L'ATPase membranaire ayant été caractérisé à l'interface lipide-eau, il restait à montrer que l'activité enzymatique de cette protéine était maintenue dans un tel environnement.
La méthode utilisée consiste â mettre en présence l'ATP en présence du couple enzyme substrat Luciférine-Luciférase. La Luciférase oxyde la Luciférine en présence d'ATP. Cette réaction produit une lumines cence dont l'intensité est proportionnelle à la concentration en ATP. Si l'ATP est par ailleurs consommée par la Na"*" + ATPase, la lumi nescence va décroître au cours du temps. L'ATPase est étalée sous forme de couche monomoléculaire sur un support aqueux contenant la Luciférine, la Luciférase et une quantité connue d'ATP. L'ATPase est également étalée en film mixte avec différents lipides. La lumi nescence est enregistrée à l'aide du dispositif à photo-multiplicateur décrit au chapitre précédent.
Deux problèmes émanent cependant de cette nanière de procéder. Premiè rement, il n'est pas possible de dégager la constante cinétique de la réaction d'hydrolyse de l'ATP par 1'ATPase. En effet, la réaction d'oxydation de la Luciférine par la Luciférase qui donne lieu à l'émis sion d'un photon, consomme également de l'ATP. Ensuite, la réaction d'kydrolyse à l'interface est sous la dépendance de la diffusion de l'ATP de la solution vers l'interface, tandis que la seconde réaction s'effectue en solution. Ce facteur influence lui aussi la constante cinétique.
Il en résulte que l'on ne peut dégager des résultats présentés dans les figures IV 18 à IV 20. Il est à noter cependant que l'existence même d'une réaction enzynatique enregistrée en présence d'un film étalé d'ATPase, écarte l'hypothèse d'une dénaturation consécutive â l'étalement. Ainsi que le confirment d'autres néthodes de la physico chimie des surfaces, utilisées dans les paragraphes précédents, la conformation "native" globulaire ne semble pas être modifiée par les conditions d'anisotropie inçosées par l'interface.
concentrations superficielles respectivement de 4, 3 et 1 mg/m en ATPase et 0.4 , 0.8 et 1.6 mg/m"^ pour les différents lipides
I I Solvant d étalement seul
# ATPase seule A ATPase * DPPE O ATPase DPPC ■ ATPase -f PS A ATPase -h DPO FIG 18 . 19 et 20
□
5 10 15 t min
On remarque dans tous les cas que la disparition de 1 ’ATP est très rapide durant les huit premières minutes de la réaction et que la présence de phospholipides dans la couche monomoléculaire active la réaction d'hydrolyse. La présence de ce matériel lipidique ne semble toutefois pas jouer un rôle considérable sur la réaction d'hydrolyse. De même, la nature de ce natérieKdipalmitoyl phosphatidyl choline et dipalmitoyl phosphatidyl éthanolamine non chargés, phosphatidyl sérine et diphosphatidyl glycérol chargés négativement) ne semble pas influencer la réaction enzymatique comme on aurait pu s'y attendre. En effet, il a été discuté plus haut de l'influence de la nature du lipide sur les réactions enzymatiques membranaires. Dans le cas présent, on aurait pu s'attendre à une meilleure activation de la réaction d'hy drolyse par des lipides chargés négativement.
Dans la réaction "in vivo", la présence de Na'*’ et de k"*" de part et d'autre de la membrane semble requise pour obtenir l'activité maxinale. Cette condition ne peut évidemment être satisfaite à l'interface air- eau. Ceci peut expliquer une diminution de l'activité enzymtique ainsi que le nanque de sélectivité du lipide observé dans les conditons de la présente expérience.
3. Propriétés électriques de bicouches lipidiques
BICOUCHES SYMETEIQUES
Lorsque l'on considère une BIÜ symétrique séparant deux phases aqueuses, la situation de chaque demi^membrane vis-à-vis de chaque phase aqueuse peut être assimilée à celle d'une monocouche lipidique étalée sur un support de même composition que la phase aqueuse. On peut alors s'atten dre à mesurer un potentiel de membrane correspondant à une différence de deux potentiels de double couche électrique, avant qu'un régime stationnaire de diffusion d'ions ne prenne place.
si la mesure est suffisamment rapide, le potentiel observé peut donc être interprété à l'aide de la théorie de Gouy-Chapman. En effet, la diffusion consécutive à un changement brusque de concentration dans l'un des compar timent aqueiox est alors négligeable. Cependant, un régime stationnaire de diffusion peut apparaître assez rapidement. Pour éviter l'intervention trop rapide de ce phénomène, il suffit de former des bicouches de résis- tance élevée (supérieure à 10 ohms, cm ) (Mac Donald et al. 1972).
est tout d'abord envisagée pour différents mélanges de lipides étalés à l'interface air-eau sur des supports de concentration croissante en KCl ( 10 3. 10 10 3.10 10 ^), par la mesure du potentiel de surface.
Etant donné que les lipides employés DPPC, PS, PC, AP et GMO ne possèdent pas la même aire superficielle, l'équation employée est z = — sh
^ \ ° 2 ^
( OÙ est le noiribre de lipides chargés par A ,
Les lipides ionisables, PS et AP sont complètement ionisés au pH des supports employés.L’aire de collapse de tous les lipides est connue, ce qui permet de calculer aisément la densité de charge superficielle des mélanges. Les valeurs théoriques calculées au départ des équations repri
ses ci-dessus sont comparées aux résultats expérimentaux dans les figures IV 21 à IV 23.
“3 La concentration initiale en KCl a été choisie arbitrairement à 10 M/l. L'origine des courbes représentées sur les figures IV 21 à 23 a donc été choisie arbitrairement égale à 0 mV. Pour cette raison, il est impossible de savoir à quelle concentration en électrolyte support les courbes théo riques et expérimentales coïncident le mieux.
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)
Figure IV 21 : Variation du potentiel de surface en fonction du log de la concentration en électrolyte support pour des mélanges de PS-DPPC ,
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Figure IV 22 ; Variation du potentiel de surface en fonction du log de la concentration en électrolyte suppoit pour des mélanges de AP-PC .
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Figure IV 23 Variation du potentiel de surface en fonction du log de la concentration en électrolyte support pour des mélanges de PS-GMO .
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Les écarts éventuels à la théorie de Gouy dépendent partiellement du choix de cette origine. Ils dépendent aussi de l’erreur qui peut être coranise dans le calcul du taux de charges superficielles à partir des aires moléculaires des différents lipides.
On constate, à l'examen des figures VI 21 à VI 23, que la coïncidence entre les valeurs expérimentales et calculées s'avère satisfaisante, et que l'équation de Gouy peut donc être utilisée pour rendre compte de l'évolution du potentiel de surface en fonction de la force ionique du support, dans cette gamme de concentration en KCl.
Le stade suivant consiste à comparer cette évolution à celle du potentiel de membrane, lorsque la concentration en KCl est modifiée dans l'un des compartiments aqueux.
Les valeurs du potentiel mesurées dans ce cas sont celles obtenues immé diatement après l'hamogénisation dans le compartiment "modifié". L'autre
_3
conpartiment reste à une concentration de 10 M KCl. Dans le cas où la BLM se recolore au cours de l'agitation, la mesure n'est effectuée que lorsqu'elle retrouve son épaisseur bimoléculaire (disparition des plages colorées).
La comparaison des résultats obtenus (figure IV 24 à IV 27) lors de la formation de membranes symétriques par la méthode classique (pour les bicouches PS/GMO et AP/PC) ou par la mise en contact de deux monocouches
(pour les bicouches de PS/GMO et PS/PC) avec les résultats dégagés des mesures de potentiel de surface (figure IV 21 à IV 23) permet de constater l'effet de la densité de charge sur le potentiel de membrane. Cet effet est cependant moins apparent qu'en potentiel de surface.
"Notons içi que nous n’avons pas tenu compte du potentiel d’électrode . En effet, le système expérimental utilisé comporte des électro des Ac/AgCl**,
Figure IV 24 : Potentiel de membranes symétriques de phosphati dyl sérine dans le glycérol monooléate formée par la méthode classique en fonction de la concentration en électrolyte d'un coté d^ la membrane, le second étant gardé à une concentration de 10 M KCl, Les potentiels sont en millivolts ,
lo
g
Figure IV 25 ; Potentiel de membranes symétriques d'acide phos-phati<tique dans la phosphatidyl choline formée par la méthode classique en fonction de la concentration en électrolyte d'un coté d^ la membrane^ le second étant gardé à une concentration de 10 M KCl , Les potentiels sont en millivolts ,
Figure IV 26 : Potentiel de membranes symétriques de PS dans le GMO formée par la mise en contact de deux monocouches, en fonction de la concentration en électrolyte d'un côté de la^ membrane, le second étant gardé â une concentration de 10 M en KCl , Les potentiels sont en millivolts ,
Figure IV 27 : Potentiel ée membranes symétriques de PS dans la PC, formée par la mise en contact de deux monocouches, en fonction de la concentration en électrolyte d'un coté de membrane, le second étant gardé à une concentration de 10 M en KCl . Les potentiels sont en millivolts ,
Ainsi le potentiel de membrane ne semble pas correspondre exactement à la différence de deux potentiels de Gouy même pendant les premiers temps d'existence de la BLM. En outre, le potentiel mesuré atteint assez rapi dement la valeur du potentiel de diffusion. On peut attribuer ceci au fait que la résistance des BlJi est relativement faible (de l'ordre de
6 2
5.10 ohm.cm ) en regard de la valeur requise pour observer le phénonène avec exactitude.
De plus, des membranes de compositions-identiques (PS/GMO) réalisées par les deux techniques proposées, présentent des résultats qui diffèrent légèrement. Ceci s'explique aisément si l'on admet que les BLM formées au départ de deux couches monomoléculaires possèdent des résistances beaucoup moins élevées que celles qui sont formées au départ d'une solu tion de lipides dans un solvant apolaire (Montai et al. 1972). Cette situation résulte vraisemblablement du fait que les bicouches formées au départ de deux monocouches contiennent peu ou pas de solvant. Nous avons obtenu des valeurs de la résistance assez faible, dans le cas de ces bicouches, généralement inférieures à 10 ohm.cm .
Il apparaît cependant que les BLM obtenues de cette nanière requièrent un peu de solvant pour leur fomation. En effet, une phase aqueuse cou verte uniquement d'une monocouche de lipides (GMO, PC, PS,...) "mouille" le teflon. L'angle de contact de la monocouche avec le teflon est relati- vement faible (inférieur à 45 ). On peut observer ce fait au microscope ou même à l'oeil nu. Par con-tre, si la monocouche contient du solvant, elle ne "mouille" plus le teflon et l'angle de contact de la monocouche
O
avec le teflon est grand (supérieur à 120 ). C'est en fait le solvant qui "mouille" la paroi de teflon.
Il semble dès lors à peu près impossible de former une bicouche par accolement de deux monocouches dépourvues de solvant si ces dernières n'en-trent pas tout à fait en même temps en contact avec l'orifice, liie séquence de formation de BLM est représentée dans la figure IV 28.
FIG IV 28
La présence d'une faible quantité de solvant semble donc requise pour que les monocouches ne "mouillent" pas la paroi de teflon lors de l'ascension des niveaux. La figure IV 29 représente les chaînes alkyles des lipides ayant une orientation favorable à la fornation de la bicouche. Ceci est dû à la présence du solvant qui peut mouiller la paroi de teflon.
Lors de l’ascension siriultanée des deux niveaux, on peut former des BLM, même en absence de solvant. Dans ce cas, il convient cependant de nettoyer l'orifice à l'aide d'un pinceau préalablement trençé dans du pentane ou de l'hexane, avant la fomation de la BLM.
La figure IV 30 illustre l'ascension simultanée des deux monocouches. Lorsqu'elles entrent en contact l'une avec l'autre, l'orifice est encore "humecté" par l'hydrocarbure et les chaînes hydrocarbonnées peuvent prendre une position favorable à la formation de la BLM.
Les figures IV 28 à IV 30 présentent la feuille de teflon comme ayant la même épaisseur que la monocouche. En réalité, la feuille de 50 microns est
10 fois plus épaisse que la membrane lipidique d 'approximativement 50 A d'épaisseur. La feuille de teflon est amincie au niveau de l'orifice, mais 11 n'en reste pas moins que cette épaisseur est encore 1000 fois plus inçor- tante que celle de la BLM (figure IV 31).
50/»
On voit aisément que la présence d'une très faible quantité de solvant tapissant l'intérieur de l'orifice est nécessaire. En effet, sans solvant,
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la monocouche qui "mouille" le teflon, fait un angle supérieur à 120 avec lui. De plus, l'équilibre entre la bicouche (de tension superficielle
faible) et les deux monocouches (de tensions superficielles élevées) impose un angle de plus de 160° entre les deux monocouches.
Pour éviter cette impossibilité de combinaison des angles, nous avons formé les bicouches par ascension simultanée des monocouches, apres avoir nettoyé l'orifice avec de l'hexane.
4. Bicouches asymétriques
En vue d'obtenir des membranes asymétriques, il a été procédé à l'étalement de part et d'autre de la paroi de Teflon de couches lipidiques moronolécu- laires de conpositions différentes, sur des supports aqueux identiques
(10“^ M KCl, Tris - HCl 1O"^ M, à pH 7.5).
Le potentiel de membrane mesuré dans ce cas ne peut être attribué à la diffusion et apparaît donc conme la conséquence de l'asymétrie au niveau de la densité de charges. La figure IV 32 illustre la variation du potentiel de membrane avec la densité de charges ( Ohki 1972).
La preuve de l'existence d'une membrane asymétrique a tout d'abord été obte nue en examinant les valeurs du potentiel, directement après la formation de la bicouche, et son changement de signe consécutif à l'inversion des électro des ou de l'étalement des monocouches dans les deux compartiments. Ces
dernières sont obtenues à partir d'une solution de lipides dans le chloroforme, l'orifice de formation étant nettoyé à l'hexane.
Les bicouches formées au départ d'une couche moncmoléculaire contenant 20 % de phosphatidyl sérine dans le glycerol monooléate et d'une monocouche de glycerol monooléate seul permettent de mesurer un potentiel moyen de l'ordre de 30 mV, qui s'annule assez rapidement. Après inversion des électrodes, le potentiel moyen change de signe.
Pour des bicouches réalisées à partir d'une couche monomoléculaire contenant 10 % de phosphatidyl sérine dans le glycerol monooléate et d'me monocouche de glycérol monooléate pure, le potentiel moyen est de 15 mV. Après inversion des électrodes ou de l'étalement des monocouches, cette valeur change de signe.
Des bicouches asymétriques constituées uniquement de phospholipides ont
également été réalisés à partir d'une monocouche contenant 10 % de phosphatidyl sérine dans la phosphatidyl choline et d'une monocouche de phosphatidyl choline pure. La moyenne des potentiels observés est alors de 23 mV. Dans ce cas
encore, la valeur est conservée mais change de signe après inversion des électrodes.
Distribution symétrique des densités de charges, avec : même concentration en sel de part ;et d'autre.
Distribution symétrique avec une charge nette nulle ; les deux poten tiels sont nuis.
Distribution asymétrique des densités de charges avec mê me concentration en sel de part et d'autre de la membrane. Le potentiel résultant est le potentiel d'asymétrie
La preuve de l'existence d’une membrane lipidique asymétrique a égalaient été obtenue en examinant les valeurs des conductances de bicouches asymé triques contenant un ionophore cyclique, la Valinomycine. Cet antibiotique qui conplexe préférentiellement les ions k"*" donne lieu à un transport facilité de cet ion à travers une membrane lipidique. De plus, il a été clairement montré que la Valinomycine fonctionne en complexant k"*” dans un mécanisme interfacial . L'ion de la solution se ccmbine à la molécule de Valinomycine à l’interface BLM-solution (Benz et al. 1976).
La réaction de complexion est donc sous la dépendance de la concentration superficielle en k"*", laquelle dépend pour sa part de la densité de charge négative superficielle de la membrane. En effet, la concentration superfi cielle en k"*" peut être calculée au départ de la distribution de Bolt23iann
(k"")
superf. = (k'") sol. exp. - Fr/RT.
Dans ce type d’expérience, nous avons envisagé l’influence de l’asymétrie membranaire sur le phénomène de transport. L’asymétrie membranaire est à nouveau créée au niveau de la densité de charge superficielle de chaque feuillet lipidique. Une moitié de la bicouche contient une forte proportion de phosphatidyl sérine, tandis que l’autre est formée uniquement de
phosphatidyl choline, dépourvue de charge résultante. Les lipides sont préa lablement dissous dans l’hexane en présence de Valinomycine dont la
concen-“5 “3
tration finale dans la phase organique varie de 10 à 10 M/l. On procède a l’étalement de ces mélanges de part et d’autre de la paroi de teflon sur les deux supports aqueux.
L’un de ceux-ci contient une solution en KCl 10 ' mole/1 et en NaCl de 5.10 moles/1. La situation est inversée dans l'autre compartiment.
Au cours d'une première série d'expériences, la membrane présente des lipides neutres orientés vers la phase la plus riche en KCl. Au cours d'une autre série d'expériences, la situation est inversée et la BLM présente les lipides chargés négativement vers la phase la plus riche en KCl. Le courant est
en fonction du potentiel imposé et l'on calcule une conductance moyenne (entre -60 et +60 mV) dont les valeurs sont reportées dans le tableau en mhos/cm .
Tableau IV
-5 -4 -3
compart. BLM compart. 10 10 10
PC PS" Na"^ 1.1 lO”^ 1.1 10~^ I.IO"^ PS"pC Na"^ 2.2 10"^ 2.7 10“^ 8.2 lO"^
La lecture de ces valeurs montre que la conductance ne dépend pas de la tration en Valinomycine dans la membrane, lorsque les ions potassium se vent dans le ccmpartiment adjacent à la demi-membrane dépourvue de charges résultantes. On remarque ainsi que la conductance ne varie pas lorsque la concentration en Valinomycine dans la manbrane varie d'un facteur 100. Par contre, lorsque les ions k'*' sont dans le compartiment adjacent à la moitié chargée de la BLM, l'augmentation de la conductance consécutive à un accrois sement de concentration en antibiotique est manifeste. Elle devient 80 fois plus importante que la conductance mesurée dans le cas précédent.
Lorsque les bicouches sont formées au départ d'une monocouche de glycerol monoo- léate et d'une monocouche mixte Phosphatidyl sérine - glycerol monooléate 0.2 : 0.8, la conductance augmente avec la concentration en Valincsmycine dans la phase organique, quel que soit le cation présent du côté adjacent à la demi- membrane chargée négativement.
étudié IV , concen tration en (Valino mycine) concen-
trou-caractère asymétrique de la BU-I (figures IV 33 et IV 34).
Ces deux figures montrent l'existence d'un potentiel différent de zéro à courant nul. La valeur de ce potentiel se situe aux environs de -75 mV et correspond uniquement au potentiel de membrane des ions potassium :
E = RT/F In 0.005/0.100 m
Etant donné que la membrane contient un ionophore spécifique aux k"*", elle se ccmporte comme une électrode au potassium et la mobilité des ions Na'*’ au tra vers de la membrane est négligeable par rapport à la mobilité des ions k"*".
Le potentiel, imposé par décades, entre -60 et +60 mV est appliqué au
compartiment contenant les ions Na''’. Ce potentiel explique aisément l'asymétrie obtenue dans les courbes courant-tension. En effet, non seulement les ions k'*’ diffusent aisément dans la membrane suivant leur gradient de concentration, mais ils sont de plus sous l'effet du champ électrique imposé. Ainsi, la con ductance est plus élevée pour des potentiels négatifs que pour des potentiels positifs.
L'asymétrie des bicouches formées au départ de deux couches moncmoléculaires de compositions différentes est donc démontrée au moyen de deux méthodes : l'une fait intervenir l'étude du potentiel de membrane, l'autre, l'étude de la conductance en présence d'un ionophore.
Figure IV 34 ; Caractéristques courant-tension de bicouches lipidiques asymétriques de^GMO-PS contenant de la Valinomycine â une concentration de 10 M , en fonction des concentrations dans les deux compartiments aqueux ,
5. Propriétés électriques de bicouches mixtes ATPase-1ipides
La validité de la méthode de formation de bicouches lipidiques symétriques et asymétriques ayant été démontrée, l'étape suivante du travail consistait en la réalisation de membranes mixtes lipides-protéines membranaires et en l'étude des propriétés électriques de tels systèmes.