a) Matér-iel
Comme matériel de départ nous nous sonnes servis de levure de boulan ger commerciale ( Bruggeman, Gand). L'Amberlite CG-50 et la résine Biorex 70 étaient respectivement des produits Mallinckrodt et Biorad. Tous les produits chimiques utilisés étaient de qualité "pour analyse" et de marque U.C.B.. Seul le dithionite de sodium était un produit Merck.
b) Extraction
La préparation des Iso-cytochromes c de levure a été réalisée selon la méthode décrite par Foucher et al. ( T972). Seules quelques modifica tions mineures ont été apportées à cette technique.
Un total de 200 Kilogrammes de levure de boulanger ont été traités par lots successifs de 5 Kilos.
La levure est finement émiettée et placée dans 3 litres d'un mélange con tenant 2 litres de glycérol à 10 % dans l'eau et un litre d'acétate d'éthy le. Après liquéfaction par agitation mécanique, on ajoute 200 grammes de dithionite de sodium. L'autolyse se poursuit durant environ 18 heures à 25°C, sous agitation mécanique constante et barbotage d'azote.
Peu avant la première centrifugation, on ajoute à nouveau 100 grammes de dithionite de sodium et 200 grammes deNaCl. Après centrifugation durant 20 minutes à 20 000 x g, on recueille le surnageant qui est porté à 20 litres par addition d'eau distillée et d'un litre de tampon phosphate so- dique 0.1 M, à pH 7.
Les protéines basiques sont ensuite absorbées sur résine échangeuse d'ions par addition de 200 grammes de Biorex 70 humide, préalablement condition née et équilibrée dans du tampon phosphate sodique 0.1 M, à pH 7, selon la méthode de Hagihara et al. ( 1958).
Après une nuit, sous agitation mécanique constante, la résine est recueil lie par décantation et lavée abondamment sur filtre Buchner par, succes sivement, de l'eau, du tampon phosphate sodique 0.1 M, à pH 7j et enfin, par ce même tampon contenant du chlorure de sodium 0.1 M.
La résine est alors placée dans une colonne ( 3 x 30 cm), et le cytochrome c
total et les protéines basiques résiduelles sont éluées par du tampon phos phate sodique 0.1 M, à pH 7, contenant du chlorure de sodium 0.5 M.
La fraction protéique colorée que l'on recueille est dessalée par filtra tion moléculaire sur une colonne de Sephadex G-25 ( 8 x 170 cm), puis lyophilisée.
d) Purification
Le cytochrome c total est fractionné par chromatographie sur une co
lonne ( 5 X 50 cm) d'Amberlite CG-50 ou de Biorex 70, réfrigérée à 15°C. De l'ordre de 600 milligrammes de cytochrome _c total sont lentement absor bés sur la résine, préalablement équilibrée avec du tampon phosphate sodi que 0.1 M, à pH 7, contenant du NaCl 0.2 M et du ferricyanure de potassium 0.1 mM.
En éluant la colonne par un gradient linéaire ( tampon phosphaté sodique 0.1 M, à pH 7, contenant du ferricyanure de potassium 0.1 mM et du NaCl ,
à des concentrations comprises entre 0.2 et 0.5 M ), on obtient le chro ma togramme présenté à figure 1. Le volume total du gradient est compris entre 7 et 10 litres. Le débit est maintenu constant à environ 50 mil lilitres par heure. Des fractions de 12.5 ml. sont recueillies.
Les diverses fractions obtenues sont rassemblées, concentrées par ultra filtration sur membrane Amicon UM-2, dessalées et lyophilisées.
La fraction n°2, qui est constituée essentiellement de la forme non méthylée de 1'Iso-I-cytochrome est rechromatographiée sur une colonne
( 2.5 X 25 cm) d'Amberlite CG-50. Cette dernière est éluée par un gra dient linéaire en chlorure de sodium s'étalant de 0.2 à 0.4 M, dans le
tampon phosphate précédemment décrit ( volume total du gradient ; 3 litres). Le débit est maintenu à environ 20 ml heure et on recueille des fractions de 7 ml.
Les profils chromatographiques ont été obtenus par mesure de la den sité optique à 420 ou ( et) à 530 nm, au moyen d'un spectrophotomêtre Zeiss PMQ II. Les concentrations en cytochrome _c ont été déterminées par mesure de l'absorbance à 550 nm de la forme réduite et de la forme oxydée, en utilisant les coefficients d'extinction molaire décrits par Margalit et Schejter ( 1970).
L'homogénéité des diverses fractions a été testée par électrophorèse Sur gel de polyacrylamide à pH 4.2, selon la technique décrite par Ornstein ( 1964) et Davis ( 1964).
d) Composition en acides aminés
Les divers types de cytochromes c obtenus ont été hydrolysés à 105°C
pendant 24 heures, sous vide, dans de l'acide chlorhydrique azéotropique bidistillé. Les hydrolysats ont été analysés selon la méthode de Spackman et al. ( 1958) en utilisant un analyseur automatique d'acides aminés
Beckman Unichrom.
L'analyse des acides aminés méthylés a été effectuée selon la méthode de Zarkadas ( 1975). Cette technique fait appel à une seule colonne chroma- tographique qui est éluée à 28°C par du tampon citrate de sodium 0.35 N à pH 5.734. Elle permet de séparer les différents dérivés méthylés des acides aminés ( Figure 2). La seule modification que nous avons apportée à cette méthode a été l'utilisation d'une résine Beckman M-82, en lieu et place de la résine Durrum DC-6a préconisée par Zarkadas.
Les dérivés e-N-mono, di et triméthylés de la lysine, servant à l'étalon nage de la colonne de l'analyseur, ont été obtenus par une méthode ori ginale de synthèse en phase solide, développée en collaboration avec Monsieur le Professeur J. Pécher ( voir Annexe 1).
A B S O R B A N C E
FIGURE 1 Chromatographie du cytoch
ne ( 5 X 50 cm) d'Amberli
phosphate sodique 0.1 M, du ferricyanure de potass 15°C, sous un débit de 50 NaCl dans ce même tampon lume total du gradient : de 12.5 ml.
1 représente la fraction 2 représente la fraction 3 représente la fraction
rome _c total de levure sur une colon- te CG-50, équilibrée par du tampon à pH 7, contenant du NaCl 0.2 M et ium 0.1 mM. L'élution est réalisée à
ml/h, par un gradient linéaire de phosphate ( de 0.2 à 0.5 M NaCl; vo- 7 litres). On recueille des fractions
n° 1, rIso-I-cytochrome £ méthylé.
n° 2, r Iso-I-cytochrome _c non méthylé. n°'3, 1'Iso-2-cytochrome c.
TIME
Figure 2.:Séparation d'un mélange de 16 acides aminés méthylés basiques sur une colonne (0.9 x 60 cm) de résine Durrum DC-6A.La colonne est éluée 8 28°C oar un tamoon citrate de sodium 0.36 N, pH 5.734 (A) ou pM 5.657 + 0.002 (B),â une vitesse de 30 ml/h. ( Zarkadas, 1975).
TABLEAU I : Composition en acides aminés des cytochromes _c de levure de boul anger.
Moles d'acide aminé par mole de protéine
Acide Aminé Iso-I Iso-2
Fraction n°l Fraction n°2 Litt. ° Fraction n°3 Litt.^ £ Lysine 15.9 16.2 15 17.3 U Histidine 4.1 4.2 4 3.2 3 Arginine 3.2 3 3 3.1 3 e-N-trim.Lys ^ 0.9 0 1 1.1 1 Acide Aspartique 10.6 10.3 11 11.8 12 Thréonine 7.9 8.1 8 8.6 9 Sérine 4.1 3.8 4 6.3 5 Acide Glutamique 8.9 8.8 9 9.5 9 Proline nd ^ nd 4 nd 5 Glycine 12.1 12.3 12 13.2 12 Alanine 6.7 6.9 7 8.3 8 Cystéine nd nd 3 nd 2 Valine 2.9 3.0 3 3.7 4 Méthionine nd nd 2 nd 3 Isoleucine 4.0 3.7 4 4.7 5 LeUCine 8.1 7.8 8 5.1 5 Tyrosine 3.9 4.4 5 4.5 5 Phénylalanine 3.8 3.8 4 3.7 4 Tryptophane nd nd 1 nd 1 O Narita et al., 1963
^ Margoliash, 1978, communication personnelle.
Cette valeur comprend la e-N-triméthyllysine, éluée conjointement avec la lysine lors de l'analyse "classique".
^ Déterminée selon la méthode de Zarkadas ( 1975) ^ nd : non déterminé.