "GAG" et "POL" et rond compte de leur abondance relative dans le cytoplasme des cellules infectées et dans les virions (plusieurs milliers de protéines "GAG" pour environ une centaine de molécules de polymérase; PANET et al., 1975).

(31)

21

L GAG I PPL I ENV I SRC

i

C

i

^

a

^

IXJ UJ LXi UJ

p19p27pl2p15

Pr180

■i-AXAAlA.tA.HA Al

i...B...

miHllAllAAHA

I_A11JAA^|^|«1

I

ENV, SRC 1

u\ll\u.l\LUlK^

g Pr 90 1

iVn^iiiln^ 9P

9P35 VGP 1 SRC |C|^A\

T

K%

Schéma 3B - Etapes de l'infection cellulaire par un oncovirus exogène:

modèle de l'expression génétique des ASV (explications détaillées dans le texte).

Trois classes de mRNA sont observées dans le cytoplasme des cellules infectées: un mRNA de constante de sédimentation 38 S, probablement identique au génome viral, un mRNA de cons­

tante de sédimentation 28 S et un mRNA de constante de sédi­

mentation 21 S.

Le mRNA 38 S est traduit en un précurseur (Pr 76) des pro­

téines de structure internes (p27, p19, p15» p12) et en un précurseur (Pr 180) de la transcriptase inverse (sous-unités

o< , (i ) .

Le mRNA 28 S est traduit en un précurseur (gPr 90; des glyco­

protéines d'enveloppe (gp 85, gp 35)-

Le mRNA 21 S sert probablement de messager au produit de traduction du gène"SRC" (p60).

(32)

La maturation des précurseurs "GAG—POL" est complexe et impli­

que des clivages intracytoplasmiques produisant des précurseurs "POL"

de poids moléculaire intermédiaire. Ceux-ci sont incorporés dans la particule virale en voie de fomation où ils sont clivés en polymé­

rase fonctionnelle (OPPBRMAN et al., 1977; WITTE et al., 1978). Le(s) enzyme(s) protéolytique(s) impliquée(s) dans ces clivages sont encore totalement inconnues .

G. Le gène ENV

Ce gène contient 1'information génétique qui correspond aux deux protéines d'enveloppe des oncovirus. Ces protéines sont glycosy­

lées et ont des poids moléculaires apparents de 85 000 et 35 000 res­

pectivement chez les virus aviaires (gp 85 et gp 35). Chez les virus murins où \jne seule d'entre elles est glycosylée, elles sont dénommées gp 70 et p15(e). Au cours de la morphogenèse de la particule virale, ces protéines sont liées entre-elles par ponts disiilfures (LEANMSON et al., 1976a,b) pour former les protubérances observées à la surface des virions (voir Section l).

Les glycoprotéines d'enveloppe possèdent essenttellement une antigénicité de type ce qui a permis, à l'intérieur d'im groupe

(c'est-à-dire les virus d'une espèce animale), une classification en sous-groupes ou types. Ainsi, les oncovirus aviaires sont classés en 7 sous-groupes dénommés A, B, C, D, E, P, G. L'antigénicité de type détermine le spectre d'hôte, 1'internetion avec les anticorps neutra­

lisants et 1'interférence virale (TOOZE, 1975)- Les glycoprotéines d'enveloppe possèdent également des déterminants antigéniques spéci­

fiques de groupe et des déterminants interspécifiques c'est-à-dire communs avec ce"ux de glycoprotéines d'oncovirus d'autres espèces ani­

males .

Etant exprimées à la surface des cellules infectées non seu­

lement dans les régions de bourgeonnement des particules virales mais

(33)

23

aussi dans des zones où aucunemorphogenèse de particule n'a apparera- meat lieu (SCHWARZ et al., 1976), les glycoprotéines d'enveloppe ont été particulièrement utilisées sous forme d'antigènes purifiés dans des expériences d'immunisâtion active ou d'immunothérapie pas­

sive avec des antisera préparés contre elles chez un hôte hétérologue.

Une sérothérapie efficace contre le développement de la leucémie in­

duite par la souche de Rriend des MuLV (P.MuLV) a pu être obtenue chez la souris par traitement avec un antisérum préparé contre la gp70 purifiée de P.MuLV (SCHAPER et al., 1976). Cet antissrum est également efficace dans la prévention de leucémie ou de sarcome in­

duits chez le chat par PelV (Peline Leukemia Virus) et PeSV (Peline Sarcoma Virus) qui sont les agents étiologiques de ces maladies dans cette espèce (de NORONHA et al., 1977). Par contre, la vaccination de souris avec la gp70 de P.MuLV montre une spécificité beaucoup plus étroite. La réponse immunologique des souris vaccinées est es- sent tellement dirigée contre 1'antigénicité de type de la glycopro­

téine et ne confère aucune protection contre les lymphomes sponta­

nés associés étiologiquement aux virus endogènes et même, dans cer­

taines souches de souris à haute incidence de leucémie (souche AKR), accélère le développement de la maladie (ILHE et al., 1976).

L'isolement de mutants d'ASV possédant des glycoprotéines thermolabiles et de mutants par délétion indiquent que les glycopro­

téines d'enveloppe sont codées par le génome viral.

Dans les cellules infectées, le produit primaire de traduc­

tion observé est un précurseur de poids moléculaire 90 000, partiel-

, ENV^

lement glycosylé (gPr 90 ), qui est clivé et complètement glyco­

sylé en gp 85 et gp 35 chez les virus aviaires (ENGLAND et al., 1977) et en gp 71 et p15(p) chez les virus de souris (SHAPIRO et al., 1976;

NASO et al., 1976).

L'inhibition de la glycosylation dans la cellule infectée montre que la partie polypeptidique de gPr 90 est une protéine de poids molécu- laire 70 000. Le mRNA engagé dans la synthèse de Pr 70 a uneEEV

(34)

constante de sédimentation de 20-28 S et est dérivé de la moitié 3' du génome viral (WEISS et al., 1977). Ceci a été démontré par traduction directe des mRNA extraits de cellules infectées dans les systèmes "in vitro" (PAWSON et al., 1977), dans les oocytes de X.

laevis (VAN ZAANE et al., 1977) ou par d'élégantes expériences de microinjections cellulaires (STACEÏ et al., 1977).

Une analyse plus fine de la structure de ces RNA a montré qu'ils étaient formés, outre des séquences informationelles provenant de la moitié 3' du génome viral, d'une séquence "leader" dérivée de l'extré­

mité 5' de celui-ci (MELLON et al., 1977, ROTHENBERG et al., 1977).

Les enzymes participant aux différentes étapes de la matura-

SN7 / \

tion de Pr 70 (glycosylation, clivage protéolytique; n'ont pas été caractérisées.Le fait que la taille des glycopeptides des molé­

cules de gp 85 des oncovirus aviaires dépende du type de cellule dans laquelle le virus se réplique suggère fortement que les enzymes responsables de la glycosylation sont d'origine cellulaire (LAI et al., 1972).

Remarque : les étapes de la réplication des oncovirus décrites dans cette section ne s'appliquent qu'aux virus exogènes non défectifs.

Il existe dans le DNA de la plupart des espèces animales des séquences provirales endogènes qui, le plus souvent, sont répri­

mées. Dans certaines conditions, cette information endogène est exprimée mais la régulation et les modalités de cette expression est différente et indépendante de celle des virus exogènes. Elle sera envisagée dans la section VI.

D'autre part, un virus exogène peut être défectif - dans un ou plusieurs des gènes "GAG", "POL" ou "ENV".

L'expression complète de ces 3 gènes étant essentielle pour la réplication, ces virus sont donc non infectieux. Leur réplication

(35)

25

nécessite la présence d'un autre oncovir-as à RNA, appelé virus

"helper", qui compléments leur défectivité par mélange phénotypi­

que . les particules infectieuses de virus à génomes défectifs sont donc toujours des particules phénotypiquement hybrides, contenant le génome du virus défectif et la (les) protéine(s) manquante(s) fournies par le virus "helper". Ces particules phénotypiquement mixtes sont appelées pseudotypes.Ce type de virus est extrêmement fréquent: tous les virus connus de leucémie aiguë des oiseaux ou de la souris et les virus de sarcome des mammifères (souris, chat) sont de ce type.

- dans le gène "ONC "

Dans ce cas le virus se répliquera normalement mais sera incapable de transformer des cellules cibles"in vitro"et d'induire un néo­

plasme" in vivo'! Cet aspect de la biologie des oncovir-as à RNA est discuté dans la section suivante.

IV. LE G-ENE "ONC"

L'infection par -un oncoviras d'une cellule susceptible (cel­

lule cible) provoque l'apparition d'un ensemble de modifications d'ordre morphologique, biologique et biochimique appelé transforma­

tion. Ces modifications observées"in vitro"ont été apparentées à la propriété de ces virus d'induire différentes tume-ars"in vivo'.'

Les virus de sarcome induisent des fibrosarcomes chez l'ani­

mal et transforment des fibroblastes mis en culture. Les viras de leucose provoquent différentes formes de leucémies (aigaës ou chroni­

ques) mais ne transforment pas les fibroblastes"in vitro": certains d'entre e-ax sont capables de transformer des cellules dérivées de tissus hématopoiétiques (reva par TOOZE, 1973).

(36)

IV. 1 . Les vix-u3 de sarcome

Pour les raisons exposées dans la section II, les virus de sarcome aviaires (ASV) ont été particulièrement bien étudiés. Ces virus sont capables de causer une t ransformation rapide de fibro­

blastes mis en culture et d'induire des tumeurs d'origine mésoder­

mique (sarcome) cbez les oiseaux et les mammifères.

L'isolement de mutants dans la transformation - mutants con­

ditionnels (thermosensibles) et mutants non conditionnels (mutants par délétion) - a démontré qu'un gène viral est responsable de 1'in­

duction et du maintien de l'état transformé (revu par VOG-T, 1977).

La comparaison des cartes oligonucléotidiques des RNA d'ASV sauvages et des mutants par délétion (WANG et al., 1975) et les analyses par microscopie électronique d'hétéroduplex entre le RNA du mutant et un cDNA représentatif du génome viral non défectif (JUNGHANS et al.,

1977) ont montré que le gène de transf ormat ion ( gène" SRC"/) est loca­

lisé entre 0,8 et 2,8 kilobases de l'extrémité 3' du génome viral non défectif.

D'autres études réalisées avec des mutants d'ASV thermosen­

sibles pour la transformation (bien que se répliquant parfaitement aux de\ix températures, ces mutants n'induisent et ne maintiennent la transformation qu'à la température permissive) ont montré que ce gène agit en déterminant la synthèse d'-une protéine. En effet, les inhibiteurs de synthèse protéique interfèrent avec l'apparition du phénotype transformé lors du passage de la température non permis­

sive à la température permissive (KAWAI et al., 197l).

Des expériences récentes ont permis d'identifier la protéine dont l'information est codée par le gène "3RG" . HJRCHIO et al. (l977) ont montré qu'un polypeptide ayant un poids moléculaire de 60 000 était synthétisé dans un système de synthèse protéique "in vitro"

programmé par une fraction subgénomique 20-24 S dérivée de l'extrémité

(37)

27

3' du RNA extrait des virions d’ASV. Cette protéine n'est pas obser­

vée dans les produits de traduction "in vitro" d'ime préparation similaire de RNA extraite d'un ASV délété dans le gène"3RC".

Une protéine de même poids moléculaire et contenant les mêmes pep­

tides trypsiques a été détectée dans un extrait de fibroblastes de poulet transformé par ASV par immunoprécipitation avec un sérum de lapin porteur de tumeurs induites par ASV. Cette protéine est aussi observée dans les cellules de hamster transformées par ASV. Elle n'est pas détectée dans des cellules non infectées ou dans des cel­

lules infectées par un virus de leucose ou par un ASV délété dans le gène "3RC" (BRUGGE et al., 1977; PURCHIO et al., 1978). Dans la cel­

lule transformée, le gène "SRC" est transcrit en mRNA de constante de sédimentation. .21 S possédant une séquence "leader" dérivée de 1 ' ex- ^ trémité 5’ du génome viral (WEISS et al., 1977; MELLON et al., 1977).

Des expériences d'hybridation moléculaire avec un c.DNA (^H) représentatif du gène"SRC"ont montré que des séquences apparentées sont présentes dans le DNA de cellules de poulet normal. Des séquen­

ces très similaires sont distribuées da.ns le DNA de diverses espèces aviaires bien qu'elles aient divergé quelque peu, proportionnellement aux distances phylogénétiques entre espèces (STEHELIN et al., 1976).

Cette relative conservation dans l'évolution suggère que ce gène a une fonction importante dans la cellule normale où il semole d'ail­

leurs être transcrit à un faible niveau en un RNA de constante de sédimentation 30 S (SPECTOR et al., 1978). L'interprétation actuelle de ces résultats est que le gène"SRC"des ASV dérive de la cellule normale et a subi une évolution propre après son incorporation dans le génome viral.

Les virus de sarcome de la souris (MuSV) résultent aussi d'un phénomène de recombinaison entre une information virale exogène et une information cellulaire. Les différentes souches de MuSV ont été isolées à partir de sarcomes obtenus après l'infection de divers

(38)

rongueurs (rat, souris) par différentes souches de virus de leucé­

mie (MuLV). Dans tous les cas, le génome du virus de sarcome contient une partie des séquences du vinas de leucémie infectant associée de manière covalente aux séquences d'un virus endogène au rongeur in­

fecté (SCOLNICK et al., 1973; SCOLNICK et al., 1975; SCOLNICK et

al., 1976). L'acquisition de ces séquences nouvelles confère toujours au virus la capacité d'induire des sarcomes"in vivo"et de transfor­

mer des fibroblastes" in vitro".. Ces séquences ont dès lors été défi­

nies opérâtionnellement comme étant le gène"SRC"des virus de sarcomes murins. Les études par microscopie électronique d'hétéroduplex entre le RNA de la souche de Moloney des MuSV (Mo.MuSV) et un cDNA repré­

sentatif du génome complet de Mo.MuLV a permis de localiser ce gène comme étant une séquence de 1500 bases située à l'extrémité 3' du génome viral (HU et al., 1977)- Les génomes MuSV des souches Kirsten et Harvey dérivent d'\me substitution plus importante des séquences du virus de leucémie original par les séquences d'un virus endogène de rat (SHIH et al., 1978).

Le génome de Mo.MuSV a été traduit dans les systèmes de synthèse protéique "in vitro" d'une part en protéines apparentées à celles codées par le gène "GAG-" des virus de leucémie et d'autre part en pro téines immunologiquement non apparentées aux produits des gènes "GAG"

"POL" et "HNV" (PHILIPSON et al., 1978). Ces produits pourraient être les produits de traduction du gène "SRC" murin.

Si la nature du produit de traduction du gène "SRC" des ASV a été découverte récemment, son mode d'action reste à élucider.

Cet aspect essentiel de la biologie des oncovirus est difficile à aborder car la transforrnation cellulaire n'est pas un phénomène uni- taire et les sites d'actions de p60 pourraient être multiples.SRC En effet, les différents paramètres qui définissent la transforma­

tion peuvent être dissociés par mutation (BECKER et al., 1977;

YOSHIDA et al., 1977). Ainsi, il existe des mutants thermosensibles d'ASV qui, à la température non permissive se comportent comme mutés

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29

pour certaines de leurs propriétés (la tumorigénicité, par exemple) et comme sauvages pour d'autres (propriétés de croissance des cellu­

les infectées, par exemple).

On admet généralement deux types de mécanisme d'action pour une pro­

téine transformante : action au niveau de la régulation de l'expres­

sion génétique ou action au niveau de la surface cellulaire. Ces deux mécanismes ne sont d'ailleurs pas mutuellement exclusifs et la multiplicité de l'action pourrait s'expliquer par des modifications post-traductionelles de p60 (clivage protéolytique, glycosylation, phosphorylation) en produits secondaires, chacun d'entre eux ayant une fonction spécifique. Certains faits expérimentaux plaident en

faveur de cette hypothèse :

- p60 est instable dans la cellule infectée (JAY et al., 1978) mais les produits de clivage sont inconnus,

- dans les systèmes de traduction "in vitro", des produits plus petits (poids moléculaire 25 000 et 18 OOO) que p60 mais pos­

sédant des peptides en commun asvec p60 sont synthétisés sur une fraction subgénomique dérivée de l'extrémité 3' du génome viral

(bEEMON et al., 1977; KAMINE et al., 1977),

- p60 est phosphorylée (LEVINSON et al., 1978)et semble possé­

der elle-même une activité kinase (COLLETT et al., 1978); le substrat physiologique de cette activité enzymatique est inconnu.

IV.2. Les virus de leucémie

On ne sait pas actuellement si la transformation indnite par les virus de leucémie se fait par l'intermédiaire d'une protéine transformante - produit de traduction d'un gène"LUK"- ou par un tout autre mécanisme tel 1'intégrâtion du provirus à un site particulier du génome de la cellule cible, par exemple.

La définition opérâtionnelle d'un gène"LUK"a été proposée récemment pour le virus aviaire de leucémie aiguë, MC-29. Ce virus

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possède uja génome de 5700 nucléotides (DUESBERG et al., 1 977) délété dans Tine pantie du gène "GAG" et probablement la totalité des gènes

"EIW" et "POL" (BISTER et al., 1977). H ne se réplique qu'en présence d'un virus "belper" (MC-AV) non oncogène mais qui possède les gènes

"GAG", "ENV" et "POL" fonctionnels.

L'analyse comparative de 1'arrangement des oligonucléotides Tl obte­

nus à partir des génomes de MC-29 et de MC-AV a permis de définir une séquence unique à MC-29, localisée dans la moitié 5' du génome.

Cette séquence unique est opérâtionnellement définie comme le gène

"LUZ" de MC-29 (MELLON et al., 1978).

Les expériences d'hybridation d'un cDNA ( h) représentatif des sé- quences uniques de MC-29 (c.DNA ) avec les RNA des autres onco- virus aviaires ont montré que ces séquences ne possèdent aucune homo­

logie avec celles des A.SV, ALV ou d'un autre virus de leucémie aiguë, MC — 2 9 AMV. Par contre, des séquences partiellement homologues au c.DNA existent dans le DNA et le RNA de fibroblastes de poulet normal, ce qui suggère que le gène de transformation de MC-29, comme le gène

"SRC" des ASV et MuSV, dérive du génome de cellules normales (SHEINESS e t al., 1 978).

Les mêmes observations ont été faites récemment lors de l'étude du virus de l'érythroleucémie murine, le 3PPV (Spleen Pocus Porming Virus). Ce virus, défectif pour la réplication est présent dans les préparations des souches de MuLV de Priend et de Rauscher

(STEEVES, 1975) qui lui servent de "helper". Des expériences d'hybri­

dations moléculaires similaires à celles décrites pour le système MC-29 ont montré que le génome de SPPV était formé de séquences homologues à un fragment du virus "helper" (P.MuLV ou R.MuLV) et de séquences spécifiques dérivées de la moitié 3' (contenant au moins le gène"ENV")du génome de virus endogènes xénotropes des souris

(TROXLER et al., 1977a,b).

Des phénomènes recombinatoires entre moitiés3' des génomes des virus endogènes écotropes et xénotropes de souris ont également

(41)

31

été démontrés pour les virus MCP (Mink Çell Pocus inducing) qui appa­

raissent dans le thymus de souris AKR développant la leucémie

(HARTL,ëY et al., 1977; ROMMEIAERE et al., 1978). Trois mécanis.nes peu­

vent expliquer la liaison du phénomène recombinatoire à la leucémo- genèse :

- soit les nouvelles séquences acquises permettent 1'intégrâtion du virus recoinbinant à un site différent du génome cellulaire et altère la transcription des gènes cellulaires proches,

- soit les nouvelles séquences"ENV"acquises (seules ou avec d'au­

tres séquences adjacentes) déterminent la synthèse d'une pro­

téine qui provoque la leucérnogénisation,

- soit les gènes"LUK"des MCP, SPPV, MC-29... sont acquis par recombinaison mais sont composés de séquences liées au - mais distinctes du gène"ENV",

Il est probable que le choix définitif d'un de ces modèles ne pourra se faire que par l'isolement de mutants conditionnels pour la leucérnogénisation et/ou le développement de méthodes biologiques de repérage des protéines de transf ormac|lîio>n. Le génome du virus

MC-29 a été traduit"in vitro"en une polyprotéine de poids moléculaire 110 000 (PIIO) qui possède certains déterminants antigèniques " G-AG"

à son extrémité NH^ terminale et qui contient - d'après leur locali­

sation sur le génome - les séquences de la protéine codée par les séquences spécifiques du MC-29 (PAWSON et al., 1978). La même pro­

téine a été détectée par immoprécipitation dans les cellules trans­

formées par MC-29. Dans la cellule transformée, PI 10 est instable mais les produits de clivage n'ont pu être détectés par les antisera utilisés (BISTER et al., 1977).

(42)

V. ANTIGENES DE SURFACE INDUITS PAR LES ONCOVIRUS A RNA

Les cellules infectées et transformées par les oncovirus à RNA expriment à leur surface d'autres antigènes que ceux définis par les gènes"ENV"ou"gag" Ces antigènes sont d'une grande importance car, s'ils sont spécifiques des cellules tumorales et reconnus par l'hôte, ils sont susceptibles de servir de cible pour 1'immunosurveillance et leur présence peut être exploitée dans les diagnostics immimologi- ques ét l'immunothérapie.

Chez le chat, les cellules des tumeurs induites par FeLV

(lymphosarcomes) ou par PeSV (fibrosarcomes) expriment à leur surface un antigène appelé POCMA (Peline Oncomavirus Çell Membrane Antigen) . L'analyse des titres en anticorps dirigés contre POCMA dans les sera de chats exposés à PeLV ou PeSV - naturellement ou dans les condi­

tions de laboratoire - a montré que la synthèse d'anticorps contre

,1

POCMA constitue un mécanisme puissant d'immunosurveillance contre le développement de tumeurs (ESSEX et al., 1976).

L'inoculâtion à des chats de cellules lymphoïdes infectées par PeLV et exprimant POCMA à leur surface induit des titres d'anti-POCMA plus élevés que ceux observés naturellement et confère à ces ani­

maux une immunité aux souches les plus pathogènes de PeLV ou PeSV (JARETT et al., 1975)

Des études récentes ont montré que POCMA était synthétisé dans les cellules de chats et dans les cellules hétérologues (chien, vison) transformées par PeSV. L'infection, sans transformation, de ces cellules par PeLV n'induit pas POCMA (ESSEX et al., 1977)- Cepen­

dant , POCMA est exprimé à la surface des cellules de lignées lym­

phoïdes infectées et transformées par PeLV et à la surface des cel­

lules tumorales des lymphomes induits par PeLV"in vivo"- productrices

(43)

33

ou non de PeLV (ESSEX et al., 1977). Ceci indique que EOCMA est antigène de transiormation différent des produits des gènes "G-AG"et

"ENV".

Dans les cellules transformées par EeSV, EOCMA est synthétisé sous la forme d'une polyprotéine de poids moléculaire 80-100 000 con­

tenant les déterminants antigéniques de pi 5» p12 et EOCMA. Cette polyprotéine est clivée en une protéine de poids moléculaire 25 000 contenant les déterminants antigéniques de pi 5 et pi 2 et en une pro­

téine de poids moléculaire 65 000 contenant les déterminants antigè­

niques de EOCMA (STEPHENSON et al., 1977). Cette protéine représente- t-elle le produit de traduction du gène"SRC"de EeSV ? Si il en est ainsi, comment la transformation de cellules cibles par EeLV induit- elle le même antigène à la surface des cellules tumorales ? On peut imaginer soit que l'infection par PeLV de cellules hoiriatopoiétiques active des séquences endogènes codant EOCMA soit que le génome de EeLV possède l'information correspondant à une protéine exprimée seulement dans les cellules lymphoïdes et possédant les sites anti­

gèniques de EOCMA.

Dans le système des leucémies et sarcomes aviaires lun anti­

gène de surface spécifique de la transformation a été défini et

dénommé TSSA. (_Tumor Spécifie Surface _^tigen; revu par KURTH et al., 1975).

Une immunité humorale et cellulaire peut se développer contre cet antigène par immunisation de poulets contre les virus de sarcome

(ASV) et de leucose (ALV) aviaires. L'information pour le TSSA semble être contenue dans le génome viral des oncovirus aviaires car il est induit dans diverses lignées cellulaires de mammifères transformées par ASV et n'est pas exprimé à la surface de cellules d'oiseaux trans­

formées par un virus de sarcome de souris (KURTH et al., 1976).

D'abord défini comme étant spécifique des ASV, l'antigène TSSA, comme EOCMA, est inductible par les virus de leucose aviaire"in vivo"et est exprimé à la surface de myéloblastes isolés du sang de poulet

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infectés par AMV. La nature moléculaire de TSSA n'est pas connue et aucune comparaison n'a encore été faite entre le TSSA et la protéine p60 qu'on a identifiée récemment comme le produit de traduction cor­

respondant au gène"SRC"des A.SV (voir section IV) .

VI. ORIGINE ET TRANSMISSION DES ONCOVIRUS

Trois modes de transmission ont été mis en évidence chez les oncovirus (revu par TOOZE, 1973) :

- un mode de transmission vertical, de génération en génération, de virus endogènes à l'espèce considérée,

- ma mode de transmission horizontal d'un virus exogène par con­

tact direct entre individus d'une même espèce,

- un mode de transmission congénital d'un virus exogène de la mère au foetus par l'intermédiaire de l'oeuf, du placenta ou du lait.

Les virus endogènes sont transmis génétiquernent par l'inter­

médiaire de la lignée germinale sous la forme d'un DNA proviral inté­

gré dans le génome de toutes les cellules de l'individu (revu par AARONSON et al., 1976). L'expression de cette information endogène

est sous le contrôle de gènes cellulaires et est le plus généralement réprimée. Cependant sous l'influence de facteurs très variables(cons­

titution génétique, âge, facteurs hormonaux ou chimiques...) cette information peut être exprimée partiellement (expression de certains antigènes viraux) ou complètement (production de particules virales).

Les cellules d'oiseaux contiennent l'équivalent de 1-2 génomes d'on­

covirus à RNA endogènes par génome cellulaire haploïde (NEIMAN et al., 1973)» L'expression partielle du génome endogène affecte les gènes "GAG" et "POL" indépendamment du gène "ENV". Les gènes "GAG"

et "POL" sont partiellement exprimés sous la forme d'une polyprotéine de poids moléculaire 120 000. Cette polyprotéine ne contient pas

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Références

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