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Texte intégral

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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Polastro, E. (1978). Etude de la méthylation du cytochrome c chez Saccharomyces cerevisiae (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

f

î1

BIBUOTHËQUE DE CHIMIE UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

FACULTE DES SCIENCES SERVICE DE CHIMIE GENERALE 1

Etude de la méthylation du cytochrome ç chez Saccharomyces

Cerevisiae.

Thèse présentée pour l'obtention du titre de Docteur en Sciences

POLASTRO Enrico 1 978

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2 5 SE?. 1978

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLESfièp:...

FACULTE DES SCIENCES SERVICE DE CHIMIE GENERALE I

Dans le cadre de la synthèse peptidique en phase solide, nous proposons de modifier le groupe de liaison peptide-polymère, dans le but d'augmenter la spécificité de l'étape de clivage au terme de la synthèse.

Elude de la mélhylalion du cylochrome ç

chez Saccharomyces Cerevisiae.

Thèse présentée pour l’obtention du titre de Docteur en Sciences

POLA5TRO Enrico

1978

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réalisation de ce travail, est une tâche difficile, vu leur grand nombre.

Que les personnes que j’aurais involontairement oubliées dans ces remerciements me pardonnent, elles peuvent être assurées de ma recon­

naissance.

Je tiens à remercier tout particulièrement Monsieur le Professeur J. Léonis, non seulement pour la confiance dont il a bien voulu m’ho­

norer en m’acceptant dans son laboratoire, en soutenant mes demandes auprès du F.N.R.S., en me confiant des taches d’enseignement, mais aussi, et surtout, pour la marque indélébile que la qualité hors pair de son enseignement a laissé dans mon esprit.

Tous mes remerciements vont aussi à Monsieur le Professeur A.G.

Schnek pour l’intérêt constant qu’il a porté à nos travaux, pour toute sa gentillesse et pour tout ce qu’il a fait pour nous.

Je remercie très vivement les Professeurs van Gelder et Slater, de l’Université d’Amsterdam, pour leur hospitalité et leur aide précieuse lors de la réalisation de certaines expériences.

Ma gratitude va aussi à Monsieur le Professeur E. Margoliash pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et accepté de discuter nos résultats.

Un merci tout particulier doit être adressé au "numéro 2" de la méthylation, le ^ofesseur W.K. Paik, de la Temple University de Phi­

ladelphie, pour son accueil inoiblidble, sa gentillesse, son enthou­

siasme et ses conseils judicieux. Il restera toujours à nos yeux l’image même de l’homme épanoui sous toutes les facettes. Son aide, ainsi que celle de son équipe, a été précieuse pour la réalisation d’une partie importante de ce travail.

De nombreuses expériences ont été rendues possibles et plus aisées grâce à l’aide fournie par les membres du Département de Biologie Mo­

léculaire de Rhode-St-Genèse. Je remercie tout spécialeimnt Monsieur le Professeur A. Sels qui m’a guidé, conseillé et critiqué de façon constructive tout au long de ce travail. Merci aussi aux Professeurs Barel, Bumy, Schram et aux Docteurs Marbaix et Huez.

Merci aussi aux Professeurs Lontie et Préaux et au Docteur Gielens de la K.U.L. pour leur aide lors des études de dichroîsme circulaire.

Ma reconnaissance va aussi aux Professeurs Christophe et Strosberg et à Monsieur Kuzner pour leur aide lors de certaines analyses en a- cides aminés.

Que Monsieur le Professeur Kram soit aussi assuré de ma gratitude pour sa compréhension et pour m’avoir guidé lors de mes premiers "pas"

scientifiques.

Ma plus grande chance a été d’avoir un "CHEF" incomparable.

Que le Docteur Marc Melchior Deconinck soit assuré de ma plus sincère reconnaissance et de toute mon estime pour sa gentillesse, ses efforts, sa patience, sa constance sa probité, son aide compétente, efficace et inestimable et ses conseils et encouragements judicieux.

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tes qualités, ce travail aurait été mille fois plus pénible.

Merci aussi au Docteur Dépassé pour les recherches bibliographiques qui ont servi de base au sujet de cette thèse.

Nous ne savons comment exprimer de façon adéquate nos sentiments envers le Docteur Looze, qui nous a proposé ce travail et nous a fait partager ses ccnnaissances de la dénaturation et de la fluorescence des protéines. ' Son contact nous a permis de mieux découvrir certains aspects de la nature hunaine. Qu'il soit assuré que nous avons appré­

cié, nous apprécions et nous apprécierons toujours à leur plus exacte valeur autant ses conseils que sa oonpétence morale et scientifique.

Bien qu'il ait déjà été remercié plusieurs fois, un merci tout particulier doit aller à mon complice des moments les plus noirs et

les meilleurs de ma thèse : "Barbapoux" Mailier.

Son intelligence extrême, son sens exacerbé de l'humour et de la cri­

tique, ainsi que ses prises de positions et ses jugements nets et tranchés, m'ont grandement aidé à m'apercevoir de ma naiveté.

Merci aussi au Docteur Strebelle et au Professeur Van Den Brill.

Que tous les autres membres du Service de Chimie Générale I, et en particulier les Docteurs Sels et Vande cas sérié, soient, eux aussi, assurés de ma gratitude.

Un grand merci aussi à toute l'équipe du Secrétariat.

Ce travail a été rendu possible par l'appui financier du F.N.R.S.

Que Monsieur le Recteur, Messieurs les membres du Jury de la XI ème commission, et en particulier Monsieur le Professeur H. Chantrenne, et Monsieur P. Levaux, soient assurés de ma reconnaissance pour la confiance qu'ils m'ont ainsi accordée.

Merci aussi à Monsieur E. Klein.

Enfin, last but not least, merci à mes parents et à Myriam pour la patience avec laquelle ils m'ont supporté et l'aide inestimable qu'ils m'ont apportée, tout au long de la durée de ce doctorat.

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INTRODUCTION

RESUME ET BUT DU TRAVAIL

CHAPITRE I : Isolement et purification des formes méthylée et non méthylée de 1 'IsO-1-cytochrome c de Saccharomyces cerevisiae

CHAPITRE II : Etude physico-chimique des formes méthylée et non méthylée du cytochrome £ de levure

CHAPITRE III : Etude de la susceptibilité à la protéolyse des formes méthylée et non méthylée du cytochrome a de levure

CHAPITRE IV : Interactions entre le cytochrome c_ et la membrane mitochon­

driale

CHAPITRE V : Purification et caractérisation de la cytochrome c méthylase de levure

CONCLUSIONS ET DISCUSSION GENERALE REFERENCES

ANNEXE I : Synthèse des dérivés ^-N-mono, di et triméthylés de la lysine ANNEXE II : Purification and some molecular properties of protein methy-

lase II from equine érythrocytes

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a) Avant-propos b) La méthylation

a) La méthylation des protéines

d) Rôle biologique de la méthylation des protéines e) Le cytochrome c

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a) Avant-propos

La structure covalente d'une protéine, déterminée par la séquence de ses acides aminés, peut, après la biosynthèse des liens peptidiques, su-

in vivo des modifications chimiques.

Ces dernières résultent de la fixation de groupements ou de radicaux spé­

cifiques sur les chaînes latérales de certains acides aminés de la protéi­

ne.

Les réactions d'hydroo'lation, phosphorylation, acétylation, adénylation, adénosine diphosphate ribosylation, glycosylation, méthylation..., appar­

tiennent à cette famille des réactions dites de modification chimique.

Au cours de ces dernières années, les réactions de modification post-traductionnelles de la structure covalente des protéines ont été particulièrement étudiées.

Ces études ont mis en évidence la diversité des radicaux ajoutés et des sites visés, l'universalité et la spécificité des modifications, ainsi que le nombre et la variété des protéines concernées ( Tableau I).

Dès la découverte de ce phénomène, une question fondamentale s'est imposée à tous : quel pouvait bien être le rôle biologique de ces modi­

fications ?

Il apparaît sans doute illusoire de prétendre pouvoir donner une réponse simple et unitaire à un problème aussi vaste et complexe.

De multiples hypothèses concernant le rôle des modifications post-tra­

ductionnel les sont fréquemment avancées.

Dans certains cas précis, divers travaux ont permis de fournir des ébau­

ches de réponse. Ainsi, il a pu être montré que la phosphorylation, l'a­

dénylation, 1'adénosine diphosphate ribosylation, et l'échange entre ponts disulfures et thiols libres de certaines enzymes jouent un rôle de régu­

lation sur leur activité enzymatique ( Holzer et Duntze, 1971).

Cependant, dans la majeure partie des cas, le rôle de la modification chi­

mique des protéines demeure largement incompris et obscur. Tel est, en­

tre autre, le cas en ce qui concerne la méthylation.

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TABLEAU I : Acides aminés et dérivés des acides aminés que l'on retrouve dans les protéines et les peptides ( Uy et Wold, 1977).

ACICES AMINES DERIVES DES ACIDES AMINES DE BASE

DE BASE

Alanine Arginine

Asparagine Acide Aspartique Cystéine

Acide Glutamique Glutamine Glycine Histidine

Isoleucine Leucine Lysine

Métnicnine Phénylalanine

Rroline

Sérine

Thréonine

Tryptophant Tyrosine

Val ine

N-Acétylalanine;N-méthylalanine

N^-MethylarginineiN^.N^-diméthylarginine.N^iN^ -diméthy1 arginine;ADP-ribosylarginine citrulline;ornitine;arginyl-protein (a)

Acide aspartique;N^-(N-acétylglucosaminyl )asparagine;N'(5-asoartyl)lysine (c) Amide s-aspartlque;acide N-acétylaspartique;acide 0 -phosphonoaspartique (d)4

Cystine (c):S-mercaptocystéine (d);S-galactosylcystéine;S-glucosylcystéine;S-cystéi- nyl-hème;8 a-(S-cystéinyl)flavin thiohémiacétal;dehyoroalanine (d,?)

Amide 2-glutamique;aeiqe Y-carboxyglutamique;acide r-méthylglutamique Acide glutamique;glutaminamioe;acide Byroglutamioue;N^-(v-glutanyl)lysine (c) GlycinamideiN-acétylglycine;N-fonnylglycine:N-glucuronylglycine

Histidinamidei’-méthylhistidinejT-phosphonohistidine (d);T-Dhosphonohistidine (d);

4-iodonistidine;5a-(T-histidyl)flavin;8o-(7-hlstidyl)flavin

Leucyl-protéine

N'-Méthyllysine:N‘-diméthyllysineiN‘-triméthyllysine;N'-ohosohonolysine (d);N‘-acétyllysinei N‘-(pnosphopyriooxyl)lysine;N‘-l iooyllysineiN^-oiotinyllysine;N“-murein-lysine;allyllysine;

dehydrolysinonorleucine (c);lysinonorleucine (c);allysine aldol (c);dehydroallysine aldol (c);

dehyoromerodesmosine (c);merodesmosine (c);dihydrodesmosines (c);desmosines (c);tetrahy- dpodesmosines (c) ;( al lysine aldol )histid ine {c);à-hyoroxylysine trimé thy 1 hydroxylysine;

0"^(â-D-galactosyl jnydroxylysine ;£-hydroxyanysine;i-(denyarohydroxylysino)norleucfne (c) ; hycroxylysinonorleucine (c);(dehydronydroxylysino)hydroxynorleucine (c);(hydroxylysino)hydro- xynorleucine (c);synaesine (c);dehydrohydroxymerooesmosine (c);(dehydrohistidino)hydroxyme- rodesmosine (c);(hydroxyallysinealdol)histidine (c)

Héthloninamide;N-acétylméthionine;N-formylméthionine.

Phénylalaninam1de;£-hydroxyphénylalanine (d);0®-glycosy1-3-hyOroxyphénylalanine;?hênylalanyl- protéine (a)

Pjolinamide;3,4-dihydroxyoroline (d);4-hydroxyoroline;3-hydroxyproline;N-diméthyloroline;

O’-arabinosylhydroxyprol ine;0‘*-galactosylhyaroxyprol ine

Pyruvate;N-acétylsérine;0'-phosohonosérine;0°(ADP-Ribosy1-phosphono)sérine;0^-méthy1 sérine (d) ; 0‘'-(4' -snospncijooantetheine )sérine ;3'-xylosyl sérine ;C'-mannosylsérine;0°-(N-aceîylgal actosa- minyl)sérine;0‘*galactosyl sérine.

2-kétobutyrate;N-acetylthréonine ;0°-ohospnonothréonine;0“-méthylthréonine (d);0^-fucosylthréo­

nine ;0°-mannosyl thréonine;0“-(N-acéty!galactosaminyl)thréonine;0'-galactosylthréonine.

A

Tyrcsinamide; tyrosine 0 -sulfate;3-iodotyrosine;3,5-diiodotyrosine;3-cnlorotyrosine;3,5-dichlo- roty rosine ;3-bromotyrosine;3,5-dibromoty rosine;5-ororao,3-cnlorotyrosine;3,j,3'-triiodothyronine;

3,5,5' ,3'-tetraiodot.hyronine;3,3' -bityrosine;3,3' ,5' ,3' ' -tertyrosine (c) ;0 -adênylyl tyrosine;

0*-ur1dylyltyrosine;s-hydroxytyrosine (d) ;0"-glycosyl-s-hydroxytyrosine;d1hydroxyohenylalani- ne (d);protéinyltyrosine (a)

Val inamide;N-acétylvaline

a) Le terme aminoacyl-protéine ou protéinyl-aminoacide représente les dérivés produits par transfert direct du radical aminoacyl de l'ami- noacyl-t-RNA ou de l'acide aminé libre sur des protéines acceptrices b) Ce dérivé constitue une réticulation de la chaîne peptidique

d) L'existence de ces dérivés n'a pas été prouvée de façon univoque.

Elle est présumée sur la base d'arguments indirects.

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b) La méthylation

De nombreux composants cellulaires se sont révélés être méthylés in vivo. Ainsi, l'on sait que la méthylation affecte le DNA, les divers types de RNA, certains polysaccharides, des alcaloïdes, les catécholami- nes, la sérotonine, les protéines...

Si une grande variété de substances sont susceptibles d'être méthy- lées in vivo, on n'a pu découvrir avec certitude, jusqu'à présent, qu'une seule molécule donneuse de groupements méthyle : la S-adénosyl-L-méthio- nine. En effet, à l'exception des réactions de méthylation impliquées dans la biosynthèse de la méthionine, la quasi totalité des réactions de transméthylation biologique connues font appel à ce seul substrat

( Cantoni, 1975 et 1976). La possibilité, qui avait été suggérée en 1972 par Laduron, que certaines méthylases utilisent le N -méthyltétrahy- 5 drofolate,est actuellement fortement contestée ( Cantoni, 1976).

Ces dernières années, divers groupes de recherche se sont efforcés de préciser le rôle biologique de la méthylation.

La variété des liaisons chimiques formées, l'universalité, la spécifici­

té, ainsi que le coût énergétique élevé ( l'activation de la méthionine en S-adénosyl-L-méthionine requiert une mole d'ATP ( Cantoni et Durell, 1953)) font apparaître comme fort peu probable la possibilité que ces

réactions représentent simplement une sorte de "trop plein", pour évacuer d'éventuels excès cellulaires en groupements méthyle.

Bien qu'affectant une grande variété de constituants et suscitant, dès lors, de multiples études, on constate . en général, que seules des hypothèses ont été formulées pour expliquer le phénomène de la méthyla­

tion et son rôle biologique.

Dans le DNA de plusieurs espèces bactériennes on trouve de la 5-mé- thylcytosine et de la N-6-méthyladénosine. Ces bases ne sont pas incor­

porées comme telles lors de la réplication du DNA, mais résultent de l'action de DNA méthylases, qui modifient des sites spécifiques de cette macro­

molécule ( Gold et Hurwitz, 1963). Il a été montré que certaines de ces

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enzymes, en reconnaissant et méthylant des séquences du DNA endogène, le rendaient résistant aux enzymes de restriction intracellulaires ( Arber, 1974).

Cependant, la majeure partie des bases méthylées présentes dans le DNA bactérien semblent sans rapport avec les processus de restriction ( Ma- rinus et Morris, 1969).

Le DNA nucléaire animal et végétal peut lui aussi contenir des quantités importantes de 5-méthylcytosine ( dans le DNA nucléaire de plante ce nu­

cléotide peut représenter jusqu'à 30 % des cytosines totales ( Kalousek et Morris, 1969)). Malheureusement, chez ces organismes, le rôle de ce nucléotide n'est pas établi.

La méthylation des RNA est beaucoup plus complexe que celle du DNA.

La modification peut porter, non seulement au niveau de la base ( on con­

naît plus de dix dérivés de bases méthylées dans les seuls t RNA)^ mais aussi au niveau de la fonction hydroxyle située en position 2 du cycle ribose ( pour une revue voir Nau, 1976).

Fort peu de choses sont connues en ce qui concerne la méthylation des RNA.

On sait qu'une augmentation importante de l'activité t RNA méthylase se produit dans les cellules cancéreuses ( Tsutsui et al., 1966). Cependant, cette constatation n'a pas encore pu être reliée à un rôle biologique précis. Par ailleurs, des résultats clairs n'ont pu être à ce jour ob­

tenus dans l'étude de l'effet de la méthylation du t RNA sur sa fonction biologique principale : le transfert d'acides aminés lors de la biosyn­

thèse des protéines.

L'hypothèse selon laquelle les nucléotides méthylés conféreraient au t RNA une rigidité moindre ou une résistance accrue envers les ribonu- cléases a été avancée ( Uchida et Egani, 1967).

Depuis quelques années, on sait que, chez les cellules animales et leurs virus, la formation du m RNA s'accompagne de façon générale du blocage ( en anglais "the capping") de leur extrémité 5' ( Adams et Cori, 1975;

Lavi et Shatkin, 1975).

Dans les cellules de mammifère les structures 5' terminales sont du type m^G ( 5') pppXpYp oû X et, dans certains cas Y, sont des ribonucléosides méthylés en position 2'-0. Dans les m-RNA des virus d'animaux X est sou­

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vent de la 2'-0 méthyladénosine ( Abraham et al., 1975), tandis que dans les virus de plante, tel le virus de la mosafque du tabac, X est de la guanosine ( Zirmiern, 1975).

La généralité des "caps" 5'-terminaux et de la méthyl-7-guanosine chez les m RNA d'Eukaryotes permet de penser que ces structures pourraient jouer un rôle important dans le métabolisme cellulaire de ces macromo­

lécules. Il a été, entre autre, suggéré que la méthylation et le "capping"

pourraient constituer des étapes dans la maturation du m RNA cytoplasmi­

que ( Rottman et al., 1974).

Les travaux du groupe de Shatkin semblent indiquer que les m-RNA du réo- virus, du virus de la stomatite vésiculaire et des réticulocytes de la­

pin, possédant un "cap" complet mais non méthylé au niveau de la guanine terminale, ne sont pas traduits dans des extraits acellulaires de germe de blé ( Shatkin et al., 1976). Ces m RNA peuvent être méthylés au ni­

veau de cette base par simple addition de S-adénosyl-L-méthionine au sy­

stème. Cette modification suffit à rendre les m RNA "actifs et traducti- bles", la méthylation paraissant indispensable pour la fixation du messa­

ger au ribosome ( Shatkin et al., 1976).

Dans les cellules eukaryotes, le r RNA est synthétisé sous forme d'une longue molécule de RNA précurseur. Immédiatement après, ou pendant la transcription, des groupements méthyle sont introduits sur des sites spécifiques de la chaîne polyribonucléotidique, principalement au niveau de la fonction 2'-0 du ribose ( Klootwijk et Planta, 1973). A des stades ultérieurs, la méthylation peut porter aussi au niveau de quelques ba­

ses ( il y a, entre autre, formation de N-6-diméthyladénine ( Zimmerman, 1968)) ( Klootwijk et al., 1972; Maden et Salin, 1974).

Bien que la fonction biologique exacte de la méthylation du pré-r RNA ne soit pas connue, on constate que les régions non méthylées du RNA 45s sont dégradées pendant les processus de maturation, tandis que les segments méthylés sont conservés ( Grummt, 1977).

Une observation intéressante a été faite sur des mutants de E. Coli ka- sugamycino-résistants. Il a été constaté que le RNA ribosomial 16s de la sous-unité 30s possède chez les souches sensibles à cet antibiotique de la N-6-diméthyladéninejproche de l'extrémité 3'. Cette base n'est pas modifiée dans la souche kasugamycino-résistante ( Helser et al., 1972).

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Les réactions de méthylation enzymatique des carbohydrates ont été mises en évidence en 1967 par Kauss et Hassid ( 1967a).

Ces auteurs ont montré que des extraits d'épis de maïs étaient suscepti­

bles de transférer le radical méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine sur 1'hémicel1ulose B, en formant, notamment, de l'acide 4-0-méthyl-D-glu- coronique. Il a également été montré que les 0-méthyl esters de la pectine étaient formés enzymatiquement après la biosynthèse de la macro­

molécule ( Kauss et Hassid, 1967b). La méthylation des groupes carbo- xyles des pectines joue un rôle important dans leur fonction biologique.

En effet, leur capacité d'échanger des ions, de retenir l'eau et de for­

mer une trame par des liaisons ester, ioniques ou des ponts hydrogène, dépend, en grande partie, de leur degré de méthylation ( Deul et Stutz, 1958; Henghin, 1958).

La méthylation des molécules de petite taille est, elle aussi, acti­

vement étudiée. Plusieurs de ces "petites" molécules méthylées in vivo sont pharmacologiquement actives ou jouent un rôle physiologique impor­

tant, comme, par exemple, les catécholamines dans le système nerveux.

Dans certains cas^un parallèle entre méthylation et activité biologique a pu être établi. Ainsi on sait que la codéine, éther méthylique de la morphine ( position 3), doit être déméthylée pour pouvoir exercer son effet opiacé. L'0-méthylation de l'adrénaline et de la noradrénaline est catalysée par la catéchol-0-méthyltransférase ( COMT). La méthyla­

tion désactive ces importants médiateurs chimiques du système nerveux.

Cette désactivation est complémentaire de celle produite par la mono­

amine oxydase ( MAO) ( Wollermann, 1970).

La sérotonine ( 5-hydro>o'tryptamine) peut être méthylée in vivo en po­

sition 5-0. Certaines anomalies de la méthylation de la sérotonine sem­

blent pouvoir être mises en parallèle avec la schizophrénie ( Weil-Mal- herbe et Szara, 1971). Cependant, cette constatation n'a pu encore être expliquée au niveau moléculaire.

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c) La méthylation des protéines

De toutes les modifications post-traductionnelles subies in vivo par les protéines, la méthylation apparait comme étant une des plus com­

plexes, tant par le nombre d'acides aminés qu'elle touche que par son universalité ( Tableau II).

C'est en 1929 qu'Ackermann découvrit le premier acide aminé méthylé : la 1-méthylhistidine ( Ackermann et al., 1929). Ce dérivé fut identifié chez l'oie, après hydrolyse de l'ansérine, dipeptide extrait du muscle de cet animal.

Par la suite, de nombreux acides aminés basiques méthylés, comme, par exemple, les différentes e-N-méthyllysines et cj-méthylarginines, ont été mis en évidence à l'état libre dans les urines de plusieurs animaux.

Il a été constaté que pratiquement tous les acides aminés pouvaient exi­

ster Jn_\n^ sous forme de dérivés méthylés ( Meister, 1965). Certains, comme ceux provenant du tryptophane, de la leucine ou de 1'hydroxypro- line, ne sont pas repris dans le Tableau II. Ils sont trouvés essentiel­

lement dans des antibiotiques ou à l'état libre dans les organismes su­

périeurs.

La présence de dérivés méthylés d'acides aminés a été établie dans de nombreuses protéines issues de différentes espèces ( Tableau II).

Une étude de Matsuoka ( 1972) sur la composition du matériel protéique total des fractions subcellulaires d'organismes allant de 1'Eubactérium aux mammifères a, entre autre, mis en exergue l'omniprésence des déri­

ves méthylés de l'arginine et de la lysine; seul 1 'Eubactérium semble dépourvu d'arginines méthylées.

La grande majorité des auteurs pense que la méthylation des protéines est un phénomène post-traductionnel se produisant soit au niveau du poly­

peptide naissant soit au niveau de la protéine complète.

On est parvenu à cette conclusion en s'appuyant sur diverses constata­

tions et notamment :

- la présence de e-N-triméthyllysine dans la protéine flagellaire de Sal­

monella résulte d'un déterminant génétique autre que celui spécifiant la séquence de cette protéine ( Stocker et al., 1961)

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p-h-ffonomélhvl IvSine ( 195?) Çh,MHCH2CH2CH2CH-.CmNH2 )COjH Acide aminé 1ifcre Urine htfMine

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Histone Thymus Hembel et a1., 1968

Cytochrome _c Germe de blé Ascomycètes Protozoés

OeLâftoe et al., 1969 • DeLange et al., 1970 H111 et al., 1971

HyOSine Muscle Mai-dy et al.. 1970

Actine Amibe Heihing et Kom, 1970

Protéines Ribosomiales E.Coli Chanv et al.. 1974 Calcium dépendent

reçulatory protein 0^ cyclic nucleotide

onosphodiesterase Testicules de rat Jackson et al., 1977

c»N-triméthy1»5'hydrtixv lys ine l 19701 )3»*cHjCH(0H)cHjCHjCH(Km, jcOjH

Paroi cellulaire Diatomées Nakajima et Vulcani, 1970

^N-méthylnmithine ( 1969)

ÇHjhHCH.CH^CKjCH/NH^^CO-H .

Acide aminé 1ibre cerveau de boeuf Matsuoka et al., 1969

lf* -monométhylaroinine ( >M7)

ÇH.,NKC (NH )NHCH2CH2CH2CH(NH2 )C0^H

Histone Thyaius de veau Paik et Kim. 1967 Protéine acide Noyaux et foie de rat Friedman et al., 1969 Protéine basicue

encépnalitoçênique Hyéline Baldwin and Carnegie. 1971 H*. N**, et N**, N'* diméthvlarQinine ( 19671

ÇH3mC(MÇH3)HHCH2CH.CH2CH(HH,)C02H ou (ÇHj,l2Îir(NH )nhCH-CH2CH2CH(NH2 )C02H Acide aminé 1ibre Urine. ser\mi Kakimoto et Akazawa, 1970 Histones Thymus de veau Paik et Kim, 1967 Myosine Muscle gambaire Reporter et Corb*«, 1^73 4 Protéine basique

encépha11toçénloue myéline Baldwin et Carnegie. 1971 Protéines nucléaires

non histoniques noyaux de foie Boffa et al., 1977 l“Méthvlhistidine ( 1929)

Ansfrine Muscle de !'o le Ackermann et a!., 1929 Acide aminé libre Urine canine Westall. 1952

Ac>o« aminé 1ibr«

Myosin*. Actin^

Histone Oçsint

Î954)

Urine humaine Muscle Erythrocyte aviaire ftétine de boeuf

Tanan et al. » 1964 Johnson et al., Î967

Gershey et al.. 1969 Reoorter et Reed. 1972 W-méthylolutamine ( 1977)

C0jHCH(»W2 JCH^CH^COMHÇKj

Protéine Ribosoieiale LU E.Coli Lhoest et Colson. 1977 Ester méthylioue de Tacide dlutaHoue ( 1977)

NH^CH(COjH)CHjCH-COOÇH.

Protéine membranaire E.Coîi Kleene et ai.. 1977

C-e nombreu* arçtwnts indirects indlouent fortement la orésence a'esters néthy- liQues de protéines in vivo, dans le çlooule rouoe. l'hypophvse. le ribosome oe E.Coli---{ Kim et al., 1977; Kim, 1973 ; Diliberto et Aielrod, 197S).

Ether méthynoue de la sérine ou fet) de la thréonine ? ( 19751 a30CHjCH(NH-)CO^H et 2!30CH2CH2CM(MHj )C02H

Activité prctéine-

néthyiase DNA-deoendente Sperme de taureau Sheid et Pedrinan, 1975

V-h-méthylalanine ( 1977) ÇH3WCH{CH3)C02H

Protéine ribosomiale E.Coli Cher, et al-, 1977 K »W-méthylméthionine { 1977)

CH.SCKjCH^CH(MHÇH,)C02H

Protéine ribosomiale E.Coli Chen et al., 1977 H-W-diwéthyloroline ( 1977)

Cytochrome Cnthidia Oncooelti Pettiçre- et Siaith. 1977 -W-méthylphènylalanine ( 1978)

Pi1ine Pseuoomona s

Aerugifiosa Frost et.al., 1978 N-triwéthylalanine ( 1977)

Prottir» riboso...!, f.CoH ,t . I.. 1977

(17)

- la méthylation des histones dans les noyaux de thymus de veau, suivie par incorporation du groupe méthyle de la L-( méthyl méthionine, est insensible à l'action de la puromycine ( Allfrey et al., 1964) - la e-N-méthyllysine, administrée à des systèmes capables de réaliser

des synthèses protéiques, n'est incorporée dans aucune fraction suscep­

tible d'être précipitée par l'acide trichloroacétique ( Kim et Paik, 1965)

- de la e-N-méthyllysine radioactive est trouvée dans les ribosomes lavés de Blastocladiella Emersonii, lorsqu'ils sont incubés en présence de S-adénosyl-L-méthionine marquée ( Comb et al., 1966).

- la purification de plusieurs protéine méthylases a été réalisée.

La protéine méthylase I ( S-adénosyl -L-méthionine : protéine-argini­

ne méthyltransférase, E.C. 2. 1. 1. 23), la protéine méthylase II ( S-adénosyl-L-méthionine : protéine-carboxyl-O-méthyltransférase, E.C. 2. 1. 1. 24) et la protéine méthylase III ( S-adénosyl-L-méthio- nine : protéine-lysine méthyltransférase, E.C. 2. 1. 1. 25) ont été, ainsi, isolées et caractérisées. Ces enzymes, qui ne sont pas inhi­

bées par la puromycine, n'acceptent comme substrat que des protéines entières ou, au moins, des peptides d'une certaine taille ( Jamaluddin et al., 1976; Durban et al., 1978; Polastro et al., 1978b et 1978e).

Dans les systèmes étudiés jusqu'à présent^la méthylation semble être un phénomène hautement spécifique. Ainsi, sur les seize résidus de lysine que 1'Iso-I-cytochrome £ de levure comporte, un seul, celui situé en position 72, est méthylé ( DeLange et al., 1970). De même, une seule arginine, la 107, est méthylée dans la protéine basique en- céphalitogénique ( P.B.E.) ( Brostoff et Eylar, 1971; Carnegie, 1971).

La méthylation est également limitée aux résidus lysine localisés en position 20 pour l'histone H4 de thymus de veau, et en position 9 et 27 pour l'histone H3 extraite de ce même organe ou des testicules de carpe

( DeLange et al., 1969b; Hooper et al., 1973).

Grâce à des préparations enzymatiques appropriées, l'identité des sites méthylés in vivo et in vitro a pu être établie pour la P.B.E.

( Sundarray et Pfeiffer, 1973) et pour le cytochrome jc ( Polastro et al., 1978e).

(18)

Pratiquement, une méthylase distincte semble être requise par protéine, voire même par site méthylé.

Ainsi, par exemple, la protéine méthylase responsable de la méthylation du cytochrome _c chez Neurospora Crassa est incapable de méthyler les histones ( Nochumson et al., 1977). Au contraire, la protéine méthyla­

se III extraite de noyaux de thymus de veau ou de cerveau de rat n'ac­

cepte comme substrat que les histones ( Paik et Kim, 1971; Wallwork et al., 1977). De même, les protéines chromosomiales non histoniques ne semblent pas être méthylées par la même enzyme que les histones ( Wall­

work et al. , 1977).

La spécificité élevée de la méthylation implique que l'enzyme méthylante reconnaisse soit la séquence, soit la conformation du site à modifier, soit les deux simultanément. Les éléments de réponse étant assez con­

tradictoires, on ne peut, à ce jour, trancher en faveur de l'une ou de l'autre de ces hypothèses.

Ainsi, en raison de la conformation de 1'hémoprotéine, la lysine 72 du cytochrome £ semble être particulièrement accessible, et même située, selon certains auteurs, à un endroit privilégié ( Cantoni, 1975; Petti- grew et Smith, 1977). Par contre, la P.B.E. ne semble posséder en so­

lution aucune structure secondaire définie ( Eylar et al., 1972).

L'ovalbumine dénaturée par chauffage n'accepte plus les groupes méthyle transférés par la protéine méthylase II extraite d'érythrocytes de rat ( Kim, 1974). Toutefois, une étude récente a permis de montrer que la protéine méthylase de thymus de veau accepte comme substrat la ribonu­

cléase pancréatique dénaturée par chauffage et carboxyméthyléejOu cer­

tains de ses peptides ( Jamaluddin et al., 1976). La méthylation de ces peptides n'est, cependant, efficace que si ceux-ci ont une taille raisonnable, de l'ordre de quatre résidus ou plus.

La spécificité et la spécialisation du système enzymatique requis pourrait suggérer un rôle biologique important pour les réactions de mé­

thylation. Le maintien d'une telle machinerie, sans avantages pour la cellule, serait injustifié et, sans doute, contraire aux principes "ca­

pitalistes" d'économie et d'efficacité auxquels la cellule nous a tant habitués.

(19)

d) Rôle biolog'ique de la méthylati-on des protéines

Le rôle biologique de la méthylation des protéines demeure large­

ment mystérieux.

Dans certains cas, les processus de méthylation semblent pouvoir être mis en parallèle avec des événements cellulaires complexes comme, par exemple, la réponse à des stimuli hormonaux ou autres, l'exocytose, la contraction musculaire, la chémotaxie, la croissance cellulaire...

Tout comme d'autres modifications épigénétiques de la structure co­

valente d'une protéine, il est permis de se demander si la méthylation n'est pas un phénomène de contrôle et de régulation de l'activité enzy­

matique ou biologique du polypeptide.

Un tel rôle de régulation impliquerait une réversibilité des réactions de méthylation et, par là,un "turn-over" des groupes méthyle fixés sur la protéine.

Lors des réactions de méthylation des protéines, il y a formation d'une grande variété de liaisons chimiques ( Tableau II), dont la nature et la réactivité sont très différentes.

Ainsi, il est très difficile de concevoir la réversibilité, dans des con­

ditions douces, d'une méthylation portant au niveau d'une arginine, d'une lysine ou d'une histidine. Au contraire, dans les protéines, les esters méthyliques des acides aspartiques et glutamiques peuvent être hydro-

lysés dans des conditions d'acidité proches du pH physiologique ( Kim et Paik, 1975).

Des études ont été réalisées afin d'établir si les groupes méthyle fixés au niveau des lysines dans les histones possédaient un turn-over indépendant de celui du polypeptide.

Il a pu être mis en évidence qu'une enzyme, 1'e-alkyl-L-lysine-oxygène- oxydoréductase ( E.C. 1. 5. 3. 4), appelée aussi e-alkyl1ysinase, est capable de déméthyler 1' e-N-méthyllysine dans les histones, en transfor­

mant le groupe méthyle en formaldéhyde ( Kim et al., 1964; Paik et Kim, 1973). Les activités de la protéine méthylase III et de 1' e-alkyl- lysinase apparaissent à des moments différents du développement cellu­

laire et, lors de la prolifération cellulaire, l'activité e-alkyllysina- se est très réduite, alors que l'activité méthylasique est stimulée ( Paik

(20)

et al. , 1975).

Malgré la découverte de cette déméthylase, la réalité d'un turn-over des groupes méthyle fixés au niveau des résidus lysine dans les histones est controversée. En effet, certains auteurs pensent que cette réaction de méthylation est irréversible ( Duerre et Lee, 1974; Honda et al.,

1975; Byvoet et al., 1972). D'autres, au contraire, semblent admettre un turn-over particulièrement lent de ces radicaux ( Paik et Kim, 1975).

Etant donné l'absence ou la lenteur extrême du turn-over, et en se basant sur le seul exemple des histones, il paraît peu vraisemblable de pouvoir attribuer à la méthylation des lysines, comme probablement aus­

si à celle des histidines et des arginines, un rôle ou une participa­

tion dans des "phénomènes transitoires" de contrôle ou de régulation.

Par contre, on pense que la méthylation des résidus glutamiques et aspar­

tiques d'une protéine pourrait être directement impliquée dans des pro­

cessus de régulation. Ce type de méthylation, en estérifiant des fonctions carboxyles, neutralise une éventuelle charge négative et la liaison

ester formée est facilement hydrolysable, même dans des conditions très douces ( Kim et Paik, 1975).

Cette modification chimique pourrait être exploitée par la cellule selon des mécanismes comparables à ceux de la phosphorylation ( notons, cepen­

dant, que la réversibilité de la carboxyméthylation n'implique pas né­

cessairement l'existence d'une déméthylase, ce processus pouvant être obtenu par simple élévation du pH). Ces deux modifications font, en effet, apparaître des fonctions facilement hydrolysables et modifient

( de façon opposée, il est vrai) la charge nette du polypeptide.

S'il est difficile d'attribuer un rôle de régulation à la méthyla­

tion des résidus lysine, arginine ou histidine, celle-ci pourrait, par contre, parachever de façon durable la finition du polypeptide et lui conférer des propriétés particulières et personnalisées, utiles pour sa fonction.

Il est connu depuis longtemps que la méthylation des résidus arginine et lysine augmente le caractère hydrophobe de l'acide aminé ( Tanford, 1962) et modifie, dans le cas des lysines, leur pKb ( Tableau III).

La triméthylation produit, en outre, un centre chargé positivement, quel-

(21)

TABLEAU III : pKb de la fonction e-amino de méthylés ( Paik et Kim, 1975)

la lysine et de ses dérivés

Lysine c-N-monométhyllys. e--N-diméthyllys. e-N-triméthyl.

pKb 3.37 3.22 4.2 /

les que soient les conditions de pH ou de polarité du milieu ( Paik et Kim, 1975).

Si sur la base du pKb la diméthylation a un effet contraire à la mono­

méthylation, des expériences de résonance magnétique nucléaire semblent montrer que l'affinité des dérivés e-N-méthylés de la lysine pour les a- nions croit de façon proportionnelle au nombre de substituants méthyle présents ( Baxter et Byvoet, 1975).

La modification des résidus lysine pourrait, dès lors, intervenir pour moduler la liaison entre deux molécules, lorsque celle-ci se fait par

des interactions de type ionique. Ces dernières, par exemple, semblent impliquées dans les interactions histone-DNA ou cytochrome _c-cytochro- me _c oxydase.

Selon certains auteurs, la méthylation des lysines des histones pourrait faciliter leur liaison à d'autres macromolécules et favoriser la forma­

tion de la chromatine ( Byvoet et Baxter, 1975; Paik et al., 1978).

Ainsi, il semblerait que les histones les plus méthylées soient les plus difficiles à extraire de la chromatine. De plus, les segments les plus

méthylés des histones ne sont pas détachés de la chromatine par un traitement à la trypsine, ce qui indiquerait que ces fragments sont for­

tement liés au DNA, et, de ce fait, ne sont pas dégradables par cette pro­

téase ( Byvoet et Baxter, 1975).

Selon certains auteurs, la méthylation des lysines et des arginines pourrait conférer au polypeptide une résistance accrue à la protéolyse ( Paik et Kim, 1971). Cette hypothèse n'a, à ce jour, jamais été te­

stée sur des protéines méthylées in vivo. Les résultats obtenus avec des protéines méthylées chimiquement in vitro n'ont pu apporter des éléments de réponse cohérents.

(22)

A notre connaissance, il existe un seul exemple où le rôle de la méthylation des protéines a été clairement démontré.

En 1976, LaBadie et al. ont, en effet, montré que chez les mammifères, la carnitine provient du métabolisme des résidus de e-N-triméthyllysine fixés au niveau des protéines. Ces auteurs ont observé qu'après admini­

stration à des rats d'asialo-fétuine, dont certains résidus lysine étaient triméthylés ( méthyl C) chimiquement, on constatait une dégradation ra­14 pide de cette protéine au niveau des lysosomes hépatiques. De la e-N- triméthyl lysine est rapidement transportée dans le cytoplasme et, trois heures après l'administration de la fétuine marquée, 35 % de la trimé- thyllysine contenue dans cette protéine est métabolisée en carnitine.

Seule la triméthyllysine peut être métabolisée en carnitine, contrai­

rement aux dérivés mono et diméthylés de cet acide aminé.

Sur la base de ces observations, Paik et al. ( 1977) ont proposé le schéma repris dans la Figure 1 pour expliquer la biosynthèse de la car­

nitine chez les mammifères.

+

NHj N-(CH,),

CH, CH,

CH,

1 Protein methylase 1!I

1 CH, CH, 1

1 S>adcnosyl>L*mcihionine

CH, 1

CH, CH,

CO-NH-C-CO-NH H Proietn lysjne residue

+ N-(CH,h

I CH,

I CHOH

I CH,

I COOH Carnitine

Hydroxylation

...CO-NH-C-CO-NH...

H t-N-Trimeihyllysine in protein

+ N-(CH,|,

I CH,

I CH, CHjI

I COOH y-N-Trimcihylamino butyric acid

CH,-NH, I COOH Glycine

AtdolaK

Prolcolvsis

N-(CH,), I CH, I CH,

I CH,

I CH,

I CH-NH,

I COOH Free t-A'-trimelhyllysine

/

/

+ N-(CH,),

I CH,

I CH,

I CH,

I CHOH

I CH-NH,

I COOH /Î-Hydroxy-C'N- trimetliyllysine

L-Amino acid oxida<

or iransatninase (in A'. (Ta.t.tit)

N-(CH,), I CH,

I CH,

I CH.

I CH,

c-oI I C(X)H a-Kclo-c-A’-trimel)iyl- aminoitexanoïc acid

Figure 1 : Voie métabolique proposée pour la biosynthèse de la carnitine chez les mammifères ( Paik et al., 1977).

(23)

Le rôle de la triméthylation des résidus lysine des protéines, pourrait, dans ce cas,être comparable à celui de l'iodation de la thyroglobuline.

Rappelons que cette glycoprotéine, de masse molaire proche de 700 000, est d'abord iodée et puis complètement dégradée, afin de libérer un aci­

de aminé modifié : la thyroxine.

Cependant, selon Paik et al.( 1977), il est fort peu vraisemblable que la méthylation des protéines ait lieu uniquement afin de créer un pool d'e-N-triméthyllysine, en vue de la synthèse de la carnitine.

On a vu que la méthylation des arginines et des lysines a, entre autre, comme effet de créer des centres hydrophobes qui pourraient s'a­

vérer importants et utiles lors d'interactions, par exemple, du type protéine-1ipide.

La protéine basique encéphalitogénique présente une arginine méthylée en position 107. Cette protéine, qui représente 30 % du contenu protéi­

que de la myéline, participe à l'interaction de ce complexe avec des composants lipidiques membranaires ( Eylar et al., 1969).

Selon Baldwin et Carnegie ( 1971) la méthylation du résidu 107 pourrait faciliter l'interaction myéline-lipides membranaires. Outre la création d'un centre hydrophobe, la méthylation de ce résidu pourrait stabiliser

la molécule dans une conformation privilégiée, propre à permettre une interaction accrue.

Le ribosome de E.Coli contient des nombreuses protéines méthylées ( Comb et al., 1966; Alix et Hayes, 1974). La méthylation porte non seu­

lement au niveau des lysines, mais aussi sur les extrémités N-terminales de certaines protéines ( Chen et al., 1977; Lederer et al., 1977), sur

un résidu glutamine ( Lhoest et Colson, 1977), et, vraisemblablement, au niveau de résidus glutamiques et aspartiques ( Kim et al., 1977).

Des mutants, déficients au niveau de la méthylation de certaines pro­

téines ribosomiales, ont pu être isolés ( Colson et Smith, 1977; Lhoest et Colson, 1977). Ces mutants semblent parfaitement viables, ce qui

indiquerait que la méthylation n'affecte grandement ni l'assemblage, ni le fonctionnement du ribosome.

Une corrélation a, cependant, pu être établie entre le degré de méthyla­

(24)

tion et l'activité du ribosome. En cultivant des mutants de E.Coli met~ en présence d'éthionine, on a pu obtenir des ribosomes fonctionnel­

lement altérés, contenant des protéines et du r RNA subméthylés, pouvant accepter in vitro des groupes méthyle provenant de la S-adénosyl-L-mé- thionine ( Beaud et Hayes 1971a et 1971b). La méthylation de ces ribo­

somes permet une récupération rapide de leurs propriétés normales ( Beaud et Hayes, 1971b). Malheureusement, ce résultat, qui indiquerait un parallélisme entre degré de méthylation et activité biologique, n'est pas univoque, puisque dans ces expériences on ne peut distinguer les con­

séquences de la méthylation des r RNA et des protéines.

Divers rôles biologiques ont été proposés pour la carboxyméthyla- tion des protéines ( Kim et al., 1978).

Toutes les hormones de nature peptidique de la glande pituitaire anté­

rieure s'avèrent être d'excellents substrats pour la protéine méthylase II extraite de cet organe ( Diliberto et Axelrod, 1974). Sur la base d'une inactivation de certaines de ces hormones suite à l'estérification chimique par du méthanol ( Li et Fraenkel-Conrat, 1947), il a été sug­

géré pour la carboxyméthylation un rôle d'inactivation temporaire de ces hormones en vue de leur stockage ( Diliberto et Axelrod, 1974). La ré­

activation pourrait avoir lieu suite à une légère variation du pH.

Une autre étude du groupe d'Axelrod ( Diliberto et al., 1976) semble in­

diquer que la carboxyméthylation pourrait jouer un rôle important dans les processus de sécrétion exocytotique des produits excrétables contenus dans les vésicules.

Pendant l'exocytose, la vésicule et la membrane cellulaire fusionnent et les produits intravésiculaires sont déversés dans l'espace extracel­

lulaire ( De Robertis et Ferreira, 1957; Viveros, 1975). Cette fusion est rapidement suivie d'une micropinocytose ( Holzman et al., 1973). Ce dernier phénomène est responsable de la formation d'une nouvelle vésicu­

le.

Comme les surfaces membranaires vésiculaires et cellulaires portent des charges négatives, il est nécessaire de diminuer la barrière électrosta­

tique existante, afin que les deux membranes puissent entrer en contact et fusionner ( Mathews et al., 1972; Dean, 1975).

Dans le cas de la glande adrénalo-médul 1 aire, il a pu être montré que la

(25)

charge négative des vésicules "chromaffines", contenant les catéchol- amines, provient principalement des groupes carboxyliques portés par des protéines localisées sur la surface externe de la membrane vésiculaire.

Il a été de plus constaté que :

- les protéines acceptrices de groupes méthyle transférés par la ou les protéine méthylases II endogènes, se localisent à la surface de ces vésicules ( Diliberto et al., 1976)

- la carboxyméthylation de ces protéines des vésicules "chromaffines"

provoque, dans une large mesure, leur détachement de la membrane vési­

culaire, exposant ainsi des couches lipidiques ( Diliberto et al., 1976).

Ces deux observations permettent de penser que la carboxyméthylation pour­

rait intervenir dans deux étapes capitales du mécanisme de la fusion membranaire : la neutralisation des charges électrostatiques et la mise à nu de couches lipidiques.

Les phénomènes de chémotaxie pourraient, eux aussi, impliquer la carbo-

>0'méthylation de certaines protéines.

Il a été montré que, chez les bactéries flagellées, la S-adénosyl-L-mé- thionine est requise pour obtenir une réponse à des stimuli chémotacti- ques ( Aswad et Koshland, 1975; Larsen et al., 1974a).

Chez E.Coli on constate, pendant la chémotaxie, un accroissement de la méthylation d'un groupe de protéines membranaires ( Kort et al., 1975;

Springer et al., 1977). Cette méthylation porte au niveau d'un ou de plu­

sieurs résidus d'acide glutamique.( Kleene et al., 1977). La méthyla­

tion de ces protéines provoque leur détachement de la membrane cellulai­

re ( Kort et al., 1975).

D'un point de vue macros.copique, on sait que la chémotaxie dépend du sens de rotation du flagelle ( Larsen et al., 1974b). Lorsque celui-ci tourne dans le sens inverse des aiguilles d'une montre, la bactérie avance "cor­

rectement". Au contraire, quand la flagelle tourne de façon "horaire", le microorganisme a un mouvement aléatoire, désordonné.

Si la rotation du flagelle est le résultat d'interactions électrostati­

ques entre des charges portées par la membrane cytoplasmique et le fla­

gelle, on peut concevoir que la neutralisation ( et le déplacement) des charges négatives fixes, contenues dans l'aire de la membrane cellulaire entourant le flagelle, puisse affecter de façon transitoire le sens de rotation ( Diliberto et al., 1976). Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été explicitement prouvée.

(26)

e) Le cytochrome c

Le cytochrome _c est une protéine qui s'intégre dans la chaîne respi­

ratoire oxydative et que l'on retrouve associée à la membrane mitochon­

driale interne de tous les Eukaryotes.

Cette protéine est l'une de celles qui, indiscutablement, a été le mieux caractérisée et étudiée, tant du point de vue de sa structure spatiale, que de sa séquence en acides aminés ou que de son activité biologique.

La fonction biologique de cette'hémoprotéine est identique chez toutes les espèces étudiées. Quelle que soit leur origine, les cytochromes c possèdent, en effet, des valeurs de potentiel Rédox ( + 250 mV) quasi identiques et ils réagissent de façon fort similaire avec la cytochrome _c oxydase extraite de sources variées. En outre, les similitudes consta­

tées au niveau des structures primaires et tertiaires indiquent que les cytochromes _c n'ont subi aucun changement important tout au long de l'é­

volution chez les Eukaryotes ( Dickerson et Timkovich, 1975).

Principalement grâce aux travaux du groupe de Smith et Margoliash et de celui de Boulter ( ce dernier s'étant particulièrement intéressé aux cytochromes _c issus de végétaux), les séquences en acides aminés de près d'une centaine de cytochromes _c, issus de divers organismes, ont été déterminées ( Figure 2).

Certaines caractéristiques de la structure covalente du cytochrome _c s'avèrent identiques chez toutes les espèces étudiées. C'est ainsi que :

- le noyau hémique est lié de façon covalente, par des ponts thioéther, aux cystéines situées en position 14 et 17^.

Le cinquième ligand du fer hémique est le résidu histidine 18, qui est trouvé strictement invariant dans tous les cytochromes _c. Il en est de même pour la méthionine 80, dont le soufre semble être le sixième ligand du fer hémique ( Dickerson et al., 1971; Ando et al., 1965).

- le cytochrome c des vertébrés comprend 103 ou 104 résidus, et son extré­

mité N-terminale est acétylée.

Les hémoprotéines extraites d'Ascomycètes et de plantes supérieures comprennent 4 à 8 résidus supplémentaires, localisés dans la partie N- terminale de la molécule ( Smith, 1970). Les seuls cytochromes c de non vertébrés qui soient N-acétylés sont ceux extraits des plantes su-

^ La numérotation est faite sur la base de la séquence en acides aminés des cytochromes c d'animaux.

Figure

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Références

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