Seules les techniques expérimentales qui ne sont pas décrites dans la publication formant le 2e chapitre des "Résultats" seront reprises ici.
1
. Purification des polysomee; des myéloblastes - Extraction des RNA totaux des myéloblastes.Les polysomes totaux ont été isolés à partir de myéloblastes obtenus du sang de poussins leucémiques. Le sang de poussins au stade final de la maladie est prélevé par ponction cardiaque et centrifugé à 2 500 X g pendant 15 minutes à 4° 0. Les myéloblastes sont lavés trois fois dans une solution isotonique contenant
200
pig/ml de cyclo- heximide puis incubés à 4°C pendant 15 minutes dans 5 volumes d'xm41
tampon hypotonique (Tris-HCl 0.01 M, pH 7•4» Nacl 0.01 M; Mg Acétate 0.0015 M; CaCl^ 0.0036 M; 200 ^g/ml de cycloheximide). Les cellules sont alors lysées dans un homogénéiseur de Do'unce par 5-7 coups de piston. Les cellules non lysées, les noyaux et gros débris cellulai res sont éliminés par centrifugation à basse vitesse. La fraction microsomale est traitée par 1 ‘fo de deoxycholate de sodium puis cen trifugée pendant 10 minutes à 30 000 x g. Le surnageant est alors centrifugé au travers d'un coussin de saccharose 40 fo dans le tampon ci-dessus à 360 000 x g pendant 60 minutes. Le RNA des culots de polysomes ainsi obtenus a été extrait par la méthode protéinase K- phénol.
Les RNA totaux de myéloblastes ont été obtenus par extraction au phénol-crésol. Un culot de myéloblastes (l0 grammes) gelé à - 80°G est broyé dans un mortier à - 80°C jusqu'à l'obtention d'une poudre fine. Cette poudre est ajoutée à un mélange de 10 voliimes de Tris-HCl 0.01 M, pH 8.3; NaCl 0.15 M; EDTA 0.001 M; 3DS 1 ^ et de 10 volumes du mélange phénol-crésol. L'ensemble est homogénéisé dans un mixer pendant 1 minute et l'extraction continuée à température ambiante pendant 15 minutes sous agitation constante. Les phases sont séparées par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 minutes. La phase aqueuse et l'interphase sont récupérées et l'extraction répétée 3 fois. Les acides nucléiques sont pr-écipités à partir de la phase aqueuse par addition de 2 volumes d'éthanol. Après une nuit à - 2Ü"C, un culot d’acides nucléiques est obtenu par centrifugatio. , séché puis redis sous dans 40 ml d'un tampon Tris-HCl 0.01 M, pH .5; 0.005 M. La solution est alors incubée pendant 30 minutes à 37^0 en présence de 8 ;j.g/ml de DNase (Worthington) . Les RNA sont réextraits par un volume du mélange phénol-crésol puis reprécipités à l'éthanol. Le culot de RNA obtenu par centrifugation est resuspencu lentement dans une solution aqueuse de LiCl 2M et le lUMA récupéré par centrifuga tion.
2* La Chromatographie d'affinité sur polyfU)- Sépharose
La matrice a été préparée seLon WA-GrNLR et aL. (l971 ) st La méthode de chromatographie utilisée est celle décrite par VASSART et al.
(1
973) •3. Préparation du c.DNA (^h) d'AMV
Le c.DNA complémentaire au RNA 60-70 S de 1'AMV standard a été synthétisé à 37°C dans Txn volume réactionnel de 100 pj. conte nant 1 mCi de (^H) TTP (50 Ci/mmole; Amersham), 2 mmoles/1 de dATP, dCTP, dGTP; 25 mmoles/l de Tris-HCl pH 8.3;
8
mmoles/l de MgCl^; 0.05 mmole/l de DTT ; 100 pg/ml actinomycine D; 25 >ig/ml oligo (dC ) ^2
_-]3
î 2 pig de RNA 60-70 S d'AMV et 30 unités de transcriptase inverse puri fiée. L'unité d'activité est définie comme 1'incorporation de 1 mmole de ( Hj dTMP en un matériel acido-insoluble dans une réaction de 10 minutes à 37°C utilisant comme modèle le polymère dT^^irA à une con centration finale de 0.01 mM.Après incubation pendant 1 heure à 37°C, la réaction est arrêtée par addition de SDS à une concentration de 0.1 ^ final. La solution est extraite par un mélange phénol ; çs,r.éâc5l : chloroforme 7:1 :8 pendant 5 minutes à température ambiante et la phase aqueuse soumise à une filtration moléculaire à travers une colonne de Sephadex G-50 équi librée en Tris-HCl 0.01 M, pH 8.3; NaCl 0.15 M; EDTA 0.001 M conte nant 0.1 ^ de SDS. Les acides nucléiques de la fraction exclue ont
été concentrés par précipitation à l'éthanol. Après conservation 1 nuit à - 20°C, les acides nucléiques sont récupérés par centrifuga tion et le culot redissous dans 300 ;al de NaOH 0.4 M. Après incu bation 18 heures à 37°C, le mélange est neutralisé par addition d'un volume de HCl 0.4 M en présence de 0.03 mmole/l. de Tris-HCl, pH
8
.3
. Le cDNA (^h) est autohybridé pendant 48 heures à 68°C 0.4 M Naphosphate^pH 6.8 contenant 0.5 ^ Le SDS. La fraction43
monocaténaire est purifiée par chromatographie d'adsorption sur hydroxyapatite (KOHNE et al., 1972). j
!
4. Hybridations (^h) c.DNA-RNA
Le mélange d'hybridation (20 .ul) contient 10 mmole/l Tris-HCl pH 7.4; 0.4 mole/l NaCl; 0.001 raole/l EDTA; 0.1 % SD3; 5000 cpm
3 T
(■^h) oDNA (activité spécifique 10 cpm/pg) et des quantités croissan tes de RNA virionique ou cellulaire. Après incubation pendant 72 heures à 68°C, le milieu réactionnel de chaque échantillon est dilué dans 30 ;a1 de Tris-HGl 10 mmole./l pH 7.4; 0.4 mole/l NaCl ; 0.001 mole/l EDTA; 0.1 'fo SDS. Deux aliquotes de 20 ^1 sont prélevées de chaque échantillon, mélangées à 30 p.1 de tampon nucléase S 1 (Na acé tate 0.03 mole/l; NaCl 0.05 mole/l; ZnSO^ 0.001 mole/l; glycérol 10 DNA de thymus de veau 400 ^g/ml) et incubées à 45 °G pendant 60 minu tes avec ou sans 5 000 unités/ml de nucléase 31. Les acides nucléi ques de chaque échantillon sont précipités, en présence de 30 ^g/ml de RNA de levure, par addition d'un volume de mélange TGA froid
(solution de 30 ^ w/v d'acide trichloroacétique saturée en orthophos phate et pyrophosphate de sodium), recueillis sur filtre millipore et la radioactivité mesurée par scintillât ion liquide. Le d'hybri dation est calculé pour chaque échantillon à partir du rapport
(cpm + SI/cpm - SI) X 100.
5. Préparation des anticorps anti-AIW; marquage à l'iode 125; radio- immunoessais
Les antisera dirigés contre les protéines de 1'ANV standard ont été obtenus chez le lapin par injections intraveineuses et intra musculaires à intervalles de 15 jours, pendant 2 mois, de 500 jag de protéines virales/injection (particules virales purifiées par
sédimentation à l'équilibre en gradient de saccharose et solubilisées par 0,2 ‘fo de Nonidet P40) émulsitiées par un volume égal d'adjuvant complet de Preund.
Après récolte du sang et séparation du sérum, les protéines d'une partie de ce sérum ont été insolubilisées par pontage covalent par le chloroforraate d'éthyle selon la méthode de T03I et al. (l972). En résumé, 5 ^1 d'antisérum sont dialysés à 4°C pendant 1 nuit contre un tampon acétate, pH 4-5• Au dialysat centrifugé, on ajoute gouttes à gouttes 60 ;ul de chloroformâte d'éthyle/ml d'antisérum tout en maintenant le pH à 4.5 par addition de NaOH 1 M. Après 30 minutes, 1'insolubilisation est complète et le précipité est lavé dans un tam pon phosphate isotonique (O.OI M phosphate de sodium, pH 7.2; NaCl 0.15 m) puis avec une solution de Na^CO^ 0,1 ‘fo avant d'être resus- pendu dans 5 nil de tampon phosphate isotonique.
Les protéines des particules virales solubilisées par 0,2 f>
de Nonidet P40 ont été marquées par l'iode 125 dans un vo î.ume total de
250
>il contenant 1 mCi Na; 0.01 mole/l Tris-HCl^pH 8.3; 0.15 mole/l NaCl, 0.001 mole/l EDTA, 100 ja.g de protéines virales et 100 p.g de chloramine T. Après incubation pendant 10 minutes à 0°C, la réaction est arrêtée par addition de 300 yxg de Na^S^O^ et d'-un excès de Kl et le mélange soumis à une filtration moléciuLaire à travers une colonnede Biogel P6 équilibrée en Tris-HCl 0.01 M, pH 8.3; NaCl 0.15 M; EDTA 0.001 M, contenant 0,2 f> de Nonidet P40. Les préparations de protéi nes iodées, recueillies dans la fraction exclue, sont marquées dans ces conditions à des activités spécifiques de 1 à 5 x 10^ cpm/pig.
Les radioimmunoessais sont effectués dans un volume final de 200 p.1 contenant
4
000 cpm de protéines d ' AMV marquées à l'iode 125(
0.05
pLg) , 3 f> de sérumalbuminebovine et des quantités croissantes de la suspension d'antisérum insolubilisée. Chaque milieu réaction nel est incubé à température ambiante pendant 18 heures, sous agita tion constante. Les suspensions sont alors centrifugées pendant 4 minutes dans une microcentrifugeuse Beckman 152 et 100 ;al des45
surnageants (moitié du volume réactionnel) sont prélevés et trans férés dans une série de tubes. La radioactivité contenue dans les deux séries de tubes est alors estimée par comptage de la radioacti vité K . Le pourcentage de liaison est calculé selon la formule(cpm de la fraction culot - cpm de la fraction surnageant/cpm totaux)x 100.