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DISCUSSION GENERALE DE L ’ ETUDE PHYSICO-CHIMIQUE

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La méthylation de la lysine 72 de 1'Iso-I-cytochrome _ç de levure ne semble affecter ni la structure, ni la stabilité,ni l'environnement de 1'hème de cette hémoprotéine.

Si nous n'avons pu déceler de différences significatives entre la stabilité des formes méthylées et non méthylées de la protéine de levure, nous avons

pu, par contre, observer que le cytochrome c de cheval est sensiblement plus

résistant à la dénaturation thermique et au chlorure de guanidinium.

Ces résultats nous ont permis d'estimer que le cytochrome _c de cheval est thermodynamiquement plus stable que les hémoprotéines de levure.

La différence de stabilité entre les cytochromes _c de cheval et de levure ( Iso-I) peut être expliquée, du moins en partie, par le contenu en hélice

a moindre de l'Iso-I-cytochrome c de levure ( 22 % de contenu en hélice a

contre 30 % pour le cytochrome _c de cheval). La perte d'hélicité dans le

cytochrome _£ de levure semble pouvoir être localisée au niveau du segment 62-70, si l'on en croit l'analyse que nous avons effectuée selon la méthode de Chou et Fasman ( 1974).

Les études de l'isomérisation alcaline montrent une autre différence entre les hémoprotéines de levure et de cheval , le pKa apparent de tran­ sition de cette dernière étant sensiblement plus élevé ( 9.4 contre 8.35). Si la mesure de ce pKa est considérée comme reflétant la constante d'ioni­ sation du groupe e-amino de la lysine 79 ( Wilgus et Stellwagen, 1974), on pourrait, peut être, expliquer cette différence par un microenvironne­ ment plus polaire de ce résidu dans le cytochrome _c de levure.

L‘ étude du potentiel rédox , des cinétiques d'autooxydation et des spectres de dichroïsme circulaire dans la région de 350 à 600 nm, nous ré­

vèle que 1'Iso-I-cytochrome c de levure possède, quel que soit son état

de méthylation, un environnement de Thème fort semblable à celui de T hé­ moprotéine de cheval.

Cette constatation n'est nullement surprenante, puisque le cytochrome _c est une protéine, dont la fonction et les propriétés biologiques sont re­ stées les mêmes tout au long de l'évolution ( Smith, 1970; Dickerson et Timkovich, 1975). Notamment, son potentiel rédox, propriété clé s'il en est, est pratiquement le même chez toutes les espèces ( Margalit et Schejter, 1970).

La structure de 1' Iso-I-cytochrome _c de levure paraît plus labile et moins ordonnée que celle de 1'hémoprotéine de coeur de cheval.

La modification par triméthylation du résidu lysine 72 pourrait avoir comme rôle de pallier ou de remédier à ces différences ou à cette stabi­ lité moindre, tout en gardant inaltérées les propriétés fondamentales de la protéine.

CHAPITRE III

Etude de la susoeptibilité à ta protéolyse des formes méthylée et non

méthylée de l'Iso-I-cytochrome e de Sacchcœomyces Cerevisiae.

A) Introduction

B) Matériel et Méthodes a) matériel

b) purification partielle des protéases A et B de levure de boulanger c) mesure de l'activité enzymatique des protéases A et B

d) mesure des cinétiques de digestion des cytochromes £

C) Résultats et Discussion

a) préparation des protéases A et B

b) cinétiques de digestion des cytochromes c_ par la trypsine et les protéases A et B.

A) INTRODUCTION

Une des premières hypothèses formulées quant au rôle biologique de la méthylation in vivo des résidus lysine, a été celle postulant un rôle de protection envers la protéolyse enzymatique ( Paik et Kim, 1971).

Un tel rôle, qui serait analogue à celui joué par la méthylation de certai­ nes bases du DNA chez les Procaryotes ( Arber, 1974) n'a, jusqu'à pré­ sent, jamais été testé ni, à fortiori, démontré pour des protéines méthy- lées in vivo.

Divers résultats, obtenus en utilisant exclusivement des polypeptides méthylés chimiquement in vitro, semblent étayer cette hypothèse. C'est

ainsi, entre autre, que :

- la trypsine méthylée voit sa susceptibilité à l'autolyse spontanée forte­ ment réduite ( Rice et al., 1977)

- la diméthylation de la fonction e-N-aminée de la lysine crée des liens peptidiques particulièrement résistants au clivage par la trypsine ( A- mons et Moller, 1974; Gorecki et Shalitin, 1967)

- la trypsine n'a pas d'activité estérolytique sur l'ester méthylique de la e-N-méthyllysine ( Benoiton et Deneanet, 1966)

- la vitesse d'hydrolyse de dipeptides du type Benzoyl-Glycyl-Lysine, cata­ lysée par la carboxypeptidase B, est fortement réduite par la méthylation de la lysine ( Moore et Benoiton, 1975)

Ces résultats sont, cependant, en contraddiction avec ceux obtenus par d'autres expérimentateurs.

Ainsi, selon Paik et Kim ( 1972), la méthylation de près de 80 % des rési­ dus lysine de la ribonucléase, de certaines histones et de 1'a-polylysine, ne modifie guère la susceptibilité de ces composés à l'action de la tryp­ sine ou de la chymotrypsine. Des résultats analogues ont été obtenus par Seeley et Benoiton ( 1970).

Ces résultats divergents ne sont pas tellement étonnants. En effet, la méthylation chimique^n'étant nullement spécifique ni limitée à un seul résidu, peut entraîner des modifications dans la conformation globale du polypeptide et ainsi, le déstabiliser. Comme on se trouve, alors, en présence de deux phénomènes pouvant avoir des effets opposés au niveau de la protéolyse enzymatique, il parait hasardeux de vouloir tirer des con­ clusions définitives à partir des résultats obtenus sur des peptides

mé-thylés chimiquement in vitro.

Dans le cas de 1'Iso-I-cytochrome £ de levure, on dispose d'une pro­ téine où la méthylation enzymatique n'a en rien modifié la conformation globale, et où une étude de la susceptibilité à la protéolyse ne devrait rendre compte que du seul effet de la méthylation.

Comme nous l'avons vu précédemment, le résidu de lysine 72 se localise dans un endroit relativement accessible, à la périphérie de la molécule.

La méthylation de ce résidu pourrait avoir un rôle protecteur en ralentis­ sant, voire même en empêchant l'hydrolyse du lien peptidique adjacent ou spatialement proche du site modifié. Si cette liaison représente le ( un) point d'attaque privilégié des protéases, sa protection pourrait entraîner une déstabilisation moins rapide de la protéine, avec comme conséquence, une résistance à la protéolyse accrue pour la molécule entière.

Afin de vérifier cette hypothèse, il nous a semblé raisonnable d'utiliser, non seulement la trypsine, mais aussi des protéases extraites de la levure.

Chez Saccharomyces Cerevisiae la présence d'une activité protéolyti­ que est connue depuis plus d'un demi-siècle.

C'est en 1967 que Lenney et Dalbec ont isolé pour la première fois deux protéases de ce microoorganisme : les protéases A et B, qui sont, respecti­ vement, des protéases acide et neutre .

Par la suite, ces enzymes ont été identifiées aux facteurs d'inactivation I et II de la tryptophane synthase ( Saheki et Holzer, 1974).

Une carboxypeptidase, nommée protéase C ou carboxypeptidase Y, a été aussi purifiée de la levure ( Hata et al., 1967).

Chacune de ces protéases, localisées dans les vacuoles, possède un inhi­ biteur protéique, qui est trouvé dans le cytoplasme ( Lenney et al., 1974). Chez Neurospora Crassa, un autre Ascomycète, on dénombre cinq protéases, dont trois exocaténases et deux endopeptidases. Parmi ces dernières, l'une est fort semblable à la protéase A, alors que l'autre possède des caracté­ ristiques catalytiques fort proches de celles exhibées par la protéase B ( Matile, 1964; Tsai et Suskind, 1972; Yu et al., 1973).

B) MATERIEL ET METHODES

a) Matériel

La trypsine pancréatique bovine est un produit Sigma. Calbiochem a fourni l'Azocon. La diéthylaminoéthyl-cellulose DEAE-52 et la carbo- xyméthyl-cel1ulose CM-11 sont des produits Whatman.

Tous les autres produits chimiques utilisés sont de qualité "pour analyse"

b) Purification partielle des protéases A et B de la levure de boulanger

Les protéases A et B de levure ont été purifiées partiellement, selon une technique largement inspirée des méthodes décrites par Lenney et Dal- bec ( 1967), Lenney et al. ( 1974), Hayachi et al. ( 1973) et Betz et al.

( 1974).

Le schéma de purification comprend cinq étapes : 1 Autolyse

2.5 Kg de levure de boulanger sont finement émiettés et placés dans 500 ml de chloroforme. Après une heure sous agitation mécanique constante on ajoute un litre d'eau. Le pH du mélange est ajusté à 7 par addition de soude concentrée et il est maintenu constant pendant environ 20 heures. La suspension est alors centrifugée à 43 000 x g pendant 20 minutes.

2 Fractionnement au sulfate d'ammonium

Le surnageant est recueilli et est porté à 50 % de saturation en sul­ fate d'ammonium, par addition de ce sel. Durant cette opération le pH est maintenu constant à 7 par addition d'ammoniaque concentrée.

Après une heure d'agitation, le précipité qui se forme est éliminé par cen trifugation ( 30 000 x g; 20 minutes), et le surnageant est porté à 90 % de saturation en sulfate d'ammonium.

3 Activation

Le précipité, recueilli par centrifugation (30 000 x g; 20 minutes), est dissous dans 300 ml de tampon acétate de sodium 50 mM, à pH 5. Le pH de la solution est gardé constant par addition prudente d'acide acétique dilué. On ajoute quelques milligrammes de sulfate de streptomycine et le mélange est laissé sous agitation magnétique pendant 24 heures, à tempe-

rature ambiante. Après élimination par centrifugation d'un éventuel pré­ cipité, le pH de la solution est ramené à 7, et on procède à une dialyse exhaustive contre du tamon phosphate sodique 10 mM, à pH 7.

Cette dernière opération, ainsi que toutes les étapes suivantes, est réa­ lisée à 4°C. La dernière dialyse est effectuée contre le même tampon, contenant en plus du NaCl 0.1 M.

4 Chromatographie sur DEAE-cel1ul ose

La solution dyalisée est appliquée au sommet d'une colonne ( 2.5 x 40 cm) de DEAE-cel1ulose ( DEAE-52), équilibrée par du tampon phosphate sodique 10 mM, à pH 7, contenant du NaCl 0.1 M.

La colonne est éluée par ce même tampon, jusqu'à ce que l'éluat soit dé­ pourvu de toute activité protéolytique A ou B.

5 Chromatographie sur CM-cellulose

phosphorique. La solution est appliquée à une colonne ( 2.5 x 40 cm) de carboxyméthyl-cellulose ( CM-11) équilibrée avec du tampon phosphate mo­ nopotassique 0.1 M, à pH 4.5. La colonne est lavée par ce tampon, jusqu'à

ce que la densité optique à 280 nm de l'éluat soit pratiquement nulle. On applique alors un gradient linéaire en tampon phosphate 0.1 M allant de pH 4.5 à 7 ( volume total du gradient : 1.5 litres). L'élution se poursuit sous un débit de 60 ml/h et on recueille des fractions de 15 ml. Le pic contenant l'activité desprotéaseiA et B est congelé et conservé à -30°C.

O J Mesure de l'aotivi-té enzymatique des protéases A et B

L'activité de la protéase A a été suivie selon une variante de la méthode d'Anson ( 1938).

200 yl de la préparation enzymatique et 1.5 ml de citrate de sodium 50 mM,

à pH 3.4, contenant 1 % d'hémoglobine humaine dénaturée, sont incubés à

30°C pendant 20 minutes ( Lenney, 1975). La digestion est arrêtée par addition de 2.5 ml de TCA 0.34 N. Le précipité est éliminé soit par fil­ tration, soit par centrifugation. A 1.67 ml du filtrat ( ou du surnageant)

on ajoute 3.33 ml de NaOH 0.3 N, contenant 2,9 % de carbonate de sodium,

puis 1 ml de liqueur de Fol in. Après 10 minutes, on mesure la densité optique à 650 nm. La valeur obtenue est corrigée en tenant compte de l'absorbance d'un échantillon témoin, dans lequel la préparation enzyma­ tique a été ajoutée après addition du TCA.

L'activité de la protéase B a été mesurée en utilisant comme substrat de l'azocoll ( Juni et Heyne, 1968).

A 15 mg de substrat, en suspension dans 400 yl de tampon phosphate sodique

0.1 Ma pH 7, on ajoute 100 yl de la préparation enzymatique. L'incuba­

tion se poursuit pendant 20 minutes à 30°C, sous agitation fréquente.

La réaction est arrêtée par addition de 3.2 ml de chlorure mercurique 1 mM. Après sédimentation de l'azocoll, on détermine la densité optique à 530 nm du surnageant.

Dans les deux cas, nous avons défini l'unité protéolytique, comme étant la quantité d'enzyme nécessaire pour obtenir un accroissement de la densité optique de 1.

Afin de distinguer et de dissocier les activités des protéases A et B, nous avons incubé des aliquotes de la préparation enzymatique avec du pCMB 0.5 mM, ce réactif inactivant sélectivement la protéase B ( Lenney, 1975).

d) Mesure des cinétiqv^s de digestion des cytochromes c_

Les cinétiques de digestion ont été suivies sur les deux formes de

1'Iso-I-cytochrome c de levure et sur 1'hémoprotéine de cheval, à l'état

ferri.

Les digestions à la trypsine, à la protéase B et à la protéase A ont été réalisées, respectivement, dans un tampon phosphate sodique 0.1 M à pH 8 ou 7 et dans un tampon acétate de sodium 50 mM à pH 4.5.

La concentration en cytochrome c était comprise entre 10 et 100 yM.

La quantité d'enzyme protéolytique ajoutée a été déterminée pour la tryp­ sine par mesure de la densité optique à 280 nm ( Mee et al., 1965) et par mesure de l'activité enzymatique pour les protéases A et B.

Les cinétiques de digestion des cytochromes _c ont été suivies à 25°C, par trois méthodes distinctes :

- la variation de la densité optique à 695 nm

- le changement de la densité optique dans la région de Soret, entre 420 et 385 nm.

- la variation de la vitesse ou/et de la capacité des ferricytochromes c à être réduits enzymatiquement par une préparation brute de succinate déshydrogênase de levure ( pour les détails expérimentaux de l'essai enzymatique voir le chapitre IV). Lors de cet essai, nous avons mesuré simultanément l'activité de la réductase avec une solution témoin de

ferricytochrome c, ceci afin de pallier à d'éventuelles fluctuations de

l'activité enzymatique.

Occasionnellement, les cinétiques de digestion ont été suivies par mesure de l'ellipticité dans la région comprise entre 450 et 210 nm, ou aussi en étudiant la variation de l'intensité de fluorescence de 1'hémoprotéi­ ne.

C) RESULTATS

a) Préparation des protéases A et B

Les diverses méthodes de purification des protéases de levure décri­ tes dans la littérature sont laborieuses et longues ( Lenney et Dalbec, 1967; Hayachi et al., 1973; Betz et al., 1974;...).

L'obtention de quantités pondéralement importantes d'enzyme se heurte à des difficultés assez considérables, liées principalement à l'insta­ bilité et à l'autodégradation de ces protéases.

Ainsi, nous n'avons pu obtenir en quantité ni en "qualité" satisfaisantes les protéases A et B, ni par la méthode de Lenney et Dalbec ( 1967), ni par celle décrite par Betz et al. ( 1974).

Cependant, en introduisantsaprès les étapes "classiques" d'autolyse, frac­ tionnement au sulfate d'anmonium, activation et chromatographie sur DEAE cellulose ( Hayachi et al., 1974), une étape de chromatographie sur CM- cellulose, nous avons pu obtenir rapidement et simplement les protéases A et B. En effet, cette étape chromatographique permet l'élimination de la plupart des protéines contaminantes ( Figure 1).

s c O 1 CO C\J lia O O 0 6.5 6.0 5.5 pH 5.0 4.5 500 1000 1500 Vol. él. (ml)

Figure 1 : Chromatographie sur CM-11 de la fraction contenant les activi­ tés protéase A et B, obtenues après l'étape de,purification sur DEAE-cel1ulose. La colonne est lavée par un litre de KH^PO. 0.1 M à pH 4.5. On applique alors un gradient linéaire de

tampon phosphate, allant de pH 4.5 à pH 7 ( volume total du gradient : 1.5 litres). On recueille des fractions de 15 ml. La barre horizontale représente les fractions qui contiennent l'activité de protéase A et B.

En appliquant à la colonne un gradient linéaire de pH, les protéases A et B sont éluées en même temps, en une seule fraction, probablement sous forme d'un complexe. Cette hypothèse est d'autant plus vraisembla­ ble que la formation d'un complexe stable entre les protéases A et B a déjà été décrite par Hinze et al.,( 1975).

Cependant, comme ces protéases présentent des spectres d'activité diffé­ rents et qu'il est possible d'inhiber dans le complexe spécifiquement la protéase B, il ne nous a pas paru opportun de tenter de dissocier les deux caténases. En effet :

- la protéase A est une protéase acide, dont le pH optimum d'activité se situe aux environs de 3.5 ( Lenney, 1975). Elle peut, de plus, être inhibée par la pepstatine, mais elle n'est pas sensible aux déri­ vés organomercuriens.

- la protéase B présente un pH optimum proche de la neutralité et, bien qu'elle ne puisse être classifiée dans aucune des quatre grandes clas­ ses de protéases microbiennes ( Hartley, 1960), elle est inhibée à la fois par les réactifs des protéases à sérine et à thiols.

Par simple incubation du complexe protéolytique en présence de pCMB, et après élimination de l'excès de réactif par dyalise, nous avons pu obte­ nir l'activité de protéase A seule. Nous avons également vérifié qu'à pH 7, le complexe inhibé par le pCMB est inactif, ce qui implique que seule l'activité protéolytique due à la protéase B se manifeste à ce pH.

b) Cinétiques de digestion des aytoahromes c par la trypsine et les

protéases A et B de levure

Dans la figure 2 nous avons repris les courbes illustrant les ciné­ tiques de dégradation des ferricytochromes _c par la protéase B. Elles ont été obtenues en suivant la variation de l'absorbance soit à 695 nm ( A), soit à 390 nm ( B).

La figure 3 illustre les courbes obtenues en suivant les digestions par la trypsine.

Etant donné les changements spectraux qui se manifestent pour les cyto­ chromes £ à pH 4.5, nous avons préféré, dans le cas des digestions par la protéase A, suivre les cinétiques de dégradation par mesure de la vi­ tesse de réduction enzymatique. H faut noter que la valeur de pH 4.5 ne correspond pas exactement au pH optimum d'activité de la protéase A.

50

0

50

0

Figure 2 Figure 3

Figure 2 : Cinétiques de dégradation des ferricytochromes c par la pro­

téase A. Les essais ont été réalisés à 25°C, dans un tampon phosphate sodique 0.1 M à pH 7.

Nous avons utilisé les symboles suivants : t : cytochrome c de cheval

i : ISO-I-méthylé O : Iso-I-non méthylé.

En ordonnée nous avons représenté le % de variation observé,

calculé par la formule : % = D.O.. - D.O.^ = D.O. - D.O.^

où D.O. et D.O.^ représentent respectivement les°densités optiques à l'instant initial et après un temps très long ( en­ viron 24 heures).

La variation de densité optique a été mesurée à : A : 695 nm

B : 390 nm

Figure 3 : Cinétiques de dégradation des ferricytochromes c par la tryp­

sine. Les essais ont été réalisés à 25°C, dans du tampon phosphate sodique 0.1 M à pH 8.

Nous avons utilisé les mêmes symboles que dans la figure 2. La cinétique a été suivie en étudiant la variation :

A : de l'absorbance à 695 nm

Cependant, nous n'avons pas jugé opportun de travailler à des pH plus

acides, ceci afin d'éviter la dénaturation des cytochromes c.

Signalons aussi que Jusik et al. ( 1976), en étudiant les cinétiques de dégradation et d'inactivation de plusieurs enzymes de levure par les pro­ téases intracellulaires, ont travaillé avec la protéase A à un pH encore plus élevé que nous ( pH 7).

Les divers résultats, exprimés en temps de demi-digestion, sont repris dans le tableau I.

Le temps de demi-digestion a été défini comme étant l'intervalle de temps nécessaire pour obtenir entre les temps initiaux et "finaux", une varia­

tion de 50 % de la propriété suivie. Comme temps final ou temps "infini",

nous avons utilisé le temps à partir duquel plus aucune variation de la propriété étudiée n'est apparente.

Tableau I : Temps de demi-digestion de 1'Iso-I-cytochrome _c de levure

( formes méthylée et non méthylée ) et du cytochrome c de

cheval, par les protéases A et B de levure ou la trypsine. Les essais ont été réalisés à 25°C.

T^y2 ( minutes)

Iso-I-méthylé Iso-I-non méthylé Cheval '

1 * 255 265 150

Trypsine 2 315 315 170

3 320 300 160

1 130 130 340

Prot. B 2 120 130 360

Prot. A 3 plus de 7 heures

O

Méthode de mesure utilisée ;

1 : variation de l'absorbance à 695 nm 2 : variation de l'absorbance à 390 nm

3 : variation de la vitesse de réduction du ferricytochrome _c par une préparation brute de succinate déshydrogénase de levure.

Etant donné que les essais ont été réalisés simultanément pour les trois espèces de cytochrome c considérés, et â partir d'un même stock d'enzymes

protéolytiques, les temps de demi-digestion obtenus pour une même pro­ téase peuvent être aisément comparés.

Par contre, la comparaison des cinétiques de digestion par des protéases différentes est plus délicate et difficile, parce que les unités de pro­ téase ajoutées ne peuvent pas être comparées aisément.

Quelles que soient ces limitations, en examinant le Tableau I, nous pou­ vons constater que :

- des résultats similaires sont obtenus, quel que soit le paramètre choi­ si pour suivre les cinétiques

- le cytochrome _c de coeur de cheval ne parait pas être particulièrement sensible à l'action des protéases de levure. Il est, par contre, beau­ coup mieux dégradé par la trypsine.

- les hémoprotéines de levure, qu'elles soient méthylées ou non, sont assez résistantes à l'action de la trypsine. Elles sont dégradées plus

aisément que le cytochrome c de coeur de cheval par la protéase B.

- même en présence de quantités élevées de protéase A, les propriétés

des cytochrome c étudiés ne varient que très lentement et de façon mi­

nime.

- les vitesses de dégradation de 1'Iso-I-cytochrome _c de levure ne sem­ blent pas influencées par l'état de méthylation de cette hémoprotéine.

Le fait que la protéase A ne puisse dégrader le cytochrome c pour­

rait indiquer que cette protéase n'accepte pas le cytochrome _c comme

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