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RESULTATS EXPERIMENTAUX

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Chapitre 1 : Distribution des séquences virales dans les myéloblastes de poussins leucémiques

Au moment où. nous avons entrepris ce travail, le génome viral était défini cotiune 'un RNA de constante de sédimentation 60-70 S,

formé de sous-unités dont on ignorait encore si elles étaient identi­ ques ou différentes. Des expériences de traduction"in vitro"du RNA viral avaient été tentées dans un système acellulaire de synthèse protéique dérivé de E. coli et des polypeptides mal caractérisés

avaient été obtenus (SIEGERT et al,, 1972) mais ces résultats étaient contestés (VON DER HELM, 1975).

D'autre part, puisque la réplication des oncovirus se fait par l'intermédiaire d'un provirus DNA intégré dans le génome cellu­ laire, la transcription du DNA proviral peut être assymétrique et produire, dans le cytoplasme, des séquences ribonucléiques de même sig.ne ( + ) que celui du génome viral ou de signe opposé (-). La pré­ sence de séquences ribonucléiques complémentaires à celles du génome viral avaient été signalée dans le noyau des cellules infectées

(BISWAL et al., 1969).

Il nous a donc semblé que le moyen le plus direct d'obtenir des renseignements sur la nature des séquences messagères virales et leur contenu informationnel était î

- de détecter et d'isoler les mRNA viraux à partir des RNA totaux ou des polyribosomes des cellules infectées,

- de traduire ces mRNA dans les systèmes de synthèse protéique hétérologues.

Pour ce faire, il fallait un système produisant des quanti­ tés abondantes de matériel biologique et celui de la myéloblastose aviaire semblait particulièrement favorable. En effet, l'infection de poussins d'un jour par 1'AMV standard provoque, en quinze jours, une myéloblastose permettant d'obtenir environ 0,5 gramme de myélo- blastes par poussin.

Nous avons estimé les proportions de séquences virales dans les RNA cellulaires extraits des myéloblastes infectés par le virus de la myéloblastose aviaire standard par hybridation moléculaire avec une sonde c.DNA( h) synthétisée sur le RNA 60-70 S de l'AMV par la transcriptase inverse purifiée (voir "Méthodes").

Dans les conditions d'hybridation choisies (hybridation en excès de RNA), la réaction de réassociation suit une cinétique du premier

ordre par rapport à la concentrâtion en RNA et est indépendante de la concentrâtion en DNA. A chaque instant, le pourcentage d'hybrida­ tion est donc proportionnel au produit de la concentrâtion du RNA multipliée par le temps (C t) et la valeur C^t à derai-réassociation

(et est inversément proportionnelle à la concentrâtion du RNA ' r 1 /2

hybridable dans la préparation de RNA considérée.

La Figure 1 montre le résultat de la cinétique d'hybridation du

c .DNA (^h) d'AMV au RNA 60-70 S et au RNA total extrait des rnyéloblas tes. La valeur du C t, de la courbe d'association du c.DNA ("^h) au

^

-2

/

RNA 60-70 S modèle est de 5 x 10 moles de nucléotides x seconde/li­ tre tandis que l'hybridation au RNA total extrait de myéloblastes don ne une courbe de même forme mais avec ■un C t^ de 50 moles de nucléo

r 1/2

tides X seconde/litre. La forme de la courbe obtenue avec le RNA to­ tal est la même que celle obtenue avec le RNA 60-70 S; cela signifie

Figure 1 - Hybridation moléculaire entre im AMV (3h) c.DNA et le RNA 60-70 S de l'AMV (•), le RNA total extrait de myéloblastes (x) et le RNA poly- somal extrait de myéloblastes (O ). C^t est le produit de la concentra­ tion en acide nucléique (en et du temps d'Hybridation (en Heures/o). Aucun.e correction n'a été faite pour les concentrations salines.

Figure 2 - Profil de sédiraentation des polysomes de myéloblastes après centrifugation en gradients de saccharose.

Les polysomes ont été préparés comme décrit dans "Matériels et méthodes", resuspendus en Tris-HGl 0.01 M, pH 7.4, NaCl 0.01 M, Mg acétate 0.0015 M, CaOl 0.0036 M contenant 200 ^g/ml de cyclo- heximide et centrifugé à 2°C au travers d'un gradient 10-40 fo saccharose à

40 000 rpm pendant 50 minutes dans un rotor SW 50-1.

Figure 3 - Hybridation moléculaire entre un AMV ("^h) c.DNA et le RNA 60-70 S de l'AMV (•) et les RNA polysomiaux retenus sur poly

(u)

-Sépharose et élués respectivement

à

25°C (♦) et 45° 0 (x),

C^t est le produit de la concentrâtion en acide nucléique (en OD-60) et du temps d'hybridation (en heure/2). Aucune correction n'a été faite pour les concentra­ tions salines.

Table__1_ - Pourcentage de séquences complémentaires au RNA 60-70 S d'AMV dans différents RNA cellulaires.

RNA -P 1 __ __ _ fo séquences virales AW 60-70 3 RNA 0.05 1 00 RNA total 50 0.06 RNA polysomal 30 0.1

RNA polysomal poly A"*" (25°0) 1 0 0.3 RNA polysomal poly A"^ (45°0) 3 1 .0

49

que toutes les séquences virales détectables par la sonde c.DNA(^h) sont présentes dans les séquences ribonucléiques totales. La compa­ raison des C^t

1/2

des deux courbes indique qu'environ 0.06 ^ des RNA du myéloblaste sont viraux.

La même analyse a été effectuée avec le RNA extrait d'une préparation de polysomes de myéoblastes. Les polysomes ont été ex­ traits selon la méthode décrite dans "Matériels et Méthodes" et les profils obtenus en gradient de saccharose du matériel ainsi préparé montre la présence, dans ces cellules de polysomes de très grandes taille (Figure 2).

L'identification du matériel sédimentant dans le gradient de la

Figure 2 à des polysomes a été réalisée en démontrant la sensibilité de ce matériel à l'EDTA et à la RNase.

L'hybridation du RNA polysomal extrait de myéloblastes au c.DNA( h) suit une courbe semblable à celle observée pour le RNA total avec un

4e l'ordre de 30 moles de nucléotides x seconde/litre ce qui signifie qu'environ 0.1 fo des séquences ribonucléiques polysomales sont virales (Figure 1).

Une purification partielle des séquences virales a pu être obtenue par chromatographie d'"àffinité su^r-poly(u)Sépharose. Environ 2 fo des RNA totaux ou polysomiaux sont retenus par la colonne à

haute force ionique (0.3 M NaCl). L'élution de ces séquences est obtenue par abaissement de la force ionique (O M NaCl) et augmenta­ tion de la température.

Le RNA polysomal et les fractions retenues sur la colonne (c'est-à-dire contenant un poly A) et éluées respectivement à 25°C et 45°C ont été testées pour leur contenu en séquences virales par cinétique de réassociation avec le c.DNA( H) d'AMV. Les résultats de cette analyse sont représentés dans la Figure 3 et Table 1.

Deux conclusions peuvent être tirées de ces résultats : - les séquences virales polyadénylées présentes au niveau des

polyribosomes contiennent l'ensemble de 1'information virale con­ tenue dans le génome 60—70 S. En effet, la forme de la courbe et le niveau d'hybridation atteint par la fraction retenue sur poly(U) Sépharose et éluée à 45°G sont semblables à ceux obtenus avec le RNA viral 60-70 S,

- une purification des séquences virales de l'ordre de dix fois a été obtenue par la chromatographie sur poly (Cj) Sépharose. En effet, le 0^t^^2 courbe de réassociation du RNA retenu sur poly(u) Sépharose et à poly(A)long (celle éluée à 45°C) est de 3 moles de nucléotides x sec/litre alors qu'il était de 30 moles de nucléotides X sec/liti-e pour le RNA polysomal non fractionné.

Remarquons que ces conclusions ne sont absolument correctes que si le c.DNA('^h) synthétisé est représentatif de l'entièreté du génome viral. La représentativité du c.DNA('^h) utilisé dans les expériences ci-dessus n'a pas été vérifiée. Cependant, la valeur du C^t^

^2

l®' courbe de réassociation du c .DNA( h) de l'AMV avec son modèle comparée à celle du

0

^t

^^2

correspondant à la réassocia­ tion du mRNA 9 S de globine de lapin (550 nucléotides) avec un

c.DNA( h) complémentaire préparé dans les mêmes conditions (C t. = 1.5 X 10 moles x seconde/litre) est compatible avec la comple­ xité génétique du génome des oncovirus (BILLETER et al., 1974)» ce

3

qui suggère que le c.DNA( H)utilisé ici est représentatif de l'es­ sentiel du génome viral.

Les préparations de RNA polysomal ou de RNA total retenus sur poly(u)Sépharose ont été testées dans différents systèmes de synthèse protéiques hétérologues (système dérivé de cellules de tumeurs d'ascites de souris ou système préparé à partir de germe de blé). Ces préparations ont, de manière reproductible, stimulé

1'in-/

35

V

corporation de méthioninel SJ dans un matériel acido-insoluble. Cependant, aucune protéine virale n'a pu être détectée par précipi­ tation immunologique avec un antisérum préparé chez le lapin

51

contre des particules d'AMV solubilisées aux détergents. La raison de ces échecs est vraisemblablement due au niveau extrêmement bas de synthèse de polypeptides viraux programmée par les préparations de RNA testées.

Chapitre 2 : Traduction du RNA du vi37us de la rnyéloblastose aviaire standard

L'observation faite au Chapitre 1 montrant que les RNA poly- somiaux des cellules infectées par AiW contiennent les mêmes séquen­ ces que celles présentes dans le RNA 60-70 S des particules virales ainsi que la difficulté de purifier suffisamment les mRNA viraux cel­ lulaires pour les traduire efficacement "in vitro", nous a amené à envisager directement la capacité messagère possible du RNA extrait des particules virales.

Nous avons décidé d'utiliser le système de synthèse protéique

I

hétérologue constitué par les oocytes de X. laevis (G-URDON et al., 1971). Ce système possède plusieurs avantages par rapport aux sys­ tèmes protéiques acellulaires, notamment du point de vue de son

- efficacité : chaque molécule de mRNA est traduite plusieurs cen­ taines de fois dans l'oocyte alors qu'elle ne l'est que quel­ ques fois dans les systèmes "in vitro",

- fidélité : les erreurs de traduction couramment observées dans les systèmes "in vitro" (terminaison précoce, initiation erronée), ne sont pas observées dans l'oocyte,

- capacité de réaliser des modifications "post-traduction" correctes tel des acétylation (BERNS et al., 1972), clivage protéolytique

(LASKEY et al., 1972),... etc.

Les oocytes de X. laevis microinjectés avec des RNA messagers d'origine cellulaire (mRNA de la globine; mRNA de la cristalline de

veau... etc) ou de RNA viraux (RNA du virus de 1'encéphalomyocardite (eMC)) dirigent la synthèse de quantités suffisamment importantes despolypeptides spécifiques correspondants(globine, cristalline de veau, protéines de structure de 1'EMC) pour qu'ils puissent être détectés par simple comparaison des lysats d'oocytes injectés et non injectés - par exemple par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

l'analyse comparative par électrophorèse sur gel de polya­ crylamide de lysats d'oocytes témoins et d'oocytes microinjectés

avec le RNA 60-70 S de l'AMV ne permet pas de mettre en évidence l'ap­ parition de polypeptides supplémentaires dans les oocytes injectés. Cette observation peut s'interpréter de deux manières :

- incapacité des oocytes de traduire le RNA des oncovirus (lASKEY et al., 1972)

- incapacité des méthodes d'analyse utilisées de détecter une syn­ thèse peu importante de produits viraux.

La deuxième hypothèse nous a semblé la plus vraisemblable car la même situation est observée dans les cellules infectées par les oncovirus à RNA. En effet, dans la cellule infectée, les synthèses protéiques virales ne représentent que 1 -2 ‘fo des synthèses protéiques totales de la cellule infectée et leur détection ne peut se faire que par l'emploi de techniques immunologiques (VOGT et al., 1973).

Nous avons immunisé des lapins avec une préparation de parti­ cules d ' AMV dont les protéines ont été solubilisées par 0,2 ‘fo de Nonidet P40. L'apparition d'anticorps spécifiques dans le sérum de ces animaux a été suivie par une technique de radioimmunoessai uti­ lisant les sera insolubilises au chloroformâte d'éthyle selon la méthode de TOSI et al. (1972 ; voir "Matériels et Méthodes). En bref, on mesure la capacité que possède des quantités croissantes d'anti­ sérum insolubilisé de fixer une quantité constante d'antigène radio­ actif. La figure 4a montre que 55 à 60 fo des protéines virales mar­ quées à l'iode

125

sont fixées aux plus grandes concentrâtions

53

d'antisérum utilisées. Cette réaction est spécifique puisqu'\m sérum de lapin n'ayant pas reçu d'injection d'AMV ne fixe pas de protéines radioactives et que l'addition de protéines non radioactives obte­ nues de différentes préparations d'AMV entre en compétition avec la fixation de l'antigène radioactif par une quantité limitante d'anti­ sérum (Pigure 4b).

Le but de la préparation de ces antisera étant leur utilisa­ tion dans la précipitation sélective de polypeptides viraux synthé­ tisés dans les oocytes de X. laevis injectés avec du RNA d'AMV et leur analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide, il conve­ nait d'utiliser une technique de précipitation immunologique

- réduisant au maximum l'adsorption non spécifique de protéines de l'oocyte aux précipités immunologiques,

- amenant le moins possible à une surcharge du gel de polyacryla­ mide par les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines et éviter ainsi des perturbations dans les migrations électro­ phorétiques .

Nous avons utilisé une réaction de précipitation directe dans laquelle antisérum et antigène sont mélangés en quantités rela­ tives amenant à la précipitation quantitative de l'antigène. Ces

conditions de précipitation ont été déterminées pour les antiséra que nous avons préparé en suivant la précipitation de 5 000 cpm de pro­ téines d'AMV marquées à l'iode 125 (0.05 ;J.g de protéines), par des quantités croissantes d'anti-AMV en présence de 5 ;o.g/ml de protéines d'AMV non radioactives, la Figure 5 montre le résultat de ces expé­ riences pour l'anti-AMV n° 9 qui a été utilisé dans les expériences ultérieures: un plateau de précipitation est atteint dans ces condi­

tions par l'emploi de 30 pil d'anti-AMV dans un volume réactionnel final de 200 ^1.

Ces conditions optimales de précipitation ont toujours été utilisées dans les expériences décrites dans la suite de ce travail.

du virus de la myéloblastose aviaire standart marquées par l'iode

125

par des quantités croissante d'un sérum anti- AMV (•) et un sérum contrôle (x) selon la méthode de TOSI et al.,

1972

(voir "Matériels et méthodes").

B : Analyse de la réversibilité de la réaction A par mesure de la capacité de différentes dilutions d'ime préparation d'AMV solubilisée par 0.2 ‘fo de Nonidet P40 de compéter la fixa­ tion de

4000

cpm de AMV par ■une quantité limitante d'antisérum (quantité amenant à 60-70 fo de précipitation relative dans le dosage A).

Figure 5 - Courbe de précipitation directe de 5000 cpm de protéines du virus de la myéloblastose aviaire marquées par l'iode 125»

en présence de 5 pg/ml de protéines d'AMV non radioactives, par des quantités croissantes d'un sérum anti-AMV (•)

d'un sérum contrôle (x).

La préparation d'antisera dirigés contre les protéines vira­ les internes, leur utilisation dans des réactions de précipitations immxmologiques et l'emploi du système de synthèse protéique hétéro­ logue des oocytes de X. laevis nous a permis d'étudier les capacités messagères du RNA viral 60-70 S et des sous-unités 30-40 S obtenues par dénaturation thermique du complexe 60-70 S. Ces travaux sont décrits dans la publication ci-jointe "Prog Oocytes Synthesize and Completely Process the Precursor Polypeptide to Virion Structural Proteins after Microinjection of Avian Myeloblastosis Virus RNA".

Reprinted front

Proc. Natl. Acad. Sci. USA

Vol. 74, No, 8, pp. 3230-3234, August 1977 Biochemistry

Frog oocytes synthesize and completely process the precursor

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