RESULTATS EXPERIMENTAUX ET DISCUSSIONS

L'objectif principal du présent travail consiste en l'étude de l'incorpora­ tion de l'enzyme membranaire, la Na'*’ + k"*" ATPase au sein des deux modèles de membranes, la monocouche et la bicouche lipidique.

La détermination du comportement et de la conformation de cette protéine membranaire à l'interface lipide-eau est premièrement envisagée au moyen de différentes techniques superficielles. Ces dernières permettent de démontrer une interaction lipide-protéine ainsi qu'une orientation de 1' ATPase dépendante de la fluidité lipidique.

L'activité enzymatique superficielle est ensuite envisagée à l'aide d'une méthode nouvellement mise au point.

L'enzyme effectuant un transfert d'ions de manière unidirectionnelle, dans les membranes il fallait envisager la formation de bicouches asymétriques tant au niveau de la répartition lipidique qu'au niveau de l'asymétrie due à l'enzyme.

La mise au point d'un dispositif expérimental permettant l'obtention et l'étude de bicouche asymétrique a été réalisée en vue de l'incorporation de la Na’*’ + k"*" ATPase dans les membranes.

Les mesures électriques réalisées sur des membranes lipidiques et des mem­ branes mixtes lipides-protéine sont ensuite discutées en regard des résultats obtenus sur monocouches.

Enfin, l'obtention de bicouches lipidiques mixfes a permis de préciser l'incorporation de l'enzyme et il est possible de tirer argument des résultats expérimentaux pour prouver l'asymétrie due aux lipides ou à l'enzyme.

1. ATPase à l'interface air-eau

A ce stade, il convenait d'étudier principalement l'encombrement moléculai­ re de l'ATPase à l'interface air-eau et de vérifier si la protéine maintenait

sa conformation dans ce nouvel environnement. En effet, les forces inter­ faciales seraient susceptibles de dénaturer l'enzyme. Nous avons donc pro­ cédé à l'étalement de l'enzyme sur un support aqueux (0.02 M NaCl, 0.08 M KCl tamponné par 0.005 M Tris - H Cl en fonction du pH.

Dans la figure IV 1 la pression superficielle est exprimée en fonction de A, l'aire moléculaire de l'ATPase et ceci pour différents pH du support.

L'aire limite a été calculée pour chaque courbe en extrapolant à pression

+ ® 2

superficielle nulle. La valeur minirnum de - 7500 A par molécule est

obtenue au pH isoélectrique et correspond au miniraum de répulsion électrosta­ tique. Ce résultat est en accord complet avec les dimensions trouvées pour d'autres Na"*" + k"*” ATPases ( Kagawa et al. 1966, Razin 1972, (Sulik Krzywicki 1975). Effectivement, des mesures de microscopie électronique ont montré que différentes ATPases adoptent une conformation sphérique avec un diamètre

O

moléculaire moyen de 100 A . L'aire minimum obtenue en pression superficiel-O

le correspond donc à un diamètre moléculaire de 95 de 100 A. On peut en conclure assez facilement par simple comparaison que la molécule de Na"*" + k"*" ATPase, garde une conformation globulaire à l'interface air-eau et n'est donc pas dénaturée. La structure tertiaire et quaternaire qui confère à l'enzyme une forme globulaire est vraisemblablement due à de fortes liaisons internes telles que des interactions électrostatiques, des interactions

entre résidus apolaires, des liaisons covalentes S-S, mais aussi des liaisons hydrogènes internes. Pour tester cette hypothèse de liaisons hydrogènes

stabilisantes et afin de préciser l'influence de l'étalement de l'enzyme sur la stabilité conformationnelle, il a été prxx:édé à des mesirres d'échange isotopique entre la monocouche d'ATPase tritiée et le support aqueux.

33

30

27

24

21

18

15

12

9

6

3

Ë

Figure IV 1 : Isothermes de pression superficielle de la Na + K ATPase ; influence du pH du support ,

Le nBpquage de la maca?omolécule s'effectue par incubation de 10ml de solu­ tion d'étalement comprenant l'enzyme avec 0.1ml d'eau tritiée (5 Ci/ml) pendant 48 heures. Dans ces conditions, on assiste â un échange T - H entre la macromolécule et le solvant.

Si cette solution est étalée à l'interface air-eau, l'évolution de la radio­ activité superficielle au cours du tenps peut être reliée à la stabilité des ponts hydrogènes assurants le maintien d'une conformation déterminée de la molécule étalée. En effet, si les Tritiums sont impliqués dans des liens hydrogènes intramoléculaires stables, l'échange T - H avec le support est très lent. Par contre, si la conformation de la molécule d'ATPase n'est pas stabilisée par un nombre suffisant de liens H, le Tritium s'échangera immédiatement avec le support et la diminution de radioactivité sera rapide. L'évolution de la radioactivité superficielle peut être représentée dans un graphique normé par

- N , où N^, No, et N

' - N

S

représentent respectivement la radioactivité (en coups par minutes) au temps t , au temps 0 et celle due au solvant d'étalement.

Pour différentes concentrations superficielles en ATPase ( 1, 2, 3, 4 et 5 mg/m ) un équilibre est atteint 1 minute après l'étalement et on enregistre une diminution de la radioactivité de l'ordre de 20 % (voir, plus loin

figure IV14 à IV17 ).

La haute radioactivité superficielle associée à l'étalement de 1'ATPase et l'existence d'un palier stable impliquent une stabilisation moléculaire due à l'existence de liens hydrogènes intramoléculaires. Ce maintien d'une haute radioactivité superficielle peut également être due à la possibilité qu'ont certains groupes tritiés d'échapper à l'environnement aqueux. Ces résultats plaident en faveur du maintien de la conformation globulaire de l'ATPase à l'interface air-eau

L'addition dans le support aqueux du substrat de l'enzyme, l'ATP, en concen­ tration croissante entraîne une légère augmentation de la vitesse d'échange

(Fig. IV 2) pouvant traduire une modification de conformation consécutive à la formation du complexe enzyme-substrat. La radioactivité superficielle atteint dans ce cas une valeur de palier correspondant à une diminution de l'ordre de 25 a 30 %.

En outre, la linéarité observée dans la figure IV 3 lorsqu'on porte la radioactivité superficielle de la valeur de palier en fonction de la concen­ tration en enzyme étalé semble indiquer qu'une partie au moins des Tritiums incubés a été fixée de manière indélébile par la macromolécule. Cet argument plaide aussi en faveur d'une grande stabilité conformationnelle de l'ATPase à l'interface air-eau- Il est à remarquer que l'effet non dénaturant de

l'interface a déjà été vérifié par des raacranolécules synthétiques (Châtelain et al. 1975, Caspers et al. 1974, 1975 ,Tenenbaum et al. 1976).

La confomation stable de l'ATPase à l'interface air-eau est par ailleurs confirmée par mesures de pressions superficielles effectuées dans le domaine des films dilués. Dans ce domaine de concentration superficielle, la masse molaire de la substance étalée peut être calculée par transposition de la loi des gaz parfaits au milieu superficiel

JC A = n R T

Pour un gaz réel bidimensionnel on a

rc/c

s s M

où rC est la pression superficielle, = m/A est la concentration superfi­ cielle en Na'*’ + k'*’ ATPase et B est le second coefficient du viriel. La masse molaire est alors déterminée dans un diagramme JT. /C^ = f (Cs) par extrapolation à concentration nulle (figure IV 4).

Lim rc /C = RT/M pour C tendant vers 0.

cvj

Tampon Tris-HCl pH 7.8 , o.o8 M KCl ojo2 M NaCl

m

m

m

ill

^d

y

n

e

s

^

Le procédé illustré dans cette figure permet de calculer une masse moléculaire de 255.000 (- 10.000), ce qui est en bon accord avec les données de la

littérature reprises dans un chapitre précédant. Ce résultat confirme claire­ ment le fait que la protéine d'ATPase est une association de 2 unités de MM de 100.000 et de une unité de MM de 50.000. Des études antérieures ont mon­ tré que la détermination d'une masse molaire moyenne exacte par cette méthode ne peut être obtenue que pour des mcromolécules rigides (Guastalla 1947, Gaines 1963). Des lors, la concordance des masses molaires est un argument qui plaide lui aussi en faveur de la rigidité des molécules de la couche.

Les liaisons intramoléculaires assurant la stabilité de la molécule l'ençor- testrès nettement dans ce cas s\jr les liaisons intermoléculaires et les interactions avec le support. Une telle situation, favorable au maintien de la conformation "native" de la protéine est d'ailleurs confirmée par la très faible pente de la droite obtenue dans la figure IV 4. Le coefficient angulaire de la droite correspond en effet à la valeur du second coefficient du viriel lors de la transposition de l'équation des gaz au milieu superfi­ ciel. Cette valeur,très faible, obtenue pour le second coefficient du viriel indique dès lors une faible interaction avec le support ainsi que de faibles interactions intermoléculaires.

2. ATPase à l'interface lipides-eau