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Université libre de Bruxelles Institutional Repository Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Deleers, M. (1978). Propriétés interfaciales d'une protéine membranaire: la(Na+ + K+) adénosine triphosphatase (Unpublished doctoral dissertation).
Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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Service de Chimie Générale H Laboratoire de Chimie-Physique des Macromolécules aux Interfaces
PROPRIETES INTERFACIALES D'UNE PROTEINE MEMBRANAIRE :
LA (Na+K^) ADENOSINE TRIPHOSPHATASE
Thèse présentée pour l'ohtention du grade de Docteur en Sciences
Michel DELEERS
1 9 78
Macromolécules aux Interfaces
PROPRIETES INTERFACIALES D'UNE PROTEINE MEMBRANAIRE :
LA (Na+K"^) ADENOSINE TRIPHOSPHATASE
Thèse présentée pour l'ohtention du grade de Docteur en Sciences
Michel DELEERS
1 9 78
qui en a guidé la aéali&atton et n'a ménagé aucun eHoat poua me peAJvettae de le eondutae à bonne ^In.
Je ttem à AemeActea le pAo^esieuA SCHRAM de la VM.B. qui m’a autoAtàé à tAavalllen. dam ion labonatolae.
Ma gAjotltude i'adA.eiie à MeiileuAi RUysSCHAERT et CASVERS poun.
l'aide zt lei nombreux comelli qu'lli m'ont paadlguéi au couAi de ia Aéalliatlon.
Je AemeAcle également toui mei eamoAodei de labonatolae et plxxi ipéclolment Mealeuu CHATELAIN, HECO et PÛSS qui m'ont penmli de
{^Auctueux échangei de vue.
Je tleni à KmeicioA toutei lei peuonnei qui paa leuAi dlicuiitom et leuAi aommentalAeô ont contAlbué à édalAZA et appAo^ondlA lei dl^^é- Aenti oipecti du iujet.
Ma {femme ne peut étAe oubliée pouA ion aide dam la pAépoAotlon du manuicAit.
En{ln, je AemeAcie l'l.R.S.J.A. pouA la confiance et pouA l'atde matéAlelle qu'il m'a appoAtée.
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Cm, Em, Im et Rm ATP
ATPase, Na"*"
AP BLM Chol DPG DPPC DPPE E, E-P, Ej-P
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degré d'ionisation charge élémentaire potentiel de surface pression superficielle viscosité superficielle
aire moléculaire d'un constituant x constante des gaz parfaits
température absolue
capacité, potentiel, courant et résistance de membrane adénosine Triphosphate
+ ATPase adénosine triphçsphat^se activée par Na et K acide phosphatidique
bicouche lipidique (Black ou Bimolecular lipid membrane) Cholestérol
Diphosphatidyl glycerol (cardiolipine) Dipalmitoyl DL oc phosphatidyl choline Dipalmitoyl DL oc phosphatidyl ethanolamine Enzyme et enzyme phosphorylée
Glycerol monooléate (monoléïn) Echange Tritiiom Hydrogène
Une protéine membranaire, impliquée dans le transfert ionique, la (Na"'’ + k"*") ATPase, est étalée sous forme de couches monomoléculaires à l'interface air-eau et à l'interface lipide-eau. Différentes techniques de la physico-chimie des surfaces sont uELlisées pour caractériser le comporte
ment de cette molécule dans un tel environnement. Le travail s'attache à montrer le maintien de la conformation et de l'activité enzymatique de la protéine.
Dans un second stade, 1'ATPase est incorporée au sein de bicouches lipidiques séparant deux phases aqueuses. Pour mener a bien cette partie de l'étude, la formation de bicouches lipidiques symétriques et asymétriques est envisagée en absence de la protéine membranaire. La mise au point des dispositifs expérimentaux permettant l'obtention de tels modèles fait l'objet d'une description détaillée.
Les techniques employées apparaissent comme un moyen d'accès à l'étude de protéines insolubles et également comme une méthode privilégiée pour l'étu de de toutes les réactions biochimiques se déroulant au niveau de la membrane
I. LA MEMBRANE BIOLOGIQUE 3
1. COMPOSITION DE LA MEMBRANE 4
a) Les lipides _ 4
b) Les hydrates de carbone 7
c) Les popotéines 8
2. STRUCTURE DE LA MEMBRANE BIOLOGIQUE 12
3. PHENOMENE DE TRANSPORT 20
a) Phénomènes de diffusion et 20
définition du transport actif
b) Transport actif des cations et 23 propriétés des ATPases
II. MODELES PHYSICO-CHIMIQUES DE MEMBRANES 32 1. MONOCOUCHES RJRES ET MONOCOUCHES MIXTES 32
2. BICOUCHES LIPIDIQUES 34
3. FORMATION DE BICOUCHES LIPIDIQUES 37
4. MEMBRANES ASYMETRIQUES 43
5. TECHNIQUES D'ETUDE DES BLMI 44
a) Conductivité des bicouches lipidiques 45
b) Capacité des bicouches 46
c) Potentiel de membrane 49
d) Potentiel de claquage de diélectrique 52
6. LE LIPOSOME 52
2. TECHNIQUES EXPERIMENTALES 55
a) Potentiel de surface 55
b) Pression superficielle 56
c) Radioactivité superficielle 57
d) Viscosité superficielle 57
e) Activité enzymatique superficielle 59 3. REALISATION DE BICOUCHES LIPIDIQUES 61
a) Bicouches symétriques 61
b) Bicouches asynétriques 62
4. CIRCUITS DE MESURE ET ELECTRODES 64
a) Electrodes 64
b) Circuits 64
c) Mesure de la résistance 65
IV. RESULTATS EXPERIMENTAUX ET DISCUSSIONS 68 1. ATPase A L’INTERFACE AIR-EAU 69 2. ATPase A L’INTERFACE LIPIDES-EAU 70
a) Pression superficielle 76
b) Viscosité superficielle 85
c) Echange isotopique à l’interface 89 d) Activité enzymatique superficielle 95 3. PROPRIEIES ELECTRIQUES DE BRANCHES LIPIDIQUES 99
4. BICOUCHES ASYMETRIQUES 113
5. PROPRIETES DE BICOUCHES MIXTES ATPase-LIPIDES 120
CONCLUSIONS 131
BIBLIOGRAPHIE 133
L'étude de la morphologie cellulaire a introduit très tôt la notion de membrane biologique autonome. Les travaux qui y ont été consacrés ces der
nières années s'intéressent aussi bien à la conposition et à la confomation du natériel constitutif de ces systèmes qu'à la description des processus fondamentaux qui s'y déroulent. Une part importante de l'activité biologique de la cellule est liée à la membrane cellulaire et aux membranes intracel
lulaires .
D'une manière générale, on peut envisager l'étude du conportement des membranes biologiques par étude directe effectuée sur des cellules ou des extraits cellulaires. Cependant, cette approche directe du problème s'avère difficile vu le grand nombre de constituants de la membrane. En raison de la complexité de l'interface biologique, il est coimode d'étudier les fonc
tions et les propriétés des membranes par la réalisation de modèles physico
chimiques plus éloignés de la réalité cellulaire mais plus simples à manipuler.
Le modèle de base servant à l'étude de la membrane biologique est celui de Danielli-Davson constitué d'un double feuillet de molécules de lipides, dont les groupes polaires sont orientés vers la phase aqueuse et les chaînes hydrocarbonnées vers l'intérieur. Toutefois, dans le cas de ce modèle, la présence de 30 à 70 % de matériel non lipidique en interaction avec le double feuillet lipidique constituant le le squelette membranaire, devrait être prise en considération. De plus, l'organisation moléculaire du squelette de base n'est pas laissée au hasard. Il est adapté aux fonctions des enzymes et pro
téines membranaires , constituants non lipidiques principaux des membranes.
Le modèle ainsi défini est connu à l'heure actuelle sous le nom de mosaïque fluide.
d'une protéine mernbranaire, la (Na"*^ + k"*^) ATPase, dans son environnement lipidique et ceci à l'aide de deux modèles physico-chimiques de membranes, l'interface lipide-eau et la bicouche lipidique.
L' ATPase est à la fois une protéine à activité enzymatique et une protéine de transport des ions Na"^ + k"*" . L'étude de ces deux propriétés biochimiques peut être envisagée à l'aide.de ces deux modèles.
Dans un premier stade, une caractérisation complète de cette protéine insoluble en phase aqueuse est envisagée à l'interface air-eau et à l'inter
face lipide-eau. Effectivement, la possibilité de former des monocouches mixtes de différents lipides avec la protéine de transport permet de mieux comprendre la nature des interactions lipides-protéines. On sait en effet que l'activité des enzymes membranaires est fortement modulée par l'environne
ment lipidique et il est intéressant de caractériser l'enzyme en présence de différents lipides. Cette étude nous permet de mettre en évidence les inter
actions lipides-ATPase, de démontrer le maintien d'une structure protéinique stable ainsi que la conservation d'une activité enzymatique.
La suite du travail consiste alors à introduire l'enzyme au sein d'un feuillet lipidique d'épaisseur bimoléculaire séparant deux phases aqueuse s.
Cependant, le passage des ions au travers de l'édifice membranaire s'ef
fectuant dans une direction préférentielle on ne pouvait eivisager que la disposition asymétrique de la protéine de transfert.
Grâce à un appareil de conception originale nous nous sommes proposés de reproduire "in vitro" le caractère asymétrique de la membrane, tant au niveau de sa composition lipidique qu'au niveau de sa composition protéinique. Cette méthode est basée sur l'emploi de deux monocouches préalablement étalées à
l'interface air-eau et ultérieurement mise en contact par leurs chaînes hydrocarbonnées.
La mesure des propriétés électriques de ces membranes démontre clairement l'obtention d'un modèle de membrane biologique complet et permet d'accéder à l'étude du transport actif.
I. LA MEMBRANE BIOLOGIQUE
C’est à la fin du siècle dernier que s'est développée l'idée que toutes les cellules vivantes sont entourées d'une meinbrane autonome. Depuis lors, on est parvenu à une connaissance plus approfondie de la composition et de la structure de ces édifices.
Parmi les multiples fonctions des membranes, on ne peut citer pour rappel que quelques propriétés importantes des membranes plasmatiques (Jain 1973,
Berkaloff et al. 1967, Eavies 1973, Finean 1974) :
a) L'échange de substances entre le hyaloplasme et le milieu extracellulaire assure le maintien de la balance osmotique par une diffusion sélective ou un transport actif de métabolites et d'ions;
b) La capture de substances extracellulaires par endocytose (phagocytose et pinocytose) assure l'apport énergétique, la croissance et la reproduction de la cellule;
c) La reconnaissance cellulaire permet notamment la limitation de la croissance des organes et le contact intercellulaire en assure la cohésion;
d) L'existence de sites spécifiques récepteurs des antigènes, des hormones, des neuro- et des chimio- transmetteurs joue un rôle de premier plan dans
l'activité biologique.
D'un autre côté, certaines membranes se caractérisent par des fonctions
plus spécialisées. Ainsi, des membranes myéliniques assurent l'isolation électri
que des neurones tandis que les membranes de ces derniers se chargent uniquement de produire et de conduire l'influx nerveux.
Par contre, les grandes surfaces membranaires développées dans les mitochondries servent principalement à l'ancrage des protéines de la chaîne de transfert des électrons (Fessenden et al 1971).
1. Composition de la membrane
Malgré la diversité des fonctions assurées par les membranes, la plupart des membranes plasmiques de sources animales possèdent une grande simili
tude de composition : 25 à 60 % de lipides, 40 à 70 % de protéines et 5 % d'hydrates de carbone.
A. LES LIPIDES
On classe dans cette catégorie de substances biologiques la totalité du matériel que l'on peut extraire des systèmes vivants par des sol
vants organiques courants. Une telle définition contraste avec les définitions précises des autres classes de substances de la matière vivante, telles que les protéines, acides nucléiques et hydrates de carbone. Il découle de cette définition que les lipides sont un groupe hétérogène de substances. On peut cependant extraire quelques grandes classes de composés lipidiques. On classe ainsi les lipides sur bases de leurs structures.
(Mahler et al. 1971, Lederer 1970, Chapnan 1975).
Tableau 1 : Les lipides
I. Acides gras : saturés, insaturés et dérivés branchés
II. Lipides dérivés du glycérol : glycérides, glycéryl éthers, glycosyl glycérides et phosphatides
III. Lipides dérivés de la sphingosine : céramides, sphingo- myélines, cérébrosides et gangliosides rv. Les dérivés des stéroïdes
V. Les terpènes et dérivés, certains composés aromatiques et les alcools aliphatiques
Les lipides complexes : lipoprotéines, protéolipides et lipopo
lysaccharides VI.
Les acides gras
Les acides gras sont les molécules les plus représentatives des lipides;
en effet, ce sont des molécules amphiphiles, c'est-à-dire qu'elles possèdent une partie hydrophobe et une partie hydrophile. Ensuite, ils apparaissent de manière prédaninante comme constituants mjeurs des lipides plus complexes. Ils comprennent généralement un nombre pair d'atomes de carbone (Mahler et al. 1971, Eavenport 1971).
Les dérivés du glycérol
Un grand nombre de lipides sont dérivés du glycérol. Les triglycérides provenant de l'estérification de 3 acides gras s\ar le squelette glycérol sont les lipides les plus abondants sur terre. Ils constituent en fait un stockage d'énergie.
exemple d'un monoglycéride :
glycéryl monoléate (monoleîn)
CH^ - (CH^)^ - CH = CH - (CH^)^
*"-0- CH^ - CHOH - CH^OH
Les glycérophospholipides qui fonœnt la majeure partie des lipides phosphorés sont des dérivés de l'acide phosphatidique (acide 3 S-N glycérophophorique). Les glycérophospholides sont les lipides les plus rencontrés dans les membranes animales et possèdent tous le squelette
suivant
Rj - COO - CH^
0 R., - COO - CH - CH„ - 0 - P - OH
0 (-)
L'estérification du groupe phosphate avec une des fonctions alcool de 5 substances simples donne les 5 glycérophospholipides les plus répandus dans les membranes (Finean 1974), à savoir :
- La phosphatidyl choline
Rj - COO
- COO
- La phosphatidyl éthanolamine - CH„
0
- CH - CH - 0 - P - 0 - CH -
/ t ^
O(-)
CH CH^^-^N - CH^
CH^
O(-)
- La phosphatidyl sérine
R - COO - CH-
I ^
R - COO - CH - CH^ - 0 0
P - 0 - CH
t 2
O(-)
CH' .COO
‘NH„
(-) (+)
- La diphosphatidyl glycérol (cardiolipine)
R-COO-CH. 0 CH -OOC-R
I? f 2
R-COO-CH-CH., -O-P-O-CH- -CH0H-CH„ -O-l’-O-CH., -CH-OOC-R 0II
O(-) O(-)
- La phosphatidyl inositol R - COO
R - COO
- CH-
CH - CH^- 0 0 - P
OH
- 0-<^
OH HO^OH
Les sphingolipides sont caractérisés par la présence d'un amino-alcool à longue chaîne, la sphingosine. On distingue dans cette classe de lipides : les céramides, les sphingomyélines et les cérébrosides caractérisés par la présence d'un sucre.
Les gangliosides sont des glycosphingolipides composés de la sphingosine, d'un acide gras, d'un ou plusieurs sucres et de l'acide neuraminique ou son dérivé N-acétyl acide neuraminique.
Les lipides dérivés des stéroïdes
Les stéroïdes constituent une classe de lipides qui diffèrent principale
ment des autres lipides par le fait qu'ils ne sont pas saponifiables. Le stéroïde prédominant dans les membranes est le choléstérol.
B. LES HYDRATES DE CARBOIÆ
La proportion d'hydrates de carbone dans les membranes n'est jamais plus élevée que 10 % en masse et souvent beaucoup moins. En général, ces molé
cules sont présentes principalement sous forme d'oligosaccharides dont approximativement 90 % sont liés par covalence à des protéines. Les 10 % restant sont liés à différents squelettes hydrocarbonnés et forment les classes des glycolipides et des gangliosides.
Il est remarquable que malgré la centaine de différents monosaccharides trouvés dans la nature, on trouve seulement une dizaine de monosaccharides différents dans les oligosaccharides liés aux lipides et aux protéines
(Bretscher et al. 1975). Cependant, l'arrangement de quelques unités
monosaccharidiques entre elles peut mener à des milliers d'oligosaccharides La majorité de ces petites chaînes saccharidiques semblent servir comme récepteurs membranaires ou comme sites de reconnaissance aux nombreuses hormones, messagers chimiques et protéines spécifiques (Deleers et al. 1976 Poss et al. 1978). Etant donné ces rôles privilégiés et leur haut carac
tère hydrophile, on comprend aisément que les hydrates de carbone sont principalement orientés vers la phase aqueuse sur la partie extérieure de la membrane.
On comprend de même que ces oligosaccharides bloquent la molécule sur laquelle ils sont fixés, dans une situation unique (Stoffyn 1977).
C. LES PROTEINES
Les protéines sont en quantité et en qualité, les macromolécules essen
tielles au fonctionnement des cellules. Elles représentent approximati
vement 60 à 80 % du poids sec de la matière vivante. Environ 70 % des protéines sont associées aux membranes.
la structure des protéines membranaires apparaît comme un des aspects les plus intéressants de leur étude et permet d'expliquer leur caractère hydrophobe ou hydrophile. On remarque tout d'abord que les protéines membranaires ne sont pas fortement différentes des protéines solubles
quant à leur composition en acides aminés. Il a cependant été suggéré qu'un contenu plus grand en acides aminés apolaires et hydrophobes devait caractériser les protéines membranaires. On constate ainsi que la najorité des protéines solubles et donc périphériques à la menbrane, ont des
polarités de 47 % et plus, tandis que les protéines "intégrales" ont des polarités inférieures à 40 % (Gitler 1976).
Cependant, si la composition en acides aminés varie peu d'ime protéine hydrophile à une protéine à caractère hydrophobe, il apparaît rapidement que les structures primaires sont fortement différentes. Ainsi, les acides aminés hydrophobes et apolaires peuvent être confinés dans une partie de la macromolécule et lui conférer un caractère amphiphile. Par contre, si les acides aminés hydrophobes sont distribués sur toute la chaîne polypeptidique, la protéine garde sa solubilité. On renarque donc que le caractère amphipathique des protéines dépend principalement de la succession des acides aminés.
Les études aux rayons X permettent d'étudier le reploiement de la chaîne polypeptidique et l'association spécifique de structure tertiaires en un seul édifice. Les résultats obtenus par cette technique indiquent de plus que les protéines solubles ont leurs résidus ioniques répartis plus ou moins uniformément sur la s\irface de la iiacromolécule. Elles sont donc solubles parce que tous les groupes ioniques peuvent interagir fortement avec l'eau. Par contre, les protéines amphipathiques ont tendan
ce à être insolubles dans l'eau étant donné l'existence de parties hydro
phobes décrites plus haut (Singer 1975).
Des méthodes de séparation et de purification nouvelles ont pu mettre en évidence les différences de caractère hydrophiles et hydrophobes de nombreuses protéines dans un grand nombre de membranes.
Les protéines et glycoprotéines extraites aux forces ioniques faibles peuvent souvent être manipulées et purifiées a l'aide des techniques conventionnelles de fractionnement en solution aqueuse.
Les difficultés techniques proviennent surtout du fractionnement de protéines hydrophobes intégrales (Hughes 1976). En général, le dodecyl sulfate de sodium (SDS) est largement employé pour une solubilisation efficace et non dénaturante des membranes. D'autres détergents comme le Lubrol, le desoxycholate et le Triton X 100 sont aussi couramment
utilisés. Le traitement est ensuite suivi par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide contenant un taimpon SDS. Des chromatographies en tampon SDS ont été également réalisées, avec succès, pour séparer les composants membranaires non lipidiques. Les techniques d'électro
phorèse sur gel avec gradient de pH permettent un bon fractionnement des protéines membranaires. On peut également extraire certaines protéines intégrales par action de sels minéraux très concentrés
(Nakao et al. 1965).
La méthode de solubilisation par le dodecyl sulfate de sodium suivie par fractionnement sur gel de polyacrylamide a été abondamment appli
quée aux membranes d'érythrocytes (Capaldi 1972). Cette technique a permis à un bon nombre de chercheurs de détecter un nombre relativement limité de protéines et de glycoprotéines.
La glycophorine, glycoprotéine principale présente dans les membranes d'érythrocytes humains, a maintenant été abondamnent étudiée. Elle consiste en une chaîne protéinique de 200 acides aminés auxquels sont attachés un nombre important de groupes oligosaccharidiques. La protéine contient ainsi 60 % d'hydrates de carbone et 40 % d'acides aminés pour une masse de 50000. Les résidus saccharidiques, extrêmement polaires, sont tous localisés sur une première partie de la chaîne polypeptidique.
Q.S
Cetire première région est ensuite suivie par une région d'environ 25 résidus amino-acides hautement hydrophobes. Il vient ensuite du côté C terminal de la glycophorine, une chaîne hydrophile ne contenant pas de résidus saccharidiques (Gitler 1976).
La première partie de cette protéine est étalée sur la face extérieure de la membrane tandis que la seconde partie hydrophobe est vraisembla-
O
blement sous forme d'une hélice alpha de 40 A de long, ce qui est
compatible avec l'épaisseur de la bicouche lipidique. Cette éventualité permet à la portion C terminale de se trouver à l'intérieur de la
cellule. Celle-ci ne portant pas de groupes saccharidiques semble effec
tivement moins inportante en tant qu'éventuel site de reconnaissance.
Un schéma des configurations possibles des différentes glycoprotéines dans les membranes est représenté dans la figure I - 1 (Hughes 1976).
Figure I 1 : Trois configurations possibles pour l'incorporation de glycoprotéines dans les membranes ; a) l'inclusion se fait sans interaction de la partie apolaire de la protéine dans la embrane, b) la partie apolaire est sans structure et étendue ans la membrane, c) la partie apolaire traverse la bicouche de manière structurée .
Une seconde protéine, la cytochrome isolée des membranes microsomia- les, revêt aussi un caractère hautement amphipathique. Ici, la portion hydrophile de la protéine contient environ 100 acides aminés polaires et apolaires, le groupe hémique ainsi que le site enzynatique. Cette portion peut facilement être coupée de la membrane à l'aide d'enzymes protéolytiques. Le reste de la protéine consiste en 40 acides aminés extrêmement hydrophobes qui permettent à la protéine un ancrage ferme dans le feuillet bilipidique.
Cette portion ne peut être atteinte par les enzymes protéolytiques, prouvant ainsi qu'elle échappe bien à la solution (Singer 1975, Freedman 1976).
L'enzyme qui est responsable de la réduction du cytochrome b^, la NADH-cytochrome b^ - réductase apparaît comme ayant une structure similaire au cytochrome b^ (Gitler 1976, Hughes 1976).
On conçrend ceci aisément étant donné la nécessité de proximité de ces deux enzymes pour que la réaction de réduction ait lieu. Un schéma de la réduction du cytochrome c soluble par la NADH est représenté dans la figure 1-2.
cyt. c réduit
2. Structure de la membrane biologique
A la fin du XIXème siècle, Overton constata que les substances qui sont lipophiles pénètrent plus facilement dans les cellules que les substances hydrophiles (Gorter et al. 1925). Il conclut à l'hydrophobicité des
membranes mais les premières idées détaillées au sujet de 1'organisâtion des membranes cellulaires ont été basées sur des expériences très sirples de Gorter et Grendel en 1925, qui ont extrait les lipides d'un nombre connu d'érythrocytes. En canparant l'aire de la monocouche comprimée formée à partir des lipides extraits et l'aire estimée de ces globules rouges, ils sont arrivés à la conclusion qu'il y avait dans un érythrocyte de quoi forroer une monocouche ayant une aire générale égale à deux fois sa surface. Ils en conclurent à la nature bimoléculaire de la membrane lipidique.
De nouvelles observations expérimentales, notanment la présence d'un taux élevé d'acides aminés ont amené Danielli et Davson à proposer en 1935, comme modèle de membranes biologiques, une bicouche de molécules
phospholipidiques dans laquelle les phospholipides orientent leurs groupe
ments hydrophiles vers l'extérieur et leurs chaînes lipidiques vers l'intérieur (Bretscher 1973, Jain 1973).
Cette structure phospholipidique en bicouche est prise en sandwich entre deux couches de protéines ou de polysaccharides.
Cependant, ce modèle (fig. I - 3) n'expliquait pas la perméabilité élevée à l'eau et à d'autres nfôtabolites comme le glucose. Le modèle de
Eanielli-Davson subit alors quelques modifications, notanment par l'in
troduction de pores structuraux (Fig. I- 4) (Lucy et al. 1964).
A partir de 1943 la microscopie électronique confirme la réalité naté- rielle de la structure en bicouche couverte par une couche de protéines non seulement à la périphérie de la cellule, mais encore autour d'orga
nites cytoplasmiques (Pethica et al. 1970, Berkaloff et al. 1967).
C'est vers cette époque que la structure de la double couche a été
comprise sous le nom de membrane unitaire étant donné que les microphoto
graphies électroniques représentaient toujours la même structure. En effet,les images obtenues au microscope électronique de haute résolution de membrane fixée au tétroxyde d'osmium présentent deux traits denses
O
d'approximativement 20 A d'épaisseur séparés par une cinquantaine d'Angstroëm. Ceci peut être interprété comme une évidence expérimentale de la présence d'une bicouche de lipides comme base unique de l'architec
ture membranaire. Le modèle de la membrane unitaire appelé aussi modèle de Gorter - Grendel - Danielli - Davson - Robertson est donc représenté par une bicouche phospholipidique de 40 à 50 A d'épaisseur à laquelle
O est liée de part et d'autre une couche de protéines de quelque 15 A d'épaisseur (Fig. 1-5) (Fox 1972).
Les expériences accumulées au cours des dernières années à l'aide de la microscopie électronique associées aux techniques de cryodécapage
(freeze fracture, freeze etching) effectuées sur des cellules, ainsi que les expériences de diffraction de R.X. effectuées sur des structures
lipidiques ont imposé l'idée que la membrane n'est pas une structure figée (voir figures I - 6a et I - 6b) (Gulik - Krzywicki 1975). Les micrographies électroniques de demi-membranes obtenues par cryodécapage (figure 1-7) montrent différentes structures régulières de la membrane, semblables à des mosaïques. Ces structures dépendent principalement de la température et de l'environnement aqueux. Dès lors, il apparaît clairement, que ces structu
res possèdent une haute mobilité et que la membrane adapte son architecture aux nécessités de ces fonctions.
Le modèle initial ne répondant donc plus aux données expérimentales et aux considérations thermodynamiques, subit alors d'importantes modifications.
En effet, dans le modèle de la mosaïque fluide de Lenard et Singer (Singer et al. 1972), la phase phospholipidique est organisée comme une bicouche fluide discontinue dont une fraction interagit spécifiquement avec les protéines membranaires.
FIG I 5
lipidique (Gitler 1976, Singer 1975) (Fig. I - 6a et I - 6b). Les protéi
nes périphériques constituent une suite discontinue de molécules hydro
philes fibreuses accrochées à la membrane et servant dans ce cas à la structurer.Les autres protéines périphériques sont en général des enzymes, celles de la glycolyse ou de la chaîne respiratoire par exemple (Freedman 1976).
Ce dernier modèle, généralement accepté, fait donc intervenir les interac
tions polaires et apolaires des protéines avec une natrice lipidique flui
de. Cet ensemble forme ainsi une solution bi-dimensionnelle de protéines orientées où les lipides peuvent jouer un rôle déterminant. En effet, l'influence des lipides sur l'activité d'enzymes membranaires est mainte
nant bien établie.
Cette influence a principalement été étudiée dans le cas de la réactivation des ATPases de transport (Kimelberg 1976). Ainsi, la plupart des auteurs
(Fenster et al. 1967, (Goldman et al. 1973, Kimelberg et al. 1972, Roelofsen et al. 1973) ont montré que la phosphatidyl sérine est le lipide qui réacti
ve le mieux l'enzyme. Cependant ces résultats sont encore fort controversés ils dépendent de la manière dont l'enzyme est délipidisée lors de la désacti vation et dépendent aussi de la pureté des lipides employés lors de la
réactivation.
Ainsi, l'enzyme peut être délipidisée à l'aide de phospholipases, par exem
ple. Mais, les différents auteurs n'arrivent pas à une désactivation identi
que. Celle-ci est évidemment fonction du type de phospholipase employée et de la pureté de cette dernière.
Roelofsen et Van Deenen (1973) ont étudié la désactivation d'une ATPase par transfomation du lipide activant. La phosphatidyl sérine est trans
formée en phosphatidyl éthanolamine par l’enzyme PS décarboxylase. En incubant le système désactivé avec la phosphatidyl sérine, l'enzyme retrou
ve son activité initiale, la phosphatidyl sérine apparaît donc canme le lipide nécessaire à l'activité enzymatique de 1'ATPase. Cependant, Kimelberg et Papahadjopoulos (1972, 1974) montrèrent que la phosphatidyl glycerol provoquait une aussi bonne réactivation que la phosphatidyl sérine.
Las études sur l'activité ATPasique n'ont pas seulement donné des infor- nations sur la spécificité lipidique mais ont permis d'élucider le contrô
le de l'activité des protéines membranaires par la fluidité de la phase lipidique. En effet, le logarithme de l'activité des ATPases membranaires peut être porté en graphique en fonction de l'inverse de la température
(représentation d'Arrhénius). L'activité enzymatique présente alors des discontinuités survenant à la température de transition de phase des lipides. La transition de phase des lipides est principalement attribuée aux chaînes hydrocarbonnées des phospholipides qui se trouvent dans un état relativement solide et ordonné en dessous de la tenpérature de transi
tion et dans un état plus fluide et désordonné au dessus de la température de transition (Grisham et al. 1973). Cette région de transition peut être élargie par l'emploi de mélanges de lipides. Ainsi, des taux croissants de cholestérol augmentent progressivement la largeur de la transition
(fig. 1-8). Les mélanges phospholipides-cholestérol forment alors un état fluide intermédiaire . Cependant, la présence de discontinuités bien marquées dans la représentation d'Arrhénius pour des enzymes enchâssés dans des membranes contenant un taux élevé en cholestérol suggèrent un microenvironnement des enzymes très pauvre en cholestérol. Warren et al.(197 3)ont prouvé que l'ATPase qui est responsable du transport actif de Ca''”'’ interagit sélectivement avec des phospholipides par l'intermédiai
re de leurs groupes polaires et que l'anneau des phospholipides directement en contact avec 1'ATPase exclut le cholestérol. De plus, si les phospholi
pides sont remplacés par du cholestérol, l'enzyme se maintient dans une forme stable mais inactive. Le complexe ATPase-cholestérol peut seulement être réactivé complètement en déplaçant le cholestérol du microenvironne
ment de l'ATPase par des phospholipides. Pour ce faire, le milieu cholesté
rol - enzyme - est incubé avec un large excès de phospholipides.
Figure I 8 : des préparât!
entre l'état lestérol est tent dans un même à basse
L'addition de cholestérol (pourcentage molaire) à ons de phospholipides élargit la transition de phase cristallin et l'état gel , Lorsque le taux de cho- élevé, la transition disparait et les lipides res- étât liquide cristallin avec des chaînes fluides température ,
L'orientation et la disposition unique des protéines et des hydrates de carbone dans la membrane confèrent a cette dernière un caractère fonc
tionnel entièrement asymétrique. L'asymétrie lipidique n'est cependant pas absolue, car chaque type de lipide est présent sur les deux côtés de la membrane, en fractions assez fortement différentes.
Ce n'est en fait que récenment (Bretscher 1972) qu'on a pu mettre en évi
dence par une série d'expériences élégantes, l'asymétrie dans les membranes d'érythrocytes.
Les travaux de Bretscher suggèrent que deux lipides, le phosphatidyl choline et la sphingonç^éline, sont principalement présents à l'extérieur de la
membrane du globule rouge, tandis que la phosphatidyl éthanolamine et la phosphatidyl serine sont localisées dans la moitié interne de la membrane.
De plus amples études ont permis par après de conclure à la généralité de l'asymétrie lipidique (Rothmann et al. 1977). Ainsi, la distribution des phospholipides a été étudiée dans le cas du virus influenzae, et a été déterminée par l'emploi de deux phospholipases et de deux protéines échan- geuses de phospholipides.
Il y a deux types d'asymétrie phospholipidique évidente dans la membrane du virus influenzae. Premièrement, il y a plus de phospholipides dans la partie interne de la membrane que dans la partie externe. Secondement, la composition phospholipidique des deux moitiés est différente (Fig. 1-9)
(Rothnann et al. 1976). '
20
2 0 Q
§20 Uj O 5 O%
Q.
60
SM
PE PS
U
Intérieur
PE SM PC
" PI
Intérieur
Figure I 9 : Distribution asymétrique de phospholipides dans les membranes d'érythrocytes et les membranes de virus influen- zae, PT (phospholipides totaux), SM (sphingomyé1ine), PC, PE, PS et PI (phosphatidyl choline, éthanolamine,sérine et inositol)
Dernièrement l'asymétrie du cholestérol a été mise en évidence sur certains types de cellules (Bittman et al. 1976). Dans certaines membranes, les 2/3 du cholestérol serait localisé dans la moitié extérieure de la bicouche li
pidique .
L'asymétrie lipidique dans une membrane semble donc être générale. Cepen
dant, alors que le rôle de la disposition asymétrique des protéines et des sucres se comprend aisément, le rôle joué par l'asymétrie lipidique n'est pas encore clairement établi. Une des possibilités est que cette asymétrie des groupes polaires en conjonction avec une asymétrie de chaînes d'acides gras, correspondent à une différente de fluidité des deux monocouches accolées (Rothmann et al. 1977). Cette possibilité n'est pas à exclure.
Par contre, dans le cas de membranes où le taux de cholestérol est élevé, cette possibilité est absurde. En effet, le cholestérol tend à fluidifier les membranes solides et à solidifier les membranes fluides.
Une autre possibilité est que l'asymétrie des groupes polaires provoquerait une séparation de charge électrostatique, introduisant une distribution ionique différente de part et d'autre de la membrane. Cette distribution ionique serait nécessaire à l'activation de certains enzymes membranaires.
3. Phénomènes de transport
A. FHENOMES DE DIFRJSION ET DEFINITION DU TRANSPORT ACTIF
Si nous considérons dans un premier temps la situation tout à fait générale d'une membrane séparant deux phases aqueuses, les phénomènes de transfert intervenant dans un tel système peuvent être décrits par quelques équations simples.
L'existence d'un gradient de concentration de molécules solubles au niveau de la membrane provoque un mouvement des molécules dans le sens du grandient, obéissant à la loi de la diffusion de Fick
^ - Dg . ^ I,:
OÙ D est le coefficient de diffusion et <-o la mobilité, R et T ont leur signification habituelle. Nous constatons que le flux uni
directionnel est proportionnel au gradient de concentration .
De plus, le mouvement des solutés ionisés est influencé par l'exis
tence d'un potentiel de membrane. La loi de la diffusion d'espèces chargées est alors obtenue en ajoutant un terme de gradient électri
que à l'équation de Fick. L'équation de Nemst-Planck s'écrit (NeümCke et al. 1969, Finean 1974)
ZF dV ,RT ^
X dx zf|Î)
dx 1,2
Si nous considérons le rapport des flux pour des espèces non chargées il est clair d'après l'équation, que cette quantité sera égale au rapport des concentrations pour chaque espèce. Dans le cas des ions, le rapport des flux entrant et sortant par simple effet de diffusion doit tenir compte du potentiel de membrane. L'équation 2 permet d'écrire (Stein 1967, Florkin 1972, Tonomura 1973) :
(p efflux Cint ~ RT 1,3
où Z est la valence de l'ion considéré. F, R et T ont leur signification habituelle.
E1 potentiel.
y’ et correspond à la différence de
Au cours d'expériences simples, le rapport des flux d'une espèce ioni
que peut être mesuré aux moyens de traceurs radioactifs. Ce rapport
peut de même être calculé au départ de l'équation 1,3 . Expérimentalement, on remarque que le rapport des flux trouvés dans le cas de diverses
membranes biologiques est très différent de la valeur calculée. Il appa- radtdonc que pour la majorité des cellules, le flux de divers ions et molécules n'obéit pas à cette équation. On peut donc conclure à une participation du métabolisme cellulaire et à un transport actif d'ions et de molécules.
Le transport actif se définit alors comme le déplacement d'ions où de molécules contre un gradient de concentration, avec accroissement de l'énergie libre dans le compartiment le plus concentré (Lehninger 1969).
Ce mécanisme consomme de l'énergie. Il est donc évident que de l'énergie chimique doit être introduite dans le système afin que la deuxième loi de la thermodynamique soit respectée. Le phénomène ainsi défini est général à toutes les cellules des organismes vivants. En effet, toutes les membranes cellulaires ont cette propriété d'établir des différences de composition ou de concentration entre les liquides qu'elles séparent.
Les expériences de flux peuvent également être effectuées en présence d'inhibiteurs des phosphorylations de la chaîne respiratoire. On voit alors que les valeurs des flux expérimentaux et théorique sont en bon accord. Ce résultat indique que lorsque une source d'énergie métabolique de la cellule est détruite, le transport actif est supprimé. Ainsi, tous les travaux effectués sur des membranes d'axones, d'érythrocytes, de muscles ou d'épithéliums chez différentes espèces vivantes ont permis de démontrer que l'adénosine triphosphate ATP, est la source d'énergie nécessaire au transport actif (Katz 1966, Tonomura 1973, Lin 1971).
Si le transport actif de Na"*" et de k"*" a été particulièremsnt étudié, d’autres ions (Ca"'’t h"*") (Tonomura 1973, Warren et al. 1975, Racker et al. Racker 1973, Durbin et al. 1974, Lee et al. 1974) ainsi que différents sucres et acides aminés (Schoffeniels 1966) peuvent être transportés selon le même schéma (tableau n° 2).
Tableau n° 2 (Florkin et al. 1972)
Transport actif Type cellulaire A. ions inorganiques
Na"^ et Cl” et h'^
Ca++
La plupart des cellules
Epithéliums gastriques des vertébrés, branchies des poissons, plantes
carnivores
La plupart des cellules B. ions organiques -
Certains acides aminés
Certains acides gras
Reins, muscles, nerfs, épithéliums chez les vertébrés.
Arthropodes monocellulaires.
Epithéliums intestinaux C. Molécules
D glucose, D galactose Epithéliums intestinaux.
Muscles, levures.
■E, TRANSPORT ACTIF DES CATIONS ET PROPRIETES DES ATPases
Une grande variété de cellules naintiennent un gradient de concentra
tion de sodium et de potassium au niveau des membranes plasmiques.
Invariablement, le sodium est présent en forte concentration à l'ex
térieur des cellules tandis que la concentration du potassium est supérieure à l’intérieur. Les concentrations intracellulaires en k"*”
sont supérieures à lOOmM et inférieures à 20mM pour le Na'*’.Le milieu extracellulaire possède généralement des concentrations supérieures à llOmM en Na"*” et inférieures à 15mM en k'*’.
L'existence de ces gradients de concentration est à l'origine de potentiels bio-électriques.
Si la membrane cellulaire était perméable au seul cation k"^, on obser
verait une différence du potentiel électrique liée au gradient de concentration, selon la relation de Nernst;
^int ■ ^ext M (K~^)ext
ZF (K+)int I,A
où Eint-Eext est la différence de potentiel existant entre le liquide intracellulaire et le milieu extracellulaire et où (K''’)int (K"'’)ext sont respectivement les concentrations intérieures et extérieures en
k'*’. Cette relation se déduit aisément de l'équation 1,3 lorsque 0 influx = 0 efflux.
Eans les conditions normales, la différence de potentiel est de 60 à 90mV. Etant donné que le rapport des concentrations de l'ion potassium, de l'extérieur à l'intérieur de la cellule, (K^)ext, vaut 0,032, un potentiel de 90mV laisse supposer que le k'*’ 4st^ jritiquement le seul ion qui traverse la membrane.
Cependant, les membranes sont également perméables à Cl et Na"^.
Il faut alors tenir conpte des gradients de concentration des diffé
rents ions mobiles, ainsi que de la perméabilité relative de la membrane vis-à-vis de ceux-ci.
où Pjj^, P J, et P^^ représentent les coefficients de perméabilité rela
tive (ELorkin et al. 1972, Rosenberg 1969).
Le mintien d'un gradient de cations sert principalement à la régula
tion du volume cellulaire (protection contre la pression osmotique).
De plus, certaines cellules dites cellules conductrices, ont acquis au cours de l'évolution, un mécanisme leur permettant d'utiliser l'énergie des gradients ioniques. Les cellules nerveuses utilisent l'énergie des gradients de Na'*’ et k'*’ pour la transmission de l'influx nerveux. Cependant, vu la perméabilité élevée des membranes vis-à-vis des ions, les concentrations des ions de part et d'autres ne devraient pas tarder à s'égaliser. Quel est alors le moyen utilisé par la membrane pour effectuer le travail nécessaire au maintien de la différence de concentration et quel en est le mécanisme ?
Le fondement biochimique du transport actif de Na'*’ et k'*’ a été découvert pour la première fois dans la fraction microsomiale de nerfs de crabes.
Skou (1957) a pu extraire une enzyme membranaire possédant une activi
té ATPasique en présence de Na"^, k"'' et Mg"*"*'. Il suggéra que cette protéine était responsable du transport actif puisque l'ATP est néces
saire au transfert des ions Na"*" et k'*’. Des activités similaires ont été observées dans bon nombre de tissus et organes, tels que le cortex cérébral, la glande parotide ou la vessie. De nombreuses expériences prouvèrent par la suite que le transport actif de Na'*' et de k"*" était bien effectué par une enzyme membranaire à activité ATPasique.
Le principe des flux actifs et passifs des ions k"^ et Na'*’ est présenté dans la figure I-IO. On observe tout d'abord l'existence d'un flux de diffusion élevé des k"*" dans le sens du gradient (1). La valeur du potentiel d'équilibre des k"*" est proche du potentiel de membrane cal
culé selon 1 ' équation ï ). La différence entre les deux valeurs est de 5 à 10 mV. On observe également (2) un flux de diffusion entrant, dû au fait que le potentiel à l'intérieur de la cellule est fortement négatif. L'état stationnaire de concentration en k"*" est maintenu par l'intervention d'un influx actif de cation réalisé par la pompe Na"*" + k'*’
actionnée par l'énergie contenue dans l'ATP (3).
Enfin, la valeur du potentiel d'équilibre des ions Na''' est très éloignée du potentiel de membrane. Cette différence vaut -150 à -16QmV. Il
s'ensuit un flux entrant (5) de diffusion très élevé. Celui-ci ne peut être contrebalancé que par un efflux actif (4) d'intensité égale à celle du flux entrant de diffusion (Katz 1966,3erkaloff et al. 1967).
P
25
Figure en bas de page:Lire ”flux de K"*"" au lieu de "flux de lla'^" et vice versa
dans le milieu intracellulaire (Schoffeniels 1966, Albers 1976).
Cette pompe Na"*” + k"*" peut continuer à fonctionner lorsque tous les constituants cytoplasmiques, excepté l'ATP et Na'*’ sont éliminés. Le système requiert donc ATP et Na"*" du côté interne de la membrane.
Les deux aspects les plus renarquables du transport actif d'ions sont la spécificité du système et le flux vectoriel résultant d'une réaction chimique libérant de l'énergie. On remarque aussi que la disposition du système enzymatique transporteur est asymétrique.
Les aspects fonctionnels principaux d'une Na"^ + k'*’ ATPase (EC : 3, 6, 1, 4, Adénosine triphosphate phosphohydrolase) peuvent être résumés en
quelques points (Jain 1973) :
a) Le système du transport actif est localisé dans la membrane et est orienté de nanière anisotropique, perpendiculairement à la membrane.
b) Le système est spécifique aux ions sodium et potassium, avec une affi
nité des ions Na"^ pour la surface interne de l'enzyme, et une affi
nité des k'*’ pour la surface externe. La présence des Na'*’ à l'inté
rieur de la cellule et des k'*' à l'extérieur est requise pour le fonctionnement de l'enzyme. Ainsi, le transport dépend des concentra
tions des ions à transporter.
c) Le passage des ions s'effectue contre leur gradient de concentration en utilisant comme énergie, l'ATP couplé stoéchiométriquement au transport des cations suivant le schéma suivant (Skou 1973).
3 Na'*’. + 2 k'*' + MgATP. ATPase
int ext int --- 3 Na
ext + 2 K int + MgADP. ^ + P. int.
® int 1
dire qu'il y a plus d'ions Na"^ qui sont expulsés que de k"*" qui pénè
trent.
d) Le système est inhibé par des glycosides cardiaques comme l'ouabaine lorsque ceux-ci sont présents sur la face externe des membranes.
L'inhibition par les glycosides peut partiellement être levée par addition d'ions potagium en plus haute concentration au milieu extérieur (Lin 1971).
e) D'autres cations que Na et K peuvent être transportés activement par des ATPases. Ainsi, le Ca'*'peut être transporté au niveau de cer
taines membranes par une Ca'*"*’ ATPase (qui dépend néanmoins de la présence de Mg"'"'’) (Tonomura 1973, Shamoo 1974, Shamoo et al. 1973).
Une représentation schématique du transport couplé de Na"'’ et de k"'"
devient alors celle de la figure I-ll (Lin 1971).
Les travaux consacrés à l'ATPase se préoccupent principalement de définir le système ATPase-membrane ainsi que de montrer quelles sont les molécules essentielles au fonctionnement du système enzymatique.
Une autre préoccupation de nombreux chercheurs consiste à purifier le système enzymatique jusqu'à l'obtention de la forme la plus active (NaJcao et al. 1965 et 1974, Jdrgensen et al. 1969, Jdrgensen 1974, Towle et al. 1970).
Les préparations d'ATPase les plus pures obtenues par électrophorèse sur gel de polyacrylamide après solubilisation au dodecyl sulfate de sodium, montrent l'existence de deux bandes différentes et laissent supposer la présence de deux sous-unités seulement. Une première bande diffuse correspondant à un poids moléculaire apparent de 45000 à
60000 s'avère être une seule sialoglycoprotéine. La seconde bande correspond à un poids moléculaire apparent de 90000 à 100000. Cette seconde bande contient le site catalytique qui est phosphorylé pendant la réaction de transport (Albers 1976, Shamoo et al. 1974).
Tableau n° 3 : I^sse des différentes sous-unités obtenues lors de purifications de Na + K ATPase
- bande I bande II
Cerveau de boeuf 55000 94000 ^Hokin 1974)
Erythrocytes - 105000 (Tononura 1973)
Rein de chien 57000 84000 (Kyte 1971)
50000 95000 (ânith et al. 1975) Organe électrique de
poisson torpille 47000 93000 (Hokin 1974) 40-60000 85-135000 (Shamoo 1974) Rein de Lapin 57000 96000 (Jdrgensen 1974)
40000 100000 (Giotta 1976).
Cependant, il apparaît que le rapport de fixation de l'ATP ou de l'oua- baine dans la bande des grandes sous-unités n'est pas de une mole pour une nasse de 100000, mais bien de 1 mole pour une masse de 200000.
Ceci laisse à supposer qu'il existe dans la bande correspondant aux masses élevées, deux polypeptides différents dont un seul est capable de fixer l'ATP (Skou 1975). L'existence de deux sous-unités ayant des masses voisines de 100000 et d'une sous-unité ayant une masse voi
sine de 50000 convient à fixer aux alentours de 250000 la masse de la protéine. De telles conclusions peuvent être dégagées de l'étude d'un grand nombre d'ATPases (Hokin 1974).
La chrcmatographie sur gel peut également être effectuée en présence d'un autre détergent, le Triton-X-100. Les différents polypeptides réagissent alors pour fomer des composés de masses moléculaires de
168000, 200000 et 260000 (Giotfa 1976). Ces résultats suggèrent que l'on obtient respectivement 1 'aggrégation d'une grande et d'une petite sous-unité, l'aggrégation de deux grandes sous-unités et enfin de la molécule d'ATPase entière formée de deux grandes sous-unités différen
tes et de la glycoprotéine plus petite. Ces résultats sont par ailleurs confirmés par la mesure des masses molaipes d'ATPases de membranes
d'érythrocytes et de cortex cérébral. Celles-ci sont en effet de l'ordre de 250000 (Lin 1971). L'extraction d'une ATPase du cortex cérébral par Nal et le Lubrol comme détergent donne une masse moléculaire de 280000.
Enfin, des préparations de protéines solubilisées fixent l'ATP dans la proportion d'une molécule d'ATP fixée pour une protéine de masse de 251000. Des expériences similaires indiquent que l'ouabaine est fixée par une molécule de masse de 282000 (Hokin 1976).
I^gré cela, la structure quaternaire de la Na'*’ + k'*’ ATPase et la stoe- chiométrie des sous-unités est encore mal connue. Les estimations de 250 à 260000 sont cependant de plus en plus concordantes. La détermina
tion de nasses moléculaires plus élevées est probablement due au fait que la molécule est mal délipidisée ou chargée d'une grande quantité de détergent.
Les Na"*" + k"*” ATPases constituent donc des structures complexes en contact étroit avec le matériel lipidique meriibranaire. La présence de ce matériel est d'ailleurs requise pour que l'activité de l'enzyme soit optimale (Kimelberg et al. 1972, Kimelberg 1976).
Nous avons déjà montré plus haut que les résultats relatifs à la nature des lipides essentiels à l'activation de l'enzyme restent contradictoires (Kimelberg 1976). En résumé, la plupart des travaux montrent que les phospholipides acides (phosphatidyl sérine et diphos- phatidyl glycérol) provoquent une meilleure réactivation sur des sys
tèmes initialement délipidisés (Roelofsen et al. 1973). Cependant, certains auteurs ont prouvés que la phosphatidyl choline et le cholestérol pouvaient avoir un effet similaire (Kimelberg 1976).
Malgré le grand nombre de travaux consacrés aux Na"*" + ATPases, le mécanisme de transport ionique reste mal connu.
Il existe essentiellement deux hypothèses : suivant la première, le stade initial consisterait en la fixation des ions Na"^ sur la protéine du côté interne de la membrane. Le stade suivant correspondrait au trans
port de ces ions contre leur gradient de concentration, et à leur rem
placement par le K"*” transportés dans le sens opposé. Suivant la seconde hypothèse, les deux sortes d'ions seraient fixés simultanément de part et d'autre de la membrane. Ils seraient ensuite transportés dans des directions opposées, en une seule étape (Hoffman 1975).
Au début de l'étude de ces mécanisme moléculaires, c'est la première hypothèse qui a surtout été retenue, parce qu'elle semblait concorder le mieux avec diverses observations. On constate en effet que la molé
cule d'ATPase fixe l'ATP en présence de Mg"*"*' et de Na"*". L'ATP n'est toutefois hydrolysé que lorsque k"*" est ajouté au milieu. Ceci suggère que la réaction s'effectue en deux étapes : l’efflux de Na"'’ serait associé à la phosphorylation (fixation de l'ATP), l'influx de k'*’ serait associé à une déphosphorylation de l'enzyme (hydrolyse de l'ATP).
n Na"*" ATP ADP n Na"^ + P. m
I 1
E E, P
Mg
(Whittam 1975, Albers 1976)
Cependant, il existe actuellement un plus grand nombre de preuves
expérimentales suggérant que le mécanisme s'effectue en une seule étape.
Dans ce cas, il y aurait fixation des ions Na'*’ sur la face interne de l'enzyme ainsi que de MgATP tandis que les ions k'*’ se lieraient dans le même temps sur la face externe de la protéine (Whittam 1973).
n Na"*^ ATPV 4**r
\,Mg E --- >
m k"^
nNa
I
E-ATP-Mg m K\ +
ADP
mK
■»E-P nNa‘ +
mK"^ + P.
1
---> E n Na"*"
(Whittam et al. 1975)
A l'appui de cette hypothèse, on peut faire état de l'existence de
structures particulières, susceptibles d'autoriser le mouvement des ions.
Ces structures ont pu être mises en évidence dans des préparations
d'ATPases digérées par de la trypsine (Shamoo et al. 1973 et 1974, Shamoo 1974). On peut alors résumer le mécanisme comme suit : les ions sodium se lieraient spécifiquement à des sites internes, ce qui entraînerait une grande affinité de la protéine vis-à-vis de l'ATP, ainsi que la fixation des ions k'*’ à l'extérieur de la cellule. Cette association protéine-ions causerait une modification au niveau des sites de liaisons permettant à ces derniers de se mouvoir au sein de "canaux" pendant l'hydrolyse de l'ATP. L'hydrolyse de l'ATP mènerait à une modification de l'affinité des ions vis-à-vis de leurs sites de liaison. Na'*’ et k"*” seraient dès lors libérés respectivement du côté extérieur et du côté intérieur de la cellule.
II. MODELES PHYSICO-CHIMIQUES DE MEMBRANES
Nous avons vu dans le chapitre précédent que parmi tous les modèles de membranes biologiques, le plus accepté est celui de la mosaïque fluide de
Singer.
N'oublions pas cependant, que depuis le début du siècle, les travaux qui s'attachent à une description exacte des membranes par l'étude de ce natériel
"in vivo" s'avéraient de plus en plus ardus et que la compréhension de diffé
rentes fonctions assumées par la membrane biologique n'aijrait pu être aisément atteinte par ce seul type d'investigations.
C'est pour cette raison qu'une approche du problème à l'aide de modèles physico-chimiques a été envisagée dès le début du siècle. Le modèle le plus ancien et le plus sinple consiste en une couche d'épaisseur monomoléculaire de lipides étalés à l'interface air-eau. Ce système correspond à la partie lipidique d'une demi-membrane biologique.
C'est au début des années 60 qu'apparurent les modèles physico-chimique de membranes constitués par une bicouche lipidique plane séparant deux phases aqueuses. Feu après, un troisième modèle fit son apparition : le liposome, constitue d'une bicouche lipidique sous forme vésiculaire.
I. Monocouches pures et monocouches mixtes
C'est à Langmuir et à Adam (Danielli 1975) que nous devons les premiers travaux effectués sur monocouches de lipides simples, étalées à l'interface air-eau. Une exploitation systérratique des techniques superficielles s'est ainsi développée rapidement et ce type de monocouche a été depuis lors
amplement utilisé pour étudier un nombre important de phénomènes membranaires.
En effet, pour une concentration superficielle bien définie, les lipides étalés à l'interface air-eau forment une couche de molécules jointives, au sein de laquelle les têtes polaires plongent dans l'eau et les chaînes hydrocarbonnées parallèles entre elles pointent dans une direction perpen
diculaire à l'interface. La monocouche représente alors le squelette lipidique d'une demi membrane. De nombreuses techniques camne l'étude de la pression superficielle, du potentiel de surface et de la viscosité superficielle (Châtelain et al. 1975, Châtelain 1976) ont été mises en oeuvre pour l'étude de ces monocouches lipidiques.
Cependant, les membranes biologiques sont composées d'un grand nombre de lipides différents et d'un nombre aussi inportant, voire plus important, de protéines et d'enzymes. C'est pourquoi, l'étalement de monocouches de protéines insolubles (Chin et al. 1975, Reinach et al. 1972) et plus encore, l'étalement de monocouches mixtes s'avère plus représentatif comme modèle simple de membrane (Quinn et al. 1969, 1970, Pearson et al. 1968, Ter Minassian et al. 1973, Gabrielli 1974, 1975).
Les mêmes techniques d'investigation peuvent être utilisées pour l'étude des monocouches mixtes. Ainsi, l'étude de films mixtes peut être envisagée en pression superficielle par une simple adaptation des théories des mélan
ges à un espace bidimensionnel. On peut écrire, pour un mélange idéal ou pour une monocouche mixte iramiscible.
A12
(Gaines 1966, Miller 1972, Landuyt et al. 1975)
11,1
Xj et sont les fractions molaires des 2 constituants. Aj et A^ sont les aires moléculaires de chaque constituant étalé seul. On exprime ensuite les résultats en portant l'aire moléculaire moyenne en fonction de la conço- sition des mélanges, à une pression superficielle donnée.
Si le mélange est idéal ou la monocouche mixte immiscible, on obtient une droite. Toute déviation à la droite théorique exprime l'existence d'un comportement non idéal. Une déviation négative correspond à une attraction entre les molécules étalées, une déviation positive correspond à une répul
sion.
Un certain nombre de travaux envisagent l'interaction de molécules dissou
tes dans le support avec un film lipidique étalé à l'interface air-eau.
Dans la plupart des cas on assiste à une pénétration des molécules sous- jacentes au sein du film étalé avec une augmentation de la pression super
ficielle (Châtelain 1976, Phillips 1975, Miller 1971).
La mesure des interactions moléculaires dans des films mixtes obtenus par étalement des différents constituants ou par adsorption d'un des constituants soluble% peut aussi être envisagées l'aide d'autres techniques superficiel
les. La mesure de la viscosité et du potentiel de surface, ainsi que l'étude de l'échange Tritium-hydrogène à l'interface, autorisent l'accès à de nom
breux paramètres moléculaires.
2. Bicouches lipidiques
Voici un peu plus d'une décennie, Mueller, Rudin, Tien et'Wescott (1962) formèrent pour la première fois des bicouches lipidiques, réalisant ainsi un modèle plus satisfaisant de membrane biologique. Le but poursuivi par ces auteurs était double : premièrement, obtenir un modèle dent les caracté
ristiques physiques étaient proches de celles des membranes naturelles et, deuxièmement, étudier les différents phénomènes se déroulant au niveau de ce type d'interface.
Tableau n° 4 - Comparaison des propriétés physiques des BLU et des membranes naturelles (Tien 1976)
Membranes natijrelles Bicouches lipidiques Epaisseur : micro, elect.
rayons X méth.optique capacité élec.
Potentiel de membrane Résistance
Tension de claquage
Capacité (en micro-F/cm ) 2 Perméabilité à l'eau
40 - 130 A 40-85 A 30 -150 A 10 - 88 mV 10^ - 10^ ohms
lOOmV 0,5 - 1,3 0,25 - 400
60 - 90 A 40 - 80 A 40 -130 A 0 -140 mV 10^ - 10^ ohms 100-555 mV
0,3 - 1,3 8-50
L'objectif majeur des travaux effectués actuellement consiste en l'obtention de bicouches mixtes comprenant une matrice lipidique et un certain nombre de molécules impliquées dans divers processus biologiques importants
(action enzymatique, de sites de reconnaissance et de sites imiiiunitaires ).
La bicouche lipidique ainsi modifiée peut alors représenter avec succès divers aspects de la membrane plasmatique. Cette dernière constitue peut- être la membrane la plus étudiée et l'exemple le plus familier nous est donné par la membrane d'érythrocyte qui contient 40 % de lipides et 60 % de protéines. Beaucoup de travaux ont été entrepris pour étudier la partie protéique de telles membranes (Capaldi 1972). Des bicouches lipidiques ont d'autre part été formées à partir d'extraits de membranes d'érythro
cytes, afin de comparer les coefficients de perméabilité de différentes substances vis-à-vis des deux types de membranes : l'artificielle et la biologique. L'addition de protéines "fantômes d'érythrocytes" à la solu
tion aqueuse, adjacente à la membrane, a également été étudiée. Elle pro
voque une augmentation de l'épaisseur de la membrane d'approximativement 35 A de chaque côté (Tien 1974).O
