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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Polastro, E. (1978). Etude de la méthylation du cytochrome c chez Saccharomyces cerevisiae (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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î1
BIBUOTHËQUE DE CHIMIE UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DES SCIENCES SERVICE DE CHIMIE GENERALE 1
Etude de la méthylation du cytochrome ç chez Saccharomyces
Cerevisiae.
Thèse présentée pour l'obtention du titre de Docteur en Sciences
POLASTRO Enrico 1 978
2 5 SE?. 1978
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLESfièp:...
FACULTE DES SCIENCES SERVICE DE CHIMIE GENERALE I
Dans le cadre de la synthèse peptidique en phase solide, nous proposons de modifier le groupe de liaison peptide-polymère, dans le but d'augmenter la spécificité de l'étape de clivage au terme de la synthèse.
Elude de la mélhylalion du cylochrome ç
chez Saccharomyces Cerevisiae.
Thèse présentée pour l’obtention du titre de Docteur en Sciences
POLA5TRO Enrico
1978
réalisation de ce travail, est une tâche difficile, vu leur grand nombre.
Que les personnes que j’aurais involontairement oubliées dans ces remerciements me pardonnent, elles peuvent être assurées de ma recon
naissance.
Je tiens à remercier tout particulièrement Monsieur le Professeur J. Léonis, non seulement pour la confiance dont il a bien voulu m’ho
norer en m’acceptant dans son laboratoire, en soutenant mes demandes auprès du F.N.R.S., en me confiant des taches d’enseignement, mais aussi, et surtout, pour la marque indélébile que la qualité hors pair de son enseignement a laissé dans mon esprit.
Tous mes remerciements vont aussi à Monsieur le Professeur A.G.
Schnek pour l’intérêt constant qu’il a porté à nos travaux, pour toute sa gentillesse et pour tout ce qu’il a fait pour nous.
Je remercie très vivement les Professeurs van Gelder et Slater, de l’Université d’Amsterdam, pour leur hospitalité et leur aide précieuse lors de la réalisation de certaines expériences.
Ma gratitude va aussi à Monsieur le Professeur E. Margoliash pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et accepté de discuter nos résultats.
Un merci tout particulier doit être adressé au "numéro 2" de la méthylation, le ^ofesseur W.K. Paik, de la Temple University de Phi
ladelphie, pour son accueil inoiblidble, sa gentillesse, son enthou
siasme et ses conseils judicieux. Il restera toujours à nos yeux l’image même de l’homme épanoui sous toutes les facettes. Son aide, ainsi que celle de son équipe, a été précieuse pour la réalisation d’une partie importante de ce travail.
De nombreuses expériences ont été rendues possibles et plus aisées grâce à l’aide fournie par les membres du Département de Biologie Mo
léculaire de Rhode-St-Genèse. Je remercie tout spécialeimnt Monsieur le Professeur A. Sels qui m’a guidé, conseillé et critiqué de façon constructive tout au long de ce travail. Merci aussi aux Professeurs Barel, Bumy, Schram et aux Docteurs Marbaix et Huez.
Merci aussi aux Professeurs Lontie et Préaux et au Docteur Gielens de la K.U.L. pour leur aide lors des études de dichroîsme circulaire.
Ma reconnaissance va aussi aux Professeurs Christophe et Strosberg et à Monsieur Kuzner pour leur aide lors de certaines analyses en a- cides aminés.
Que Monsieur le Professeur Kram soit aussi assuré de ma gratitude pour sa compréhension et pour m’avoir guidé lors de mes premiers "pas"
scientifiques.
Ma plus grande chance a été d’avoir un "CHEF" incomparable.
Que le Docteur Marc Melchior Deconinck soit assuré de ma plus sincère reconnaissance et de toute mon estime pour sa gentillesse, ses efforts, sa patience, sa constance sa probité, son aide compétente, efficace et inestimable et ses conseils et encouragements judicieux.
tes qualités, ce travail aurait été mille fois plus pénible.
Merci aussi au Docteur Dépassé pour les recherches bibliographiques qui ont servi de base au sujet de cette thèse.
Nous ne savons comment exprimer de façon adéquate nos sentiments envers le Docteur Looze, qui nous a proposé ce travail et nous a fait partager ses ccnnaissances de la dénaturation et de la fluorescence des protéines. ' Son contact nous a permis de mieux découvrir certains aspects de la nature hunaine. Qu'il soit assuré que nous avons appré
cié, nous apprécions et nous apprécierons toujours à leur plus exacte valeur autant ses conseils que sa oonpétence morale et scientifique.
Bien qu'il ait déjà été remercié plusieurs fois, un merci tout particulier doit aller à mon complice des moments les plus noirs et
les meilleurs de ma thèse : "Barbapoux" Mailier.
Son intelligence extrême, son sens exacerbé de l'humour et de la cri
tique, ainsi que ses prises de positions et ses jugements nets et tranchés, m'ont grandement aidé à m'apercevoir de ma naiveté.
Merci aussi au Docteur Strebelle et au Professeur Van Den Brill.
Que tous les autres membres du Service de Chimie Générale I, et en particulier les Docteurs Sels et Vande cas sérié, soient, eux aussi, assurés de ma gratitude.
Un grand merci aussi à toute l'équipe du Secrétariat.
Ce travail a été rendu possible par l'appui financier du F.N.R.S.
Que Monsieur le Recteur, Messieurs les membres du Jury de la XI ème commission, et en particulier Monsieur le Professeur H. Chantrenne, et Monsieur P. Levaux, soient assurés de ma reconnaissance pour la confiance qu'ils m'ont ainsi accordée.
Merci aussi à Monsieur E. Klein.
Enfin, last but not least, merci à mes parents et à Myriam pour la patience avec laquelle ils m'ont supporté et l'aide inestimable qu'ils m'ont apportée, tout au long de la durée de ce doctorat.
INTRODUCTION
RESUME ET BUT DU TRAVAIL
CHAPITRE I : Isolement et purification des formes méthylée et non méthylée de 1 'IsO-1-cytochrome c de Saccharomyces cerevisiae
CHAPITRE II : Etude physico-chimique des formes méthylée et non méthylée du cytochrome £ de levure
CHAPITRE III : Etude de la susceptibilité à la protéolyse des formes méthylée et non méthylée du cytochrome a de levure
CHAPITRE IV : Interactions entre le cytochrome c_ et la membrane mitochon
driale
CHAPITRE V : Purification et caractérisation de la cytochrome c méthylase de levure
CONCLUSIONS ET DISCUSSION GENERALE REFERENCES
ANNEXE I : Synthèse des dérivés ^-N-mono, di et triméthylés de la lysine ANNEXE II : Purification and some molecular properties of protein methy-
lase II from equine érythrocytes
a) Avant-propos b) La méthylation
a) La méthylation des protéines
d) Rôle biologique de la méthylation des protéines e) Le cytochrome c
a) Avant-propos
La structure covalente d'une protéine, déterminée par la séquence de ses acides aminés, peut, après la biosynthèse des liens peptidiques, su-
in vivo des modifications chimiques.
Ces dernières résultent de la fixation de groupements ou de radicaux spé
cifiques sur les chaînes latérales de certains acides aminés de la protéi
ne.
Les réactions d'hydroo'lation, phosphorylation, acétylation, adénylation, adénosine diphosphate ribosylation, glycosylation, méthylation..., appar
tiennent à cette famille des réactions dites de modification chimique.
Au cours de ces dernières années, les réactions de modification post-traductionnelles de la structure covalente des protéines ont été particulièrement étudiées.
Ces études ont mis en évidence la diversité des radicaux ajoutés et des sites visés, l'universalité et la spécificité des modifications, ainsi que le nombre et la variété des protéines concernées ( Tableau I).
Dès la découverte de ce phénomène, une question fondamentale s'est imposée à tous : quel pouvait bien être le rôle biologique de ces modi
fications ?
Il apparaît sans doute illusoire de prétendre pouvoir donner une réponse simple et unitaire à un problème aussi vaste et complexe.
De multiples hypothèses concernant le rôle des modifications post-tra
ductionnel les sont fréquemment avancées.
Dans certains cas précis, divers travaux ont permis de fournir des ébau
ches de réponse. Ainsi, il a pu être montré que la phosphorylation, l'a
dénylation, 1'adénosine diphosphate ribosylation, et l'échange entre ponts disulfures et thiols libres de certaines enzymes jouent un rôle de régu
lation sur leur activité enzymatique ( Holzer et Duntze, 1971).
Cependant, dans la majeure partie des cas, le rôle de la modification chi
mique des protéines demeure largement incompris et obscur. Tel est, en
tre autre, le cas en ce qui concerne la méthylation.
TABLEAU I : Acides aminés et dérivés des acides aminés que l'on retrouve dans les protéines et les peptides ( Uy et Wold, 1977).
ACICES AMINES DERIVES DES ACIDES AMINES DE BASE
DE BASE
Alanine Arginine
Asparagine Acide Aspartique Cystéine
Acide Glutamique Glutamine Glycine Histidine
Isoleucine Leucine Lysine
Métnicnine Phénylalanine
Rroline
Sérine
Thréonine
Tryptophant Tyrosine
Val ine
N-Acétylalanine;N-méthylalanine
N^-MethylarginineiN^.N^-diméthylarginine.N^iN^ -diméthy1 arginine;ADP-ribosylarginine citrulline;ornitine;arginyl-protein (a)
Acide aspartique;N^-(N-acétylglucosaminyl )asparagine;N'(5-asoartyl)lysine (c) Amide s-aspartlque;acide N-acétylaspartique;acide 0 -phosphonoaspartique (d)4
Cystine (c):S-mercaptocystéine (d);S-galactosylcystéine;S-glucosylcystéine;S-cystéi- nyl-hème;8 a-(S-cystéinyl)flavin thiohémiacétal;dehyoroalanine (d,?)
Amide 2-glutamique;aeiqe Y-carboxyglutamique;acide r-méthylglutamique Acide glutamique;glutaminamioe;acide Byroglutamioue;N^-(v-glutanyl)lysine (c) GlycinamideiN-acétylglycine;N-fonnylglycine:N-glucuronylglycine
Histidinamidei’-méthylhistidinejT-phosphonohistidine (d);T-Dhosphonohistidine (d);
4-iodonistidine;5a-(T-histidyl)flavin;8o-(7-hlstidyl)flavin
Leucyl-protéine
N'-Méthyllysine:N‘-diméthyllysineiN‘-triméthyllysine;N'-ohosohonolysine (d);N‘-acétyllysinei N‘-(pnosphopyriooxyl)lysine;N‘-l iooyllysineiN^-oiotinyllysine;N“-murein-lysine;allyllysine;
dehydrolysinonorleucine (c);lysinonorleucine (c);allysine aldol (c);dehydroallysine aldol (c);
dehyoromerodesmosine (c);merodesmosine (c);dihydrodesmosines (c);desmosines (c);tetrahy- dpodesmosines (c) ;( al lysine aldol )histid ine {c);à-hyoroxylysine trimé thy 1 hydroxylysine;
0"^(â-D-galactosyl jnydroxylysine ;£-hydroxyanysine;i-(denyarohydroxylysino)norleucfne (c) ; hycroxylysinonorleucine (c);(dehydronydroxylysino)hydroxynorleucine (c);(hydroxylysino)hydro- xynorleucine (c);synaesine (c);dehydrohydroxymerooesmosine (c);(dehydrohistidino)hydroxyme- rodesmosine (c);(hydroxyallysinealdol)histidine (c)
Héthloninamide;N-acétylméthionine;N-formylméthionine.
Phénylalaninam1de;£-hydroxyphénylalanine (d);0®-glycosy1-3-hyOroxyphénylalanine;?hênylalanyl- protéine (a)
Pjolinamide;3,4-dihydroxyoroline (d);4-hydroxyoroline;3-hydroxyproline;N-diméthyloroline;
O’-arabinosylhydroxyprol ine;0‘*-galactosylhyaroxyprol ine
Pyruvate;N-acétylsérine;0'-phosohonosérine;0°(ADP-Ribosy1-phosphono)sérine;0^-méthy1 sérine (d) ; 0‘'-(4' -snospncijooantetheine )sérine ;3'-xylosyl sérine ;C'-mannosylsérine;0°-(N-aceîylgal actosa- minyl)sérine;0‘*galactosyl sérine.
2-kétobutyrate;N-acetylthréonine ;0°-ohospnonothréonine;0“-méthylthréonine (d);0^-fucosylthréo
nine ;0°-mannosyl thréonine;0“-(N-acéty!galactosaminyl)thréonine;0'-galactosylthréonine.
A
Tyrcsinamide; tyrosine 0 -sulfate;3-iodotyrosine;3,5-diiodotyrosine;3-cnlorotyrosine;3,5-dichlo- roty rosine ;3-bromotyrosine;3,5-dibromoty rosine;5-ororao,3-cnlorotyrosine;3,j,3'-triiodothyronine;
3,5,5' ,3'-tetraiodot.hyronine;3,3' -bityrosine;3,3' ,5' ,3' ' -tertyrosine (c) ;0 -adênylyl tyrosine;
0*-ur1dylyltyrosine;s-hydroxytyrosine (d) ;0"-glycosyl-s-hydroxytyrosine;d1hydroxyohenylalani- ne (d);protéinyltyrosine (a)
Val inamide;N-acétylvaline
a) Le terme aminoacyl-protéine ou protéinyl-aminoacide représente les dérivés produits par transfert direct du radical aminoacyl de l'ami- noacyl-t-RNA ou de l'acide aminé libre sur des protéines acceptrices b) Ce dérivé constitue une réticulation de la chaîne peptidique
d) L'existence de ces dérivés n'a pas été prouvée de façon univoque.
Elle est présumée sur la base d'arguments indirects.
b) La méthylation
De nombreux composants cellulaires se sont révélés être méthylés in vivo. Ainsi, l'on sait que la méthylation affecte le DNA, les divers types de RNA, certains polysaccharides, des alcaloïdes, les catécholami- nes, la sérotonine, les protéines...
Si une grande variété de substances sont susceptibles d'être méthy- lées in vivo, on n'a pu découvrir avec certitude, jusqu'à présent, qu'une seule molécule donneuse de groupements méthyle : la S-adénosyl-L-méthio- nine. En effet, à l'exception des réactions de méthylation impliquées dans la biosynthèse de la méthionine, la quasi totalité des réactions de transméthylation biologique connues font appel à ce seul substrat
( Cantoni, 1975 et 1976). La possibilité, qui avait été suggérée en 1972 par Laduron, que certaines méthylases utilisent le N -méthyltétrahy- 5 drofolate,est actuellement fortement contestée ( Cantoni, 1976).
Ces dernières années, divers groupes de recherche se sont efforcés de préciser le rôle biologique de la méthylation.
La variété des liaisons chimiques formées, l'universalité, la spécifici
té, ainsi que le coût énergétique élevé ( l'activation de la méthionine en S-adénosyl-L-méthionine requiert une mole d'ATP ( Cantoni et Durell, 1953)) font apparaître comme fort peu probable la possibilité que ces
réactions représentent simplement une sorte de "trop plein", pour évacuer d'éventuels excès cellulaires en groupements méthyle.
Bien qu'affectant une grande variété de constituants et suscitant, dès lors, de multiples études, on constate . en général, que seules des hypothèses ont été formulées pour expliquer le phénomène de la méthyla
tion et son rôle biologique.
Dans le DNA de plusieurs espèces bactériennes on trouve de la 5-mé- thylcytosine et de la N-6-méthyladénosine. Ces bases ne sont pas incor
porées comme telles lors de la réplication du DNA, mais résultent de l'action de DNA méthylases, qui modifient des sites spécifiques de cette macro
molécule ( Gold et Hurwitz, 1963). Il a été montré que certaines de ces
enzymes, en reconnaissant et méthylant des séquences du DNA endogène, le rendaient résistant aux enzymes de restriction intracellulaires ( Arber, 1974).
Cependant, la majeure partie des bases méthylées présentes dans le DNA bactérien semblent sans rapport avec les processus de restriction ( Ma- rinus et Morris, 1969).
Le DNA nucléaire animal et végétal peut lui aussi contenir des quantités importantes de 5-méthylcytosine ( dans le DNA nucléaire de plante ce nu
cléotide peut représenter jusqu'à 30 % des cytosines totales ( Kalousek et Morris, 1969)). Malheureusement, chez ces organismes, le rôle de ce nucléotide n'est pas établi.
La méthylation des RNA est beaucoup plus complexe que celle du DNA.
La modification peut porter, non seulement au niveau de la base ( on con
naît plus de dix dérivés de bases méthylées dans les seuls t RNA)^ mais aussi au niveau de la fonction hydroxyle située en position 2 du cycle ribose ( pour une revue voir Nau, 1976).
Fort peu de choses sont connues en ce qui concerne la méthylation des RNA.
On sait qu'une augmentation importante de l'activité t RNA méthylase se produit dans les cellules cancéreuses ( Tsutsui et al., 1966). Cependant, cette constatation n'a pas encore pu être reliée à un rôle biologique précis. Par ailleurs, des résultats clairs n'ont pu être à ce jour ob
tenus dans l'étude de l'effet de la méthylation du t RNA sur sa fonction biologique principale : le transfert d'acides aminés lors de la biosyn
thèse des protéines.
L'hypothèse selon laquelle les nucléotides méthylés conféreraient au t RNA une rigidité moindre ou une résistance accrue envers les ribonu- cléases a été avancée ( Uchida et Egani, 1967).
Depuis quelques années, on sait que, chez les cellules animales et leurs virus, la formation du m RNA s'accompagne de façon générale du blocage ( en anglais "the capping") de leur extrémité 5' ( Adams et Cori, 1975;
Lavi et Shatkin, 1975).
Dans les cellules de mammifère les structures 5' terminales sont du type m^G ( 5') pppXpYp oû X et, dans certains cas Y, sont des ribonucléosides méthylés en position 2'-0. Dans les m-RNA des virus d'animaux X est sou
vent de la 2'-0 méthyladénosine ( Abraham et al., 1975), tandis que dans les virus de plante, tel le virus de la mosafque du tabac, X est de la guanosine ( Zirmiern, 1975).
La généralité des "caps" 5'-terminaux et de la méthyl-7-guanosine chez les m RNA d'Eukaryotes permet de penser que ces structures pourraient jouer un rôle important dans le métabolisme cellulaire de ces macromo
lécules. Il a été, entre autre, suggéré que la méthylation et le "capping"
pourraient constituer des étapes dans la maturation du m RNA cytoplasmi
que ( Rottman et al., 1974).
Les travaux du groupe de Shatkin semblent indiquer que les m-RNA du réo- virus, du virus de la stomatite vésiculaire et des réticulocytes de la
pin, possédant un "cap" complet mais non méthylé au niveau de la guanine terminale, ne sont pas traduits dans des extraits acellulaires de germe de blé ( Shatkin et al., 1976). Ces m RNA peuvent être méthylés au ni
veau de cette base par simple addition de S-adénosyl-L-méthionine au sy
stème. Cette modification suffit à rendre les m RNA "actifs et traducti- bles", la méthylation paraissant indispensable pour la fixation du messa
ger au ribosome ( Shatkin et al., 1976).
Dans les cellules eukaryotes, le r RNA est synthétisé sous forme d'une longue molécule de RNA précurseur. Immédiatement après, ou pendant la transcription, des groupements méthyle sont introduits sur des sites spécifiques de la chaîne polyribonucléotidique, principalement au niveau de la fonction 2'-0 du ribose ( Klootwijk et Planta, 1973). A des stades ultérieurs, la méthylation peut porter aussi au niveau de quelques ba
ses ( il y a, entre autre, formation de N-6-diméthyladénine ( Zimmerman, 1968)) ( Klootwijk et al., 1972; Maden et Salin, 1974).
Bien que la fonction biologique exacte de la méthylation du pré-r RNA ne soit pas connue, on constate que les régions non méthylées du RNA 45s sont dégradées pendant les processus de maturation, tandis que les segments méthylés sont conservés ( Grummt, 1977).
Une observation intéressante a été faite sur des mutants de E. Coli ka- sugamycino-résistants. Il a été constaté que le RNA ribosomial 16s de la sous-unité 30s possède chez les souches sensibles à cet antibiotique de la N-6-diméthyladéninejproche de l'extrémité 3'. Cette base n'est pas modifiée dans la souche kasugamycino-résistante ( Helser et al., 1972).
Les réactions de méthylation enzymatique des carbohydrates ont été mises en évidence en 1967 par Kauss et Hassid ( 1967a).
Ces auteurs ont montré que des extraits d'épis de maïs étaient suscepti
bles de transférer le radical méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine sur 1'hémicel1ulose B, en formant, notamment, de l'acide 4-0-méthyl-D-glu- coronique. Il a également été montré que les 0-méthyl esters de la pectine étaient formés enzymatiquement après la biosynthèse de la macro
molécule ( Kauss et Hassid, 1967b). La méthylation des groupes carbo- xyles des pectines joue un rôle important dans leur fonction biologique.
En effet, leur capacité d'échanger des ions, de retenir l'eau et de for
mer une trame par des liaisons ester, ioniques ou des ponts hydrogène, dépend, en grande partie, de leur degré de méthylation ( Deul et Stutz, 1958; Henghin, 1958).
La méthylation des molécules de petite taille est, elle aussi, acti
vement étudiée. Plusieurs de ces "petites" molécules méthylées in vivo sont pharmacologiquement actives ou jouent un rôle physiologique impor
tant, comme, par exemple, les catécholamines dans le système nerveux.
Dans certains cas^un parallèle entre méthylation et activité biologique a pu être établi. Ainsi on sait que la codéine, éther méthylique de la morphine ( position 3), doit être déméthylée pour pouvoir exercer son effet opiacé. L'0-méthylation de l'adrénaline et de la noradrénaline est catalysée par la catéchol-0-méthyltransférase ( COMT). La méthyla
tion désactive ces importants médiateurs chimiques du système nerveux.
Cette désactivation est complémentaire de celle produite par la mono
amine oxydase ( MAO) ( Wollermann, 1970).
La sérotonine ( 5-hydro>o'tryptamine) peut être méthylée in vivo en po
sition 5-0. Certaines anomalies de la méthylation de la sérotonine sem
blent pouvoir être mises en parallèle avec la schizophrénie ( Weil-Mal- herbe et Szara, 1971). Cependant, cette constatation n'a pu encore être expliquée au niveau moléculaire.
c) La méthylation des protéines
De toutes les modifications post-traductionnelles subies in vivo par les protéines, la méthylation apparait comme étant une des plus com
plexes, tant par le nombre d'acides aminés qu'elle touche que par son universalité ( Tableau II).
C'est en 1929 qu'Ackermann découvrit le premier acide aminé méthylé : la 1-méthylhistidine ( Ackermann et al., 1929). Ce dérivé fut identifié chez l'oie, après hydrolyse de l'ansérine, dipeptide extrait du muscle de cet animal.
Par la suite, de nombreux acides aminés basiques méthylés, comme, par exemple, les différentes e-N-méthyllysines et cj-méthylarginines, ont été mis en évidence à l'état libre dans les urines de plusieurs animaux.
Il a été constaté que pratiquement tous les acides aminés pouvaient exi
ster Jn_\n^ sous forme de dérivés méthylés ( Meister, 1965). Certains, comme ceux provenant du tryptophane, de la leucine ou de 1'hydroxypro- line, ne sont pas repris dans le Tableau II. Ils sont trouvés essentiel
lement dans des antibiotiques ou à l'état libre dans les organismes su
périeurs.
La présence de dérivés méthylés d'acides aminés a été établie dans de nombreuses protéines issues de différentes espèces ( Tableau II).
Une étude de Matsuoka ( 1972) sur la composition du matériel protéique total des fractions subcellulaires d'organismes allant de 1'Eubactérium aux mammifères a, entre autre, mis en exergue l'omniprésence des déri
ves méthylés de l'arginine et de la lysine; seul 1 'Eubactérium semble dépourvu d'arginines méthylées.
La grande majorité des auteurs pense que la méthylation des protéines est un phénomène post-traductionnel se produisant soit au niveau du poly
peptide naissant soit au niveau de la protéine complète.
On est parvenu à cette conclusion en s'appuyant sur diverses constata
tions et notamment :
- la présence de e-N-triméthyllysine dans la protéine flagellaire de Sal
monella résulte d'un déterminant génétique autre que celui spécifiant la séquence de cette protéine ( Stocker et al., 1961)
p-h-ffonomélhvl IvSine ( 195?) Çh,MHCH2CH2CH2CH-.CmNH2 )COjH Acide aminé 1ifcre Urine htfMine
Cerveau Plasma
Matsuova et aL.. 1969 Perry et al.. 1963 Asatoor, 1969 Opsme Rétine de boeuf Reporter et Reed, 1972 Histone Thymus. 00is. germe
oe blé ..• Murray, 1964 Protéine ^laçellaire Saimonella Ambler et Rees. 195?
Protéines nbosomiales r.coii Teriwrst et aL.. 1972
Mvosine Muscle Hardy et Perry. 1969
Actine Amioe aeihing et Kom, 1970
<“N'd’"»éthvllvsin€ ( 1967)
«ÇH3)-ïICH,CH2CH.CH2CH(HH2)C02H
Acide aminé libre Urine, plasma Kakinoto ot Akdzawa. 1970 Histone Thymus oe veau Paik et Kim, 1967 Protéine flaoellaire Saimonel1 a Glazer et al., 1969 Myosine Muscle Kuehl et Adelstein; 1970
Actine Amibe Weihing et Kom, 1970
Protéine «icrofibrillisire Muscle Hardy et al., 1970 Opsine Rétine de boeuf Reporter et Reed, 197?
ï-N-triméthyllysme { 1964) (ch.i.9*ch.:h.ch,ci4CH(NM2)C0,H Acide aminé 1ibre
(laminine)
Plantes Urine htanaine
Takemoto et al., 1964 Kakimoto et Akazawa, 1970
Histone Thymus Hembel et a1., 1968
Cytochrome _c Germe de blé Ascomycètes Protozoés
OeLâftoe et al., 1969 • DeLange et al., 1970 H111 et al., 1971
HyOSine Muscle Mai-dy et al.. 1970
Actine Amibe Heihing et Kom, 1970
Protéines Ribosomiales E.Coli Chanv et al.. 1974 Calcium dépendent
reçulatory protein 0^ cyclic nucleotide
onosphodiesterase Testicules de rat Jackson et al., 1977
c»N-triméthy1»5'hydrtixv lys ine l 19701 )3»*cHjCH(0H)cHjCHjCH(Km, jcOjH
Paroi cellulaire Diatomées Nakajima et Vulcani, 1970
^N-méthylnmithine ( 1969)
ÇHjhHCH.CH^CKjCH/NH^^CO-H .
Acide aminé 1ibre cerveau de boeuf Matsuoka et al., 1969
lf* -monométhylaroinine ( >M7)
ÇH.,NKC (NH )NHCH2CH2CH2CH(NH2 )C0^H
Histone Thyaius de veau Paik et Kim. 1967 Protéine acide Noyaux et foie de rat Friedman et al., 1969 Protéine basicue
encépnalitoçênique Hyéline Baldwin and Carnegie. 1971 H*. N**, et N**, N'* diméthvlarQinine ( 19671
ÇH3mC(MÇH3)HHCH2CH.CH2CH(HH,)C02H ou (ÇHj,l2Îir(NH )nhCH-CH2CH2CH(NH2 )C02H Acide aminé 1ibre Urine. ser\mi Kakimoto et Akazawa, 1970 Histones Thymus de veau Paik et Kim, 1967 Myosine Muscle gambaire Reporter et Corb*«, 1^73 4 Protéine basique
encépha11toçénloue myéline Baldwin et Carnegie. 1971 Protéines nucléaires
non histoniques noyaux de foie Boffa et al., 1977 l“Méthvlhistidine ( 1929)
Ansfrine Muscle de !'o le Ackermann et a!., 1929 Acide aminé libre Urine canine Westall. 1952
Ac>o« aminé 1ibr«
Myosin*. Actin^
Histone Oçsint
Î954)
Urine humaine Muscle Erythrocyte aviaire ftétine de boeuf
Tanan et al. » 1964 Johnson et al., Î967
Gershey et al.. 1969 Reoorter et Reed. 1972 W-méthylolutamine ( 1977)
C0jHCH(»W2 JCH^CH^COMHÇKj
Protéine Ribosoieiale LU E.Coli Lhoest et Colson. 1977 Ester méthylioue de Tacide dlutaHoue ( 1977)
NH^CH(COjH)CHjCH-COOÇH.
Protéine membranaire E.Coîi Kleene et ai.. 1977
C-e nombreu* arçtwnts indirects indlouent fortement la orésence a'esters néthy- liQues de protéines in vivo, dans le çlooule rouoe. l'hypophvse. le ribosome oe E.Coli---{ Kim et al., 1977; Kim, 1973 ; Diliberto et Aielrod, 197S).
Ether méthynoue de la sérine ou fet) de la thréonine ? ( 19751 a30CHjCH(NH-)CO^H et 2!30CH2CH2CM(MHj )C02H
Activité prctéine-
néthyiase DNA-deoendente Sperme de taureau Sheid et Pedrinan, 1975
V-h-méthylalanine ( 1977) ÇH3WCH{CH3)C02H
Protéine ribosomiale E.Coli Cher, et al-, 1977 K »W-méthylméthionine { 1977)
CH.SCKjCH^CH(MHÇH,)C02H
Protéine ribosomiale E.Coli Chen et al., 1977 H-W-diwéthyloroline ( 1977)
Cytochrome Cnthidia Oncooelti Pettiçre- et Siaith. 1977 -W-méthylphènylalanine ( 1978)
Pi1ine Pseuoomona s
Aerugifiosa Frost et.al., 1978 N-triwéthylalanine ( 1977)
Prottir» riboso...!, f.CoH ,t . I.. 1977
- la méthylation des histones dans les noyaux de thymus de veau, suivie par incorporation du groupe méthyle de la L-( méthyl méthionine, est insensible à l'action de la puromycine ( Allfrey et al., 1964) - la e-N-méthyllysine, administrée à des systèmes capables de réaliser
des synthèses protéiques, n'est incorporée dans aucune fraction suscep
tible d'être précipitée par l'acide trichloroacétique ( Kim et Paik, 1965)
- de la e-N-méthyllysine radioactive est trouvée dans les ribosomes lavés de Blastocladiella Emersonii, lorsqu'ils sont incubés en présence de S-adénosyl-L-méthionine marquée ( Comb et al., 1966).
- la purification de plusieurs protéine méthylases a été réalisée.
La protéine méthylase I ( S-adénosyl -L-méthionine : protéine-argini
ne méthyltransférase, E.C. 2. 1. 1. 23), la protéine méthylase II ( S-adénosyl-L-méthionine : protéine-carboxyl-O-méthyltransférase, E.C. 2. 1. 1. 24) et la protéine méthylase III ( S-adénosyl-L-méthio- nine : protéine-lysine méthyltransférase, E.C. 2. 1. 1. 25) ont été, ainsi, isolées et caractérisées. Ces enzymes, qui ne sont pas inhi
bées par la puromycine, n'acceptent comme substrat que des protéines entières ou, au moins, des peptides d'une certaine taille ( Jamaluddin et al., 1976; Durban et al., 1978; Polastro et al., 1978b et 1978e).
Dans les systèmes étudiés jusqu'à présent^la méthylation semble être un phénomène hautement spécifique. Ainsi, sur les seize résidus de lysine que 1'Iso-I-cytochrome £ de levure comporte, un seul, celui situé en position 72, est méthylé ( DeLange et al., 1970). De même, une seule arginine, la 107, est méthylée dans la protéine basique en- céphalitogénique ( P.B.E.) ( Brostoff et Eylar, 1971; Carnegie, 1971).
La méthylation est également limitée aux résidus lysine localisés en position 20 pour l'histone H4 de thymus de veau, et en position 9 et 27 pour l'histone H3 extraite de ce même organe ou des testicules de carpe
( DeLange et al., 1969b; Hooper et al., 1973).
Grâce à des préparations enzymatiques appropriées, l'identité des sites méthylés in vivo et in vitro a pu être établie pour la P.B.E.
( Sundarray et Pfeiffer, 1973) et pour le cytochrome jc ( Polastro et al., 1978e).
Pratiquement, une méthylase distincte semble être requise par protéine, voire même par site méthylé.
Ainsi, par exemple, la protéine méthylase responsable de la méthylation du cytochrome _c chez Neurospora Crassa est incapable de méthyler les histones ( Nochumson et al., 1977). Au contraire, la protéine méthyla
se III extraite de noyaux de thymus de veau ou de cerveau de rat n'ac
cepte comme substrat que les histones ( Paik et Kim, 1971; Wallwork et al., 1977). De même, les protéines chromosomiales non histoniques ne semblent pas être méthylées par la même enzyme que les histones ( Wall
work et al. , 1977).
La spécificité élevée de la méthylation implique que l'enzyme méthylante reconnaisse soit la séquence, soit la conformation du site à modifier, soit les deux simultanément. Les éléments de réponse étant assez con
tradictoires, on ne peut, à ce jour, trancher en faveur de l'une ou de l'autre de ces hypothèses.
Ainsi, en raison de la conformation de 1'hémoprotéine, la lysine 72 du cytochrome £ semble être particulièrement accessible, et même située, selon certains auteurs, à un endroit privilégié ( Cantoni, 1975; Petti- grew et Smith, 1977). Par contre, la P.B.E. ne semble posséder en so
lution aucune structure secondaire définie ( Eylar et al., 1972).
L'ovalbumine dénaturée par chauffage n'accepte plus les groupes méthyle transférés par la protéine méthylase II extraite d'érythrocytes de rat ( Kim, 1974). Toutefois, une étude récente a permis de montrer que la protéine méthylase de thymus de veau accepte comme substrat la ribonu
cléase pancréatique dénaturée par chauffage et carboxyméthyléejOu cer
tains de ses peptides ( Jamaluddin et al., 1976). La méthylation de ces peptides n'est, cependant, efficace que si ceux-ci ont une taille raisonnable, de l'ordre de quatre résidus ou plus.
La spécificité et la spécialisation du système enzymatique requis pourrait suggérer un rôle biologique important pour les réactions de mé
thylation. Le maintien d'une telle machinerie, sans avantages pour la cellule, serait injustifié et, sans doute, contraire aux principes "ca
pitalistes" d'économie et d'efficacité auxquels la cellule nous a tant habitués.
d) Rôle biolog'ique de la méthylati-on des protéines
Le rôle biologique de la méthylation des protéines demeure large
ment mystérieux.
Dans certains cas, les processus de méthylation semblent pouvoir être mis en parallèle avec des événements cellulaires complexes comme, par exemple, la réponse à des stimuli hormonaux ou autres, l'exocytose, la contraction musculaire, la chémotaxie, la croissance cellulaire...
Tout comme d'autres modifications épigénétiques de la structure co
valente d'une protéine, il est permis de se demander si la méthylation n'est pas un phénomène de contrôle et de régulation de l'activité enzy
matique ou biologique du polypeptide.
Un tel rôle de régulation impliquerait une réversibilité des réactions de méthylation et, par là,un "turn-over" des groupes méthyle fixés sur la protéine.
Lors des réactions de méthylation des protéines, il y a formation d'une grande variété de liaisons chimiques ( Tableau II), dont la nature et la réactivité sont très différentes.
Ainsi, il est très difficile de concevoir la réversibilité, dans des con
ditions douces, d'une méthylation portant au niveau d'une arginine, d'une lysine ou d'une histidine. Au contraire, dans les protéines, les esters méthyliques des acides aspartiques et glutamiques peuvent être hydro-
lysés dans des conditions d'acidité proches du pH physiologique ( Kim et Paik, 1975).
Des études ont été réalisées afin d'établir si les groupes méthyle fixés au niveau des lysines dans les histones possédaient un turn-over indépendant de celui du polypeptide.
Il a pu être mis en évidence qu'une enzyme, 1'e-alkyl-L-lysine-oxygène- oxydoréductase ( E.C. 1. 5. 3. 4), appelée aussi e-alkyl1ysinase, est capable de déméthyler 1' e-N-méthyllysine dans les histones, en transfor
mant le groupe méthyle en formaldéhyde ( Kim et al., 1964; Paik et Kim, 1973). Les activités de la protéine méthylase III et de 1' e-alkyl- lysinase apparaissent à des moments différents du développement cellu
laire et, lors de la prolifération cellulaire, l'activité e-alkyllysina- se est très réduite, alors que l'activité méthylasique est stimulée ( Paik
et al. , 1975).
Malgré la découverte de cette déméthylase, la réalité d'un turn-over des groupes méthyle fixés au niveau des résidus lysine dans les histones est controversée. En effet, certains auteurs pensent que cette réaction de méthylation est irréversible ( Duerre et Lee, 1974; Honda et al.,
1975; Byvoet et al., 1972). D'autres, au contraire, semblent admettre un turn-over particulièrement lent de ces radicaux ( Paik et Kim, 1975).
Etant donné l'absence ou la lenteur extrême du turn-over, et en se basant sur le seul exemple des histones, il paraît peu vraisemblable de pouvoir attribuer à la méthylation des lysines, comme probablement aus
si à celle des histidines et des arginines, un rôle ou une participa
tion dans des "phénomènes transitoires" de contrôle ou de régulation.
Par contre, on pense que la méthylation des résidus glutamiques et aspar
tiques d'une protéine pourrait être directement impliquée dans des pro
cessus de régulation. Ce type de méthylation, en estérifiant des fonctions carboxyles, neutralise une éventuelle charge négative et la liaison
ester formée est facilement hydrolysable, même dans des conditions très douces ( Kim et Paik, 1975).
Cette modification chimique pourrait être exploitée par la cellule selon des mécanismes comparables à ceux de la phosphorylation ( notons, cepen
dant, que la réversibilité de la carboxyméthylation n'implique pas né
cessairement l'existence d'une déméthylase, ce processus pouvant être obtenu par simple élévation du pH). Ces deux modifications font, en effet, apparaître des fonctions facilement hydrolysables et modifient
( de façon opposée, il est vrai) la charge nette du polypeptide.
S'il est difficile d'attribuer un rôle de régulation à la méthyla
tion des résidus lysine, arginine ou histidine, celle-ci pourrait, par contre, parachever de façon durable la finition du polypeptide et lui conférer des propriétés particulières et personnalisées, utiles pour sa fonction.
Il est connu depuis longtemps que la méthylation des résidus arginine et lysine augmente le caractère hydrophobe de l'acide aminé ( Tanford, 1962) et modifie, dans le cas des lysines, leur pKb ( Tableau III).
La triméthylation produit, en outre, un centre chargé positivement, quel-
TABLEAU III : pKb de la fonction e-amino de méthylés ( Paik et Kim, 1975)
la lysine et de ses dérivés
Lysine c-N-monométhyllys. e--N-diméthyllys. e-N-triméthyl.
pKb 3.37 3.22 4.2 /
les que soient les conditions de pH ou de polarité du milieu ( Paik et Kim, 1975).
Si sur la base du pKb la diméthylation a un effet contraire à la mono
méthylation, des expériences de résonance magnétique nucléaire semblent montrer que l'affinité des dérivés e-N-méthylés de la lysine pour les a- nions croit de façon proportionnelle au nombre de substituants méthyle présents ( Baxter et Byvoet, 1975).
La modification des résidus lysine pourrait, dès lors, intervenir pour moduler la liaison entre deux molécules, lorsque celle-ci se fait par
des interactions de type ionique. Ces dernières, par exemple, semblent impliquées dans les interactions histone-DNA ou cytochrome _c-cytochro- me _c oxydase.
Selon certains auteurs, la méthylation des lysines des histones pourrait faciliter leur liaison à d'autres macromolécules et favoriser la forma
tion de la chromatine ( Byvoet et Baxter, 1975; Paik et al., 1978).
Ainsi, il semblerait que les histones les plus méthylées soient les plus difficiles à extraire de la chromatine. De plus, les segments les plus
méthylés des histones ne sont pas détachés de la chromatine par un traitement à la trypsine, ce qui indiquerait que ces fragments sont for
tement liés au DNA, et, de ce fait, ne sont pas dégradables par cette pro
téase ( Byvoet et Baxter, 1975).
Selon certains auteurs, la méthylation des lysines et des arginines pourrait conférer au polypeptide une résistance accrue à la protéolyse ( Paik et Kim, 1971). Cette hypothèse n'a, à ce jour, jamais été te
stée sur des protéines méthylées in vivo. Les résultats obtenus avec des protéines méthylées chimiquement in vitro n'ont pu apporter des éléments de réponse cohérents.
A notre connaissance, il existe un seul exemple où le rôle de la méthylation des protéines a été clairement démontré.
En 1976, LaBadie et al. ont, en effet, montré que chez les mammifères, la carnitine provient du métabolisme des résidus de e-N-triméthyllysine fixés au niveau des protéines. Ces auteurs ont observé qu'après admini
stration à des rats d'asialo-fétuine, dont certains résidus lysine étaient triméthylés ( méthyl C) chimiquement, on constatait une dégradation ra14 pide de cette protéine au niveau des lysosomes hépatiques. De la e-N- triméthyl lysine est rapidement transportée dans le cytoplasme et, trois heures après l'administration de la fétuine marquée, 35 % de la trimé- thyllysine contenue dans cette protéine est métabolisée en carnitine.
Seule la triméthyllysine peut être métabolisée en carnitine, contrai
rement aux dérivés mono et diméthylés de cet acide aminé.
Sur la base de ces observations, Paik et al. ( 1977) ont proposé le schéma repris dans la Figure 1 pour expliquer la biosynthèse de la car
nitine chez les mammifères.
+
NHj N-(CH,),
CH, CH,
CH,
1 Protein methylase 1!I
1 CH, CH, 1
1 S>adcnosyl>L*mcihionine
CH, 1
CH, CH,
CO-NH-C-CO-NH H Proietn lysjne residue
+ N-(CH,h
I CH,
I CHOH
I CH,
I COOH Carnitine
Hydroxylation
...CO-NH-C-CO-NH...
H t-N-Trimeihyllysine in protein
+ N-(CH,|,
I CH,
I CH, CHjI
I COOH y-N-Trimcihylamino butyric acid
CH,-NH, I COOH Glycine
AtdolaK
Prolcolvsis
N-(CH,), I CH, I CH,
I CH,
I CH,
I CH-NH,
I COOH Free t-A'-trimelhyllysine
/
/
+ N-(CH,),
I CH,
I CH,
I CH,
I CHOH
I CH-NH,
I COOH /Î-Hydroxy-C'N- trimetliyllysine
L-Amino acid oxida<
or iransatninase (in A'. (Ta.t.tit)
N-(CH,), I CH,
I CH,
I CH.
I CH,
c-oI I C(X)H a-Kclo-c-A’-trimel)iyl- aminoitexanoïc acid
Figure 1 : Voie métabolique proposée pour la biosynthèse de la carnitine chez les mammifères ( Paik et al., 1977).
Le rôle de la triméthylation des résidus lysine des protéines, pourrait, dans ce cas,être comparable à celui de l'iodation de la thyroglobuline.
Rappelons que cette glycoprotéine, de masse molaire proche de 700 000, est d'abord iodée et puis complètement dégradée, afin de libérer un aci
de aminé modifié : la thyroxine.
Cependant, selon Paik et al.( 1977), il est fort peu vraisemblable que la méthylation des protéines ait lieu uniquement afin de créer un pool d'e-N-triméthyllysine, en vue de la synthèse de la carnitine.
On a vu que la méthylation des arginines et des lysines a, entre autre, comme effet de créer des centres hydrophobes qui pourraient s'a
vérer importants et utiles lors d'interactions, par exemple, du type protéine-1ipide.
La protéine basique encéphalitogénique présente une arginine méthylée en position 107. Cette protéine, qui représente 30 % du contenu protéi
que de la myéline, participe à l'interaction de ce complexe avec des composants lipidiques membranaires ( Eylar et al., 1969).
Selon Baldwin et Carnegie ( 1971) la méthylation du résidu 107 pourrait faciliter l'interaction myéline-lipides membranaires. Outre la création d'un centre hydrophobe, la méthylation de ce résidu pourrait stabiliser
la molécule dans une conformation privilégiée, propre à permettre une interaction accrue.
Le ribosome de E.Coli contient des nombreuses protéines méthylées ( Comb et al., 1966; Alix et Hayes, 1974). La méthylation porte non seu
lement au niveau des lysines, mais aussi sur les extrémités N-terminales de certaines protéines ( Chen et al., 1977; Lederer et al., 1977), sur
un résidu glutamine ( Lhoest et Colson, 1977), et, vraisemblablement, au niveau de résidus glutamiques et aspartiques ( Kim et al., 1977).
Des mutants, déficients au niveau de la méthylation de certaines pro
téines ribosomiales, ont pu être isolés ( Colson et Smith, 1977; Lhoest et Colson, 1977). Ces mutants semblent parfaitement viables, ce qui
indiquerait que la méthylation n'affecte grandement ni l'assemblage, ni le fonctionnement du ribosome.
Une corrélation a, cependant, pu être établie entre le degré de méthyla
tion et l'activité du ribosome. En cultivant des mutants de E.Coli met~ en présence d'éthionine, on a pu obtenir des ribosomes fonctionnel
lement altérés, contenant des protéines et du r RNA subméthylés, pouvant accepter in vitro des groupes méthyle provenant de la S-adénosyl-L-mé- thionine ( Beaud et Hayes 1971a et 1971b). La méthylation de ces ribo
somes permet une récupération rapide de leurs propriétés normales ( Beaud et Hayes, 1971b). Malheureusement, ce résultat, qui indiquerait un parallélisme entre degré de méthylation et activité biologique, n'est pas univoque, puisque dans ces expériences on ne peut distinguer les con
séquences de la méthylation des r RNA et des protéines.
Divers rôles biologiques ont été proposés pour la carboxyméthyla- tion des protéines ( Kim et al., 1978).
Toutes les hormones de nature peptidique de la glande pituitaire anté
rieure s'avèrent être d'excellents substrats pour la protéine méthylase II extraite de cet organe ( Diliberto et Axelrod, 1974). Sur la base d'une inactivation de certaines de ces hormones suite à l'estérification chimique par du méthanol ( Li et Fraenkel-Conrat, 1947), il a été sug
géré pour la carboxyméthylation un rôle d'inactivation temporaire de ces hormones en vue de leur stockage ( Diliberto et Axelrod, 1974). La ré
activation pourrait avoir lieu suite à une légère variation du pH.
Une autre étude du groupe d'Axelrod ( Diliberto et al., 1976) semble in
diquer que la carboxyméthylation pourrait jouer un rôle important dans les processus de sécrétion exocytotique des produits excrétables contenus dans les vésicules.
Pendant l'exocytose, la vésicule et la membrane cellulaire fusionnent et les produits intravésiculaires sont déversés dans l'espace extracel
lulaire ( De Robertis et Ferreira, 1957; Viveros, 1975). Cette fusion est rapidement suivie d'une micropinocytose ( Holzman et al., 1973). Ce dernier phénomène est responsable de la formation d'une nouvelle vésicu
le.
Comme les surfaces membranaires vésiculaires et cellulaires portent des charges négatives, il est nécessaire de diminuer la barrière électrosta
tique existante, afin que les deux membranes puissent entrer en contact et fusionner ( Mathews et al., 1972; Dean, 1975).
Dans le cas de la glande adrénalo-médul 1 aire, il a pu être montré que la
charge négative des vésicules "chromaffines", contenant les catéchol- amines, provient principalement des groupes carboxyliques portés par des protéines localisées sur la surface externe de la membrane vésiculaire.
Il a été de plus constaté que :
- les protéines acceptrices de groupes méthyle transférés par la ou les protéine méthylases II endogènes, se localisent à la surface de ces vésicules ( Diliberto et al., 1976)
- la carboxyméthylation de ces protéines des vésicules "chromaffines"
provoque, dans une large mesure, leur détachement de la membrane vési
culaire, exposant ainsi des couches lipidiques ( Diliberto et al., 1976).
Ces deux observations permettent de penser que la carboxyméthylation pour
rait intervenir dans deux étapes capitales du mécanisme de la fusion membranaire : la neutralisation des charges électrostatiques et la mise à nu de couches lipidiques.
Les phénomènes de chémotaxie pourraient, eux aussi, impliquer la carbo-
>0'méthylation de certaines protéines.
Il a été montré que, chez les bactéries flagellées, la S-adénosyl-L-mé- thionine est requise pour obtenir une réponse à des stimuli chémotacti- ques ( Aswad et Koshland, 1975; Larsen et al., 1974a).
Chez E.Coli on constate, pendant la chémotaxie, un accroissement de la méthylation d'un groupe de protéines membranaires ( Kort et al., 1975;
Springer et al., 1977). Cette méthylation porte au niveau d'un ou de plu
sieurs résidus d'acide glutamique.( Kleene et al., 1977). La méthyla
tion de ces protéines provoque leur détachement de la membrane cellulai
re ( Kort et al., 1975).
D'un point de vue macros.copique, on sait que la chémotaxie dépend du sens de rotation du flagelle ( Larsen et al., 1974b). Lorsque celui-ci tourne dans le sens inverse des aiguilles d'une montre, la bactérie avance "cor
rectement". Au contraire, quand la flagelle tourne de façon "horaire", le microorganisme a un mouvement aléatoire, désordonné.
Si la rotation du flagelle est le résultat d'interactions électrostati
ques entre des charges portées par la membrane cytoplasmique et le fla
gelle, on peut concevoir que la neutralisation ( et le déplacement) des charges négatives fixes, contenues dans l'aire de la membrane cellulaire entourant le flagelle, puisse affecter de façon transitoire le sens de rotation ( Diliberto et al., 1976). Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été explicitement prouvée.
e) Le cytochrome c
Le cytochrome _c est une protéine qui s'intégre dans la chaîne respi
ratoire oxydative et que l'on retrouve associée à la membrane mitochon
driale interne de tous les Eukaryotes.
Cette protéine est l'une de celles qui, indiscutablement, a été le mieux caractérisée et étudiée, tant du point de vue de sa structure spatiale, que de sa séquence en acides aminés ou que de son activité biologique.
La fonction biologique de cette'hémoprotéine est identique chez toutes les espèces étudiées. Quelle que soit leur origine, les cytochromes c possèdent, en effet, des valeurs de potentiel Rédox ( + 250 mV) quasi identiques et ils réagissent de façon fort similaire avec la cytochrome _c oxydase extraite de sources variées. En outre, les similitudes consta
tées au niveau des structures primaires et tertiaires indiquent que les cytochromes _c n'ont subi aucun changement important tout au long de l'é
volution chez les Eukaryotes ( Dickerson et Timkovich, 1975).
Principalement grâce aux travaux du groupe de Smith et Margoliash et de celui de Boulter ( ce dernier s'étant particulièrement intéressé aux cytochromes _c issus de végétaux), les séquences en acides aminés de près d'une centaine de cytochromes _c, issus de divers organismes, ont été déterminées ( Figure 2).
Certaines caractéristiques de la structure covalente du cytochrome _c s'avèrent identiques chez toutes les espèces étudiées. C'est ainsi que :
- le noyau hémique est lié de façon covalente, par des ponts thioéther, aux cystéines situées en position 14 et 17^.
Le cinquième ligand du fer hémique est le résidu histidine 18, qui est trouvé strictement invariant dans tous les cytochromes _c. Il en est de même pour la méthionine 80, dont le soufre semble être le sixième ligand du fer hémique ( Dickerson et al., 1971; Ando et al., 1965).
- le cytochrome c des vertébrés comprend 103 ou 104 résidus, et son extré
mité N-terminale est acétylée.
Les hémoprotéines extraites d'Ascomycètes et de plantes supérieures comprennent 4 à 8 résidus supplémentaires, localisés dans la partie N- terminale de la molécule ( Smith, 1970). Les seuls cytochromes c de non vertébrés qui soient N-acétylés sont ceux extraits des plantes su-
^ La numérotation est faite sur la base de la séquence en acides aminés des cytochromes c d'animaux.
