Comme Foucher et al. ( 1972), nous avons pu observer que la vitesse d'élution et l'étalement du gradient sont des points fondamentaux pour l'obtention d'un bon fractionnement des Iso-I-cytochromes £ éxtraits de la levure de boulanger. Ainsi, en diminuant la vitesse d'élution, tout en augmentant les volumes du gradient et la quantité de protéine à séparer, nous avons pu améliorer la résolution des formes méthylées et non méthy lées de 1'Iso-I-cytochrome £. Cette façon de procéder nous a permis d'éviter la troisième chromatographie, préconisée par le groupe de Slonim- ski ( Foucher et al., 1972).
Les électrophorèses sur gel de polyacrylamide à pH 4.2, ont révélé que les diverses formes des cytochromes £ purifiés étaient homogènes. La composition en acides aminés des diverses fractions est en bonne con cordance avec celles décrites dans la littérature ( Narita et al., 1963; Downie et al., 1977; Margoliash, 1978, communication personnelle ).
Le dosage des acides aminés méthylés, effectué selon la méthode de Zarda- kas ( 1975), nous a permis de confirmer la pureté de la fraction n° 2. Celle-ci, en effet, ne présente aucune trace de e-N-triméthyllysine, alors que les fractions n° 1 et 3 contiennent, chacune, une mole de ce composé par mole de protéine.
En moyenne, nous avons obtenu 30 milligrammes de cytochrome £ total par kilo de levure. Cette quantité est de loin inférieure aux 150 milli grammes obtenus par Foucher et al. { 1972). Cette différence pourrait être expliquée par le fait que ces auteurs utilisent une culture de levures sélectionnées et qu'ils réextraient le culot de centrifugation.
La quantité d'Iso-2-cytochrome £ que nous obtenons est, par contre, plus importante que celle trouvée dans la souche sauvage D 261 CY1/CY1 CY2/CY2 utilisée par Foucher et al. (1972)..
L'utilisation d'une souche de levure cultivée en laboratoire aurait, sem ble-t-il , présenté certains avantages, puisqu'il apparaît que les rendements d'extraction du cytochrome £ sont plus élevés à partir de levures de cul ture que de levures commerciales. Quoiqu'il en soit, la fraction d'Iso-I- cytochrome £ non méthylé que l'on extrait est pondéralement aussi faible dans les levures de culture ou de boulanger. Dans les deux cas, la forme
non méthylée ne représente guère que 1 ou 2 % de 1'Iso-I-cytochrome c total.
Ainsi, dans notre cas, l'obtention d'une quantité appréciable de forme non méthylée aurait exigé l'utilisation de fermentateurs de taille indu strielle. Le choix de la levure de boulanger comme matériel de départ se justifie par sa facilité d'obtention en grandes quantités dans le commerce D'un autre côté il ne semble pas que la proportion de forme non méthylée varie de façon significative au cours du cycle cellulaire chez la levure. Jusqu' à présent des mutants de Saccharomyces Cerevisiae possédant
une teneur plus élevée en Iso-I-cytochrome c non méthylé, n'ont pu être
mis en évidence, probablement à cause d'un manque de critères de sélection Récemment, on a mis en évidence chez Neurospora Crassa ( Nochumson et al., 1977; Durban et al., 1978) et chez la levure ( ce travail) une
méthylase cytochrome c spécifique, capable de méthyler tous les cytochro
mes c non méthylés in vivo. L'usage de cette enzyme pourrait, théori
quement, permettre une obtention originale et aisée de la forme méthylée
d'un cytochrome c non méthylé in vivo. On verra par la suite ( Chapitre V
et Conclusions) que cette approche n'est, malheureusement, pas réalisable en pratique.
CHAPITRE II
Etude physico-chimique des formes méthylée et non méthylée du cytochrome a de Saccharomyces Cerevisiae.
A) Introduction
B) Matériel et Méthodes a) matériel
b) obtention des formes oxydée et réduite, du cytochrome c
c) détermination de la concentration d) mesures de fluorescence
e) spectres de dichroisme circulaire
f) dénaturation acide , thermique et au chlorure de guanidinium g) isomérisation alcaline
h) détermination des potentiels Rédox et des cinétiques d'auto oxydation
C) Résultats et Discussion
a) spectres de dichroisme circulaire
b) dénaturation thermique y acide et au chlorure de guanidinium c) dénaturation basique ou isomérisation alcaline
d) potentiels Rédox et cinétiques d'autooxydation
A) INTRODUCTION
Une comparaison des propriétés physico-chimiques des deux formes de rIso-I-cytochrome £ n'ayant jamais été réalisée, il nous a paru intéres sant de 1'entreprendre en vue de vérifier si la modification de la lysine 72 ne confère pas de propriétés particulières à cette hémoprotéine.
La lysine 72 est, chez tous les cytochromes _c, localisée spatialement dans le côté gauche de la crevasse conduisant à 1'hème ( Dickerson et Timkovich, 1975; Staudenmayer et al., 1977).
Sans exclure à priori aucune autre possibilité, il nous a semblé utile de vérifier si l'apparition d'une charge positive permanente et de trois groupements méthyle dans la molécule n'induit pas de modifications au ni veau :
- de la stabilité de la protéine - de la structure tridimensionnelle - de l'accessibilité de Thème
- des mécanismes, par ailleurs fort complexes, d'oxydo-réduction du fer hémique.
Il est intéressant de noter que l'hypothèse, selon laquelle la méthylation d'un seul résidu puisse affecter ou du moins stabiliser la conformation d'une protéine entière, a déjà été formulée dans le cas de la protéine basique encéphalitogénique ( Eylar et al., 1972; Carnegie, 1971).
La conformation de la chaîne peptidique et l'environnement de Thème des
deux formes de T Iso-Tcytochrome c de levure ont été comparés par étude
de leurs spectres de dichroisme circulaire ( Looze et al., 1976).
Nous avons également étudié leur résistance à la dénaturation par les ba ses, les acides, la chaleur et le chlorure de guanidinium ( Polastro et al. 1976).
Nous avons étendu ces études à TIso-2-cytochrome _c de levure, et à T hé moprotéine de coeur de cheval. Comme les propriétés de cette dernière
B) MATERIEL ET METHODES
a) Matériel
Le cytochrome c de coeur de cheval ( type VI) est un produit Sigma.
L'Iso-2-cytochrome £ de levure a été purifié parallèlement aux deux for mes de 1'Iso-I-cytochrome £.
Le chlorure de guanidinium est de qualité "spectroscopique" et a été four ni par Serva. Le N-acétyl-L-tryptophane est un produit Mann. Sigma a
fourni le L-tryptophane et le Trizma. Les autres produits chimiques étaient de marque Merck et de qualité "pour analyse".
b) Obtention des formes réduite et oxydée du cytochrome c
Les formes ferri et ferrocytochrome £ ont été obtenues,respectivement, par traitement avec un excès de ferricyanure de potassium ou de dithioni- te de sodium. L'excès de réactif a été éliminé par filtration molécu laire sur une colonne de Sephadex G-25. Dans certains cas, la réduction a été effectuée par passage des solutions de cytochrome £ au travers d'une colonne de Duolite.
Les solutions de ferrocytochrome £ ont été préparées peu avant usage, et ont été soigneusement saturées en azote.
c) Détermination de la concentration en cytochrome c
La concentration en cytochrome £ a été déterminée spectrophotométri- quement par mesure :
- soit de l'absorbance à 550 nm, après réduction complète de 1'hémopro té i ne
- soit de la différence de la densité optique â 550 nm entre les formes réduite et oxydée .
Dans les deux cas, nous avons utilisé les coefficients d'extinction molai re décrits par Margalit et Schejter ( 1970).
Les absorbances ont été mesurées en utilisant un spectrophotomètre Cary 15 ou 118 ou Zeiss PMQ II.
d) Mesures de fluorescence
Les spectres de fluorescence ont été établis à 25°C, en utilisant un spectrofluorimètre Hitachi Perkin Elmer MPF 2A.
Nous avons vérifié que l'intensité de fluorescence du L-tryptophane en solution aqueuse est entièrement indépendante de la concentration en chlo rure de guanidinium, et que le spectre d'émission du N-acétyl-L-tryptopha- ne éthyl ester ne change pas entre pH 2 et 7.
La concentration protéique n'a jamais excédé 5 uM. Dans ces conditions l'intensité de fluorescence obéit à la loi de Beer.
e) Spectres de dichroisme circulaire
Les spectres de dichro'isme circulaire ont été obtenus à l'aide d'un spectropolarimètre Cary 61.
Toutes les mesures ont été effectuées à 20°C dans un tampon Tris/HCl 50 mM. Dans les régions explorées la densité optique des solutions de cytochrome £
n'a jamais dépassé 2.0.
Dans la région s'étendant de 600 à 250 nm nous avons utilisé des cellules de quartz d'un trajet optique de 1 cm, tandis que dans la région comprise entre 200 et 250 nm nous avons employé des cellules de 1 mm de trajet op tique.
f) Dénaturation acide y thermique et au chlorure de guanidinium
Les dénaturations acides et au chlorure de guanidinium ont été suivies en étudiant la variation de l'absorbance à 395 nm ou l'accroissement de l'intensité de fluorescence à 350 nm ( longueur d'onde d'excitation : 290 nm).
Les dénaturations par le chlorure de guanidinium ont été effectuées à 25°C dans du tampon phosphate sodique 10 mM, à pH 6.5.
L'effet des acides a été étudié en ajoutant des quantités croissantes d'HCl concentré à une solution de ferricytochrome c dans un tampon conte nant du citrate de sodium 10 mM et du phosphate sonique 10 mM ( pH initial 7).
La dénaturation thermique a été suivie par spectrophotométrie diffé rentielle en utilisant un tampon phosphate sodique de force ionique 0.1 et à pH 6.5.
g) Isomérisation alcaline
L'isomérisation alcaline des ferricytochromes _c a été suivie à 20°Cj soit par variation de l'absorbance à 695 nm, soit par détermination de 1'ellipticité à 417 nm.
Les divers types de ferricytochromes £, dissous dans du Tampon Tris/HCl 50 mM ( pH initial 7.0), ont été titrés par NaOH 10 M.
h) Détermination des potentiels Rédox et des cinétiques d'autooxydation
Les potentiels Rédox des différents cytochromes _c ont été calculés par rintermédiaire de la constante d'équilibre de la réaction d'oxydo-
réduction entre le cytochrome £ et 1'hexacyanoferrate ( Margalit et Schejter, 1970, 1973). Cette constante a été déterminée en titrant à 25°C une solu tion de cytochrome £ dans un tampon phosphate sodique 0.1 M à pH 7, con tenant du KCl 4mM, par des aliquotes d'une solution de titre rigoureuse ment identique en cytochrome £ et en phosphate, mais contenant, à la place du KCl, du ferrocyanure de potassium 4 mM. Le spectre de la solution a été relevé entre 600 et 450 nm. La réduction complète du cytochrome £ est obtenue par addition d'une petite quantité de dithionite de sodium. En calculant, grâce aux spectres obtenus, les quantités de ferri et de ferrocytochrome £ présentes dans la solution, et en connaissant la con centration en ferrocyanure ajoutée, il est possible de calculer la con stante d'équilibre de la réaction :
cyt c Fe^"^ + Fe(CN)g" cyt £ Fe^^ + Fe(CN)g"
et d'en déduire le potentiel Rédox du cytochrome £ par les équations sui vantes :
AE° = 0.059 log K
et
E° = aE° - E°
Les cinétiques d'autooxydation des ferrocytochromes _c ont été déter minées par la méthode décrite par Wada et Okunuki ( 1969).
Nous avons suivi la variation au cours du temps de la densité optique à 550 nm d'une solution de ferrocytochrome £, à une concentration comprise entre 1 et 2 mM, dans du tampon phosphate sodique 10 mM contenant de l'EDTA 0.3 mM.
En portant le logarithme de la concentration en ferrocytochrome c_ en fonction du temps, on obtient une droite dont le coefficient angulaire donne une
mesure de la constante cinétique de la réaction d'oxydation des ferrocyto chromes _c par l'oxygène dissous dans l'eau.
C) RESULTATS ET DISCUSSION
a) Spectres de diahrotsme circulaire
1 région de 250 à 600 nm
Dans cette zone, les formes oxydées et réduites des cytochromes c_ de
levure et de coeur de cheval possèdent des courbes de dichroTsme circulaire présentant plusieurs bandes qui se chevauchent.
On constate que les divers spectres des Iso-cytochromes c de levure possè
dent des caractéristiques similaires, sinon identiques à celles exhibées par le cytochrome £ extrait de coeur de cheval.
En particulier, on peut remarquer que les signes, l'ellipticité et la loca lisation des extréma ( 250, 263, 283, 290, 330, 375, 417, 498,530 et 550 nm pour la forme ferri; 270, 335, 375, 425, 510, 530 et 550 nm pour la forme ferro) sont bien conservés.
Les analogies que l'on observe aussi bien pour les formes réduites que pour celles oxydées, permettent de penser que l'environnement de Thème est fort similaire, voire identique, pour les diverses hémoprotéines considérées. 2 région de 200 à 250 nm
Les spectres de dichroTsme circulaire obtenus dans cette zone sont représentés dans les figures 1 A et B.
Pour les quatre types de cytochrome £ à l'état ferrijon constate un minimum situé à 222 nm et un épaulement à 209 nm. En passant à l'état réduit, le minimum se déplace légèrement vers des longueurs d'onde plus élevées ( 224 nm) tandis que Tépaulement ne semble subir aucun déplacement.
2
Les valeurs de l'ellipticité ( 9 500 et 12 000 degrés cm par décimole d'a cide aminé, à 209 et 222 nm), ainsi que la position des bandeSjsont en par fait accord avec les données publiées par Myer ( 1968).
Par mesure de l'ellipticité à 222 nm, selon la méthode préconisée par Chen et Yang ( 1971), il a été possible d'estimer le contenu en hélice de la protéine. Cette méthode, purement empirique et soumise aujourd'hui à diverses critiques ( Baker et Isenberg, 1976; Hammond, 1977), n'a pas été utilisée dans le but de déterminer de façon absolue le degré d'hélicité, mais bien pour obtenir une base de comparaison entre les cytochromes £ de levure et de cheval.
(0) -5 -i X n ' -)0 i\ A w w \ ^ A l‘l /n //il ^4''' -'Il ■::.\ \-V;i w // l< II \ \ \ \ \ I \ \ \ \ \ I I ' *—/ ■/' / I I I / I ! I 'v V ^ ' II I 200 220 240 200 220 Wavelength (nm) 2«
Figure 1 : Spectres de dichroîsme circulaire des formes oxydées ( A) et réduites ( B) des cytochromes £ de cheval et de levure de boulanger, dans un tampon Tris/HCl 50 mM, à pH 7 et à 25°C. La courbe 1 représente le spectre de 1'hémoprotéine de cheval, les courbes 2, 3 et 4 représentent , respectivement, les spectres des Iso-2, Iso-I méthylé et Iso-I non méthylé cytochromes £• issus de ta levure.
possèdent, respectivement, un contenu en hélice K d'environ 30 et 27 %,
Ils apparaissent plus ordonnés que les formes méthylées et non méthylées de 1'Iso-I-cytochrome £ qui possèdent, elles, entre 21 et 22 % d'hélice Les valeurs de l'hélicité que nous obtenons sont en très bon accord avec les résultats publiés par Mirsky et George ( 1967).
Les spectres de dichroîsme circulaire révèlent, en outre, qu'aucune contri bution de structure ^ ne peut être attribuée aux quatre hémoprotéines étu diées ( Chen et al., 1972).
Les études par diffraction des rayons-X ont montré que la structure du ferri-
cytochrome c de cheval est essentiellement constituée de régions sans ordre
apparent et de trois segments d'hélice ti/ ( Dickerson et al., 1971; Takano et al., 1973). Ces segments sont compris entre les résidus 1-13, 62-70 et
88-102. Sur la base de 104 résidus, ce contenu correspond à environ 34 %
Afin de pouvoir interpréter les différences en contenu héücoidal existant entre le ferricytochrome £ de cheval et les deux formes de 1'Iso-I-cyto- chrome £ de levure, nous nous sommes référé aux séquences en acides aminés de ces deux protéines ( Narita et al., 1963; Margoliash et Smith, 1961).
On constate que les séquences des fragments hélicoïdaux sont assez similaires chez les deux espèces ( introduction, figure 2).
La seule différence notable concerne le fragment compris entre les résidus 62 à 70. Dans le cytochrome £ de cheval cette séquence est :
Glu-Thr-Leu-Met-Glu-Tyr-Leu-Thr-Asn. Elle est composée, en grande partie, de résidus réputés formateurs d'hélice ( Chou et Fasman, 1974).
Dans rIso-I-cytochrome £ de levure,le fragment 62-70 s'établit comme suit : Asn-Asn-Met-Ser-Glu-Tyr-Leu-Thr-Asn.
Ce segment peut être supposé comme non hélicoïdal, puisqu'il contient une proportion élevée d'acides aminés réputés briseurs d'hélice. De plus, il semblerait que la région C-terminale du cytochrome £ de cheval ait une ten dance plus élevée à assumer une conformation ordonnée, que le segment cor respondant de 1'Iso-I-cytochrome £ de levure ( Moroder et al., 1975).
Le changement de l'état d'oxydation du fer hémique dans le cytochrome £ de cheval ne semble provoquer aucun changement notable dans le contenu hé licoïdal de la protéine ( figure 1 B). Ce résultat peut être corroboré par les études de diffraction aux Rayons-X réalisées sur les formes ferri et ferro par le groupe de Dickerson ( Takano et al., 1973).
Cette constatation s'avère également valable pour les formes méthylées et non méthylées de 1'Iso-I-cytochrome £ de levure. Par contre, 1'Iso-2-cy-
tochrome c voit, suite à la réduction, son contenu en hélice « diminuer,
et devenir, ainsi, pratiquement identique à celui de l'autre hémoprotéine de levure. La raison de cette variation, non négligeable, reproductible et observée aussi par Mirsky et George ( 1967), demeure obscure.
b) Dénaturation- acide , thermique et au chlorure de guanidinium
1 dénaturation au chlorure de guanidinium
Les dénaturations acides et au chlorure de guanidinium du ferricyto chrome £ ont été suivies par mesure de la variation soit de l'intensité de
1 /m o le c m
Figure 2 : Spectre d'émission de fluorescence ( longueur d'onde d'exci tation : 290 nm) du : A , L-tryptophane 3 yM à pH 6; B ,
cytochrome c de levure 3 yM à pH 3 et C, cytochrome 3 yM à pH 6,
Figure 3 : A spectre différentiel d'absorption du ferricytochrome _c de levure. La cellule de mesure contient du ferricytochrome _£ à pH 2. La cellule de référence contient du ferricyto
chrome £ à la même concentration mais à pH 7.
B spectre d'absorption du ferricytochrome c de levure à pH 7
fluorescence, soit de l'absorbance à 390 nm.
En effet, ces paramètres varient fortement selon que la protéine est à l'état natif ou dénaturé ( figure 2 et 3) ( Tsong, 1974; Babul et Stellwa- gen, 1972).
Les courbes illustrant la dénaturation par le chlorure de guanidinium des différents ferricytochromes c sont reprises dans la figure 4.
Figure 4 : Courbes de dénaturation par le chlorure de guanidinium des
ferricytochromes £ de coeur de cheval (» ), Iso-I-méthylé (b ),
Iso-I-non méthylé (c ) et Iso-2 ( o ) de levure.
Les expériences ont été réalisées à pH 6.5 et à 25°C.
Quel que soit le paramètre utilisé ( intensité de fluorescence ou absorban ce dans la région de Soret)jdes résultats identiques ont été obtenus.
Nous avons vérifié que la dénaturation par le chlorure de guanidinium est un phénomène entièrement réversible ( Stellwagen, 1968a).
Tout comme l'ont fait de nombreux auteurs, et, entre autre,Knappe et Face en 1974, nous avons interprété les dénaturations des ferricytochromes £ comme des phénomènes impliquant un équilibre simple entre un état natif et un état dénaturé.
Les résultats que nous avons obtenu ont servi à calculer une constante d'équilibre apparente K ( 1), à partir de laquelle nous avons pu
esti-I esti-I
mer l'énergie libre apparente Zl G^pp ( 2): K app et ( F eq, - F ) / ( Fd ' *^eq ) = - RT In K app app ( 1) ( 2)
ou
- représente l'intensité de fluorescence ( ou la densité optique à
390 nm) mesurée pour une certaine concentration en dénaturant
- et F^ représentent les intensités de fluorescence ( ou l'absorbance)
des formes native et dénaturée , pour une concentration donnée en déna
turant. Ces valeurs ont été obtenues par extrapolation des régions linéaires qui précèdent.ou suivent,la transition dans la courbe de dénaturation.
Les valeurs de A calculées selon cette méthode varient de façon linéai re avec la concentration en dénaturant, et ceci pour les quatre hémoprotéi nes étudiées ( figure 5).
Figure 5 : Représentation du AG pour la dénaturation des ferricytochromes c, en fonction de la^BBncentration en chlorure de guanidinium. Tes AG ont été calculés grâce aux données de la figure 4 et
à l'aiâB*^ de l'équation ( 2). Nous avons utilisé les mêmes sym boles que dans la Figure 4.
La variation de AG^pp en fonction de la concentration en chlorure de gua nidinium peut être représentée par l'équation ( 3) ( Knappe et Race, 1974; Tanford, 1968) ;
HoO.
'^^app " ^^aêp m ( GuHCl) ( 3)
ou
app représente l'energie libre de dénaturation de la protéine pour une
concentration nulle en dénaturant
- m est une constante traduisant la variation de l'énergie libre de déna- * turation en fonction de la concentration en dénaturant.
- GuHCl est la concentration en chlorure de guanidinium H 0
obtenues de^G^^p et de m sont reprises dans le Tableau I. Les valeurs
H 0
La grandeuri\a également été estimée par une autre méthode.
Celle-ci fait appel à l'hypothèse selon laquelle la dénaturation a lieu suite à la liaison du dénaturant à la molécule ( Aune et Tanford, 1969).
Selon ce modèle, la variation de fonction de la concentration en
dénaturant est traduite par l'équation suivante : - (ûn) RT in ( 1 + Ka,) (4)
OÙ :
- ûn représente la différence entre le nombre de molécules de dénaturant liées à la protéine à l'état natif et dénaturé
- K est la constante de liaison du dénaturant au polypeptide
- a_^ représente l'activité ionique moyenne du dénaturant ( calculée selon lâ méthode décrite par Aune et Tanford, en 1969).
Nous avons utilisé pour K une valeur de 1.2. Une telle grandeur a déjà été employée dans le cas de la dénaturation du cytochrome £ ( Knappe et Race, 1974) et de plusieurs autres protéines, comme le lysozyme { Aune et Tanford, 1969), la myoglobine ( Puett, 1973) ou la ribonucléase ( Salahuddin et Tan