Formation de bicouches lipidiques

La méthode de formation courante de bicouches lipidiques BLM (Black, bimolecular or bilayer lipid membranes) est basée sur l'emploi d'une solu­ tion de matériel lipidique, lipides du cerveau, protéolipides, cholestérol oxydé, surfactants synthétiques, extraits des chloroplastes et des pigments caroténoîdes dissous dans un solvant non polaire tel qu'un hydrocarbure à chaîne normale (Mueller et al. 1964, Tien et al.1968, T.M. Saraga 1969).

Cette solution est appliquée à l'aide d'un pinceau, d'une spatule ou d'une seringue (Tien et al. 1973 ) sur un orifice pratiqué dans une paroi en maté­ riel hydrophobe comme le polyéthylène (PE), le polytétrafluoroéthylène

(FTFE ou Teflon) ou le polychlorotrifluoroéthylène (PCTFE) séparant deux phases aqueuses. La majeure partie du matériel lipidique "s'essore" et se rassemble en bourrelet sur les bords de l'ouverture.

La bicouche se forme alors spontanément comme le montre la figure suivante, et consiste en un système en état de quasi-équilibre avec un "anneau" plus épais, formant une zone de transition entre la bicouche et la paroi hydro­ phobe.

Figure II 1 ; Processus de foramation de membranes lipidique bimoléculaire . Le film épais s'aminçit au stade de bicouche . La bicouche occupe finalement toute la surface comprise dans 1'anneau ,

Les bicouches peuvent aussi être formées par immersion dans l'eau d'un anneau de Teflon, préalablement plongé dans la solution contenant le matériel lipidique. Lors du retrait de l'anneau de cette solution, une goutte est retenue par le teflon jusqu'à l'immersion dans la solution aqueuse. Il s'agit ici d'une méthode de routine rapide pour déterminer si des molécules amphiphiles forment ou non des BLM.

Des méthodes optiques directes sont généralement onployées pour observer la formation de ces membranes ultra-fines peu visibles à l'oeil nu, ainsi que pour déterminer la planéité et l'aire de la zone amincie à l'état de double couche lipidique. La membrane est éclairée par un faisceau de lumiè­ re blanche. Un microscope de faible puissance (agrandissement 10- 40) est situé sur le trajet du faisceau réfléchi . Trois étapes différentes peuvent être relevées pendant le processus d'amincissement. La membrane initiale de 0.1 à 1 yw- apparaît tout d ' abord grise ou sans couleur sous lumière réfléchie (A). Lorsqu'elle s'aminçit, des franges d'interférences colorées apparaissent (B) jusqu'au stade final où elle est d'apparence noire (C) et possède une limite franche.

noir

Lumière blanche

La conposition de la bicouche est mal connue, sauf pour la goutte d'origine dont la plus grande partie forme le bourrelet extérieur. Divers raisonne­ ments ont conduit certains auteurs à admettre que la bicouche renfermait une part importante de solvant.

Le point faible de ces détenninations résidait dans l'absence d'analyse in situ de la composition de la bicouche.

Une technique récemment mise au point par Pagano (1972) permet l'étude in situ de la ccmposition de la bicouche lipidique et de la quantité de solvant retenue en son sein. La membrane est formée au départ d'une solution lipide-décane ou lipide-hexadécane sur un anneau en teflon plongé dans une solution aqueuse. Des gouttes de mercure sont débitées au-dessus de la bicouche maintenue horizontale (Fig. II, 3).

Chaque goutte de mercure, en traversant la bicouche, emporte un fragment de cette dernière sous la forme d'une vésicule bilipidique disposée autour de la goutte. Elle est ensuite recueillie dans un petit bêcher contenant du chloroforme posé au fond du récipient principal. Le solvant est marqué au tritium lors de l'utilisation de lipide non marqué, le lipide peut

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être marqué au tritium ou au C lors de l'utilisation de solvant non marqué.

L'analyse de la radioactivité du matériel recueilli dans le chloroforme conduit à la conclusion que 37 % du volume du matériel de la couche est représenté par le solvant. La ccmposition exacte de la bicouche a également été déterminée.

Celle-ci n’est pas nécessairement la même que celle de la solution ini­ tiale utilisée pour sa formation. Les compositions relatives du système bicouche/solution de départ ont été déterminées pour des mélanges de glycérol monooléate (GMO) avec du cholestérol (chol) ou du glycérol monostéarate (GMS). Il a été prouvé que :

(GMS/GMO)^. ^ or (GMS/GMO) , . et que bicouche solution

(chol/GMOl. , en 0.5 (chol/GMO) ^

bicouche solution

On peut se demander si la présence du solvant limite l'utilité des bicou- ches planes, mais il est certainement important de pouvoir former des bicouches planes sans solvant. Une technique pour former des bicouches contenant peu de solvant a été décrite par White (1974) : le solvant est éliminé de la bicouche en diminuant la température des bicouches jusque sous la température de fusion du solvant.

Une méthode destinée à réaliser des bicouches lipidiques dépourvues de

solvant parasite a été récemment mise au point par Montai et Mueller (1972). Le principe de formation de telles bicouches est le suivant : une solution aqueuse est séparée en deux "conpartiments" par une paroi de Teflon de 6,5 à 50/<-d’épaisseur comportant, au-dessus du niveau de l’eau, un orifice de 0,2 à lnm de diamètre. Une couche monomoléculaire de lipide est étalée en surface de part et d’autre de cette paroi, à partir d’une solution de pentane ou d’hexane. La paroi de Teflon est alors lentement immergée, entraînant les deux couches monomoléculaires par leurs chaînes hydrocar- bornées (figure II, 4).

Les deux monocouches entrent en contact par leurs queues hydrocarbonnées au niveau de l’orifice pour y former une bicouche lipidique.

Des précautions supplémentaires peuvent être prises en maintenant la pres­ sion superficielle constante par un dispositif adéquat. Cependant, le dis­ positif mécanique d'immersion utilisé dans ces expériences ne semble pas avoir donné pleine satisfaction à leurs auteurs. En effet, le principe même d'un mouvement coulissant pour réaliser l'immersion est difficilement

compatible avec l'exigence d'une bonne étanchéité des compartiments et par­ tant d'une bonne isolation électrique de ces derniers. Pour cette raiscn, il nous a semblé utile d'introduire d'importantes modifications à cette pranière version de l'appareil de Montai, sans pour autant renoncer au prin­ cipe de base. Peu après. Montai lui-même (1973) proposa un dispositif dans lequel il est possible de faire monter les niveaux d'eau et donc les mono­ couches, pour atteindre l'orifice pratiqué cette fois dans une paroi fixe.