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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Godard, C. (1980). Isolement de mutants de biosynthèses du polyoside de base de la membrane externe de Shigella flexneri F6S, caractérisation de ces mutants par la sensibilité aux bactériophages et localisation génétique d'une mutation (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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J) M

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES

ISOLEMENT DE MUTANTS DE BIOSYNTHESE DU POLYOSIDE DE BASE DE LA MEMBRANE EXTERNE

DE SHIGELLA FLEXNERI F6S , CARACTERISATION DE CES MUTANTS PAR LA SENSIBILITE AUX

BACTERIOPHAGES ET LOCALISATION GENETIQUE D’UNE MUTATION .

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences

l

fr% Claudine GODARD

1980

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES

ISOLEMENT DE MUTANTS DE BIOSYNTHESE DU POLYOSIDE DE BASE DE LA MEMBRANE EXTERNE

DE SHIGELLA FLEXNERI F6S ,CARACTERISATION DE CES MUTANTS PAR LA SENSIBILITE AUX

BACTERIOPHAGES ET LOCALISATION GENETIQUE D'UNE MUTATION .

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences

Claudine GODARD

Ma toutz poAtyimtièAz A.zconnaÔ66ancz va à Monô-izuA. tz Pao^z^6zua. J. Bzimza poua VaXtzntion zt Zz éouvtizn constants qu’ZZ m'a accoadzi au couu dz cz tAavcUZ, pou/i tout cz qu’tZ m'a appaZs zt ^ait appnzzizA., tant sua Zz pZan sziznti^tquz quz sua Zz pZan humatn.

J Z ttzns à zxpatmeA ma pAo^ondz gaatitudz à MonstzuA Zz Pao^zsszua R. Thomas poua Zz tzmps qu'IZ m'a consacAz zt poua Zzs pazctzux conszÂZs pan. Zzsquzts ZZ m'a cUdzz à oaZzntzn mon tnavcuLZ. Jz souhaltz ausst

azunzactzA Zzs chznchzuas du SzavZjcz dz Gznzttquz, zt tout panttcatizazmznt Madamz Zz Voctzun C. VambZy, poun Zzun. atmabZz accuziZ cUnsZ quz poun Zzs tn^onjnatZons zt Zzs aztnaaquzs dont ZLs m'ont j^aZt bznz^tcZzn.

Ma gnatZtudz s'adazssz à Monstzun Zz Pao^zsszun. P. Boadzt qui, m'ayant accuzWLiz à Z' Institut PoustzuA. du Baabant, a ^avontsz czttz ztudz pan. sa con^tancz zt s zs zncounagzmznts.

Monstzun Zz Pno^zsszun F. Vz Mzutzn m'a pznmts dz mznzn ma tâchz à btzn, jz Zz nzmznctz ausst vtvzmznt dz m'avotn documzntzz Sun. Zzs

Entznobactzntzs zt dz m'avotn o^^znt Za posstbtUtz dz ^nzquzntzn son Zabonatotnz.

Monstzun Zz Pno^zsszun P. Fnzdzntcq a btzn voulu mz latnz

pno^ttzn dz sa vastz zxpzntzncz, notammznt dans Zz domatnz dzs coZtctnzs, jz Zut zn suts tnzs nzconnatssantz.

Jz nzmznctz Monstzun Zz Pno^zsszun L. Manttn poun szs consztts judtctzux dans Zz domatnz dz Za Statesttquz.

Jz suts kzunzusz d'avotn pu, zn unz connzspondancz sutvtz, zchangzn dzs tn^onmattons concznnant Za gznzttquz du ZtpopoZyostdz dz ShtgoUZa ^Zzxnznt avzc Madamz Zz Pno^zsszun l/.G. Pztnovskaya dz Z' Institut GamaZzya dz Moscou.

Madame M.P. BeumeA, avec taqueZte j'cU commencé cette aecheAche, m'a enAtckie de 6e^ nombAeiueà connalà-éance^ en bacXêAcotogte et dan6 le domaine de l'acUoAptlon dei bactéfU.ophage&, je voixdAJxÂjs lou. expAtmeA à qu-oZ point 6on amltÂé m'a été pAécleuAe tout au long du tAavcUZ l

Ma Aeconnal&^ance va à MonàteuA le PAo^eà-ôeuA V. Vekegel pouA

■6C6 In^oAmatlonA conceAnant la poAot bactéAtenne et pouA l'ob4>eAvatton de bactêAlophageô au micA06cope électAonlque.

C ei>t pouA mot un tAé& gAand plalôtA de pouvotA ÀemeActeA tct Madame le VocteuA E. Hannecant coA j'ai pu compteA -àuA £on amttté et -àuA -iei excellente cône elle à tout moment. En poAttculteA, je dote beaucoup à eon aide en mattéAe d'analyee chtmtque du Itpopolyoetde.

Madame le VocteuA P.H. Mdkeld et Madame le VocteuA M. UuAmtnen du LaboAatotAe CentAol de la Santé Publique d'Heletnkt m'ont aeet&tée de leuAb CO ne elle en mattéAe de génétique de la euA^ace bactéAtenne. MoneteuA le VocteuA 0. LüdeAltz et MoneteuA le VocteuA G. Schmidt de V Inetltut Max Planck d'Immunobiologie de pAetbuAg m'ont ^ait pAoijtteA à plueleuAe AepAieee de leuxe tAée gAandee connateeancee dane le domaine dee

llpopolyoeldee. MoneteuA le VocteuA E. VandeAwlnkel du C.E.R.I.A. à BAuxellee m'a beaucoup aidée de eee cône elle et commentalAee peAtlnente, notamment à pAopoe dee membAanee bactéAlennee. Ve même, j'al pu avolA malntee dlecueelone ^Auctueueee avec MoneteuA le VocteuA J.P. GAotla de la faculté de Médecine. A toue e'adAeeeent mee tAée gAande AemeAclemente.

J'aeeocle à mee AemeAclemente toue lee membAee du SeAvlce dee BactéAlophagee et du SeAvlce de Chimie de l'Inetltut PaeteuA du BAabant, dont j'al pu appAécleA la collaboAatlon e^^lcace et le eoutlen moAol.

Je clteAol en pantlculleA MoneteuA L. LemalAe pouA la plue gAande poAtle dee Aéalleatione technlquee, MoneteuA F. Vepuydt pouA la AepAoductlon dee echémae et dee gAaphlquee, MoneteuA W. Mélle pouA la dactylognaphle et la pAéeentatlon dee tableaux.

A toue ceux qui m'ont aidée de leuA amabilité et encouAogée au couAe de ce tAavall j'expAime ma pAo^onde gAotltude !

SOMMAIRE

Page

ABREVIATIONS ET SYMBOLES 1

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES 3

RESUME 6

INTRODUCTION

1. Shigella flexneri F6S dans la classification bactérienne. 8 2. Le constituant lipopolyosidique de la membrane externe

des Entérobactéries 13

2.1 - L'enveloppe des bactéries grara-négatives. 13 2.2 - La membrane externe des Entérobactéries. 15 2.3 - Structure chimique et biosynthèse du lipopolyoside. 18

2.4 - Variation S - R. 23

2.5 - Gènes de biosynthèse du lipopolyoside. 25 2.6 - Rôle biologique du lipopolyoside. 26 3. Le lipopolyoside de Shigella flexneri. 30

3.1 - Structure physico-chimique. 30

3.2 - Structure chimique du polyoside 0. 30

3.3 - Structure chimique du core. 32

4. But du travail. 33

4.1 - Récepteurs de bactériophages sur le lipopolyoside.

Récepteur du bactériophage Pl chez Sh. flexneri F6S. 34 4.2 - Etat du lipopolyoside chez E. coli Kl2. 37 MATERIEL ET ^^ETH0DES

1. Souches. 40

2. Milieux 45

3. Détermination de la sensibilité aux bactériophages.

(Adsorption, lyse, inhibition par des extraits bactériens) 47 4. Lysogénisation et recherche de prophages. 49 5. Détermination de la sensibilité aux colicines. 50

6. Recherche du caractère colicinogène. 50

7. Etude du caractère S ou R. 50

8. Etude du lipopolyoside. (Extraction, analyse chimique) 52

II.

9, Mutagénèse. 53

10. Isolement de mutants. 54

11. Isolement de survivants à Pl ou H . 54

12. Test de fluctuation statistique. 55

13. Conjugaison. 55

14. Transduction. 56

RESULTATS

1. Obtention_de âiverses_souches_rough_à_la_suite_de 1'infection de Shigella flexneri F6S sérotype 5b

par le phage Pl. 58

1.1 - Recherche de variants rough de Shigella flexneri F6S par différentes méthodes.

1.1.1 - Vieillissement de la culture. 58 1.1.2 - Sélection par la streptomycine. 58

1.1.3 - Irradiation UV. 58

1.1.4 - Infection par le phage Pl. 58 1.1.5 - Mutants d'un survivant à Pl sélectionnés

pour la résistance aux phages T3, T5, T7. 50 1.2 - Caractérisation préliminaire d'une série de variants

obtenus par l'action de Pl. 52

1.2.1 - Modification de la sensibilité aux phages

Lisbonne. 52

1.2.2 - Modification de la sensibilité aux colicines. 52 1.2.3 - Etude de l'adsorption des phages Tl et

Plkcvir sur le variant F680. 56

1.2.4 - Caractère "part-rough". 70 1.3 - Caractère général du phénomène dans l'espèce

Shigella flexneri. 73

propriétés de surface chez Shigella flexneri F6S. 74 2.1 - Recherche d'une relation entre l'apparition de

sensibilités aux phages T et un apport génétique

par le phage Pl dans la bactérie F6S. 74 2.1.1 - Infection de F6S par Plkcvir régénéré

sur F6S. 74

2.1.2 - Lysogénisation de F6S par Pl. 75 2.1.3 - Recherche de plasmide(s) chez F6S. 75 2.1.4 - Obtention des modifications de la sensibilité

aux phages T en l'absence d'infection virale. 77 2.2 - Test de fluctuation statistique, 78

2.2.1 - Méthodes statistiques de caractérisation

de la fluctuation. 79

2.2.2 - Expériences d'étude de la fluctuation des 3

nombres de variants T . 82

If'

2.2.3 - Fréquence de mutation. 85

3. Çlsssification_en_chimiotypes_des_mutants rough de Shigella flexneri F6S et relation avec la sensibilité

aux_phages. 88

3.1 - Sensibilité aux phages T et à des phages spécifiques

de chimiotypes R de Salmonella. 88

3.2 - Etude chimique des lipopolyosides de divers mutants

et établissement de leur chimiotype. 93 3.3 - Relation entre la composition du lipopolyoside et

l'activité réceptrice vis-à-vis de plusieurs phages. 100 4. Réalisation de gènes impliqués dans la biosynthèse du

flexneri F6S. 102

4.1 - Obtention de souches lac"*^ Hfr de Sh. flexneri F6S. 102 4.2 - Etude génétique du mutant rfa-7 F680. 104 4.2.1 - Réversion du mutant F680. lo4 4.2.2 - Conjugaison de la souche F6S-3 Hfr avec

le mutant F680 F . 104

4.2.3 - Co-transduction par Plkc des caractères

mtl"'’ et rfa''' de F6S à F680. 109

IV.

4.3 - Transfert de caractères antigéniques O de

Sh. flexneri F6S à E. coli Kl2. 111

4.3.1 - Conjugaison de F6S-3 Hfr ou de F6S-4 Hfr

avec K12 2.1 F~. 111

4.3.2 - Conjugaison de F6S-3 Hfr avec Kl2 PA409 F . H3 4.4 - Restauration du caractère S chez Sh. flexneri F680

(rfa-7) par conjugaison avec E. coli Kl2.

4.4.1 - Conjugaison d'E. coli P4X Hfr avec

Sh. flexneri F680 F . 117

4.4.2 - Etude chimique du lipopolyoside de la souche S

hybride FC74. 110

DISCUSSION

1. Etude de mutants du lipopolyoside à l'aide de bactériophages,126 1.1 - Utilisation de bactériophages pour la sélection

de mutants rough. 126

1.2 - Relation entre la sensibilité à divers bactériophages et la composition du lipopolyoside. 127 2. Etapes de la biosynthèse du core du lipopolyoside de

Shigella flexneri F6S. Comparaison avec Salmonella et

Escherichia coli. 132

3. Gènes impliqués dans la biosynthèse du lipopolyoside de

Shigella flexneri F6S. 139

3.1 - Gènes impliqués dans la biosynthèse du polyoside O. 139 3.2 - Gènes impliqués dans la biosynthèse du core. 1^2 3.3 - Lipopolyoside d'un hybride Sh. flexneri F6S -

E. coli K12. 144

CONCLUSION, 146

BIBLIOGRAPHIE. 147

s : smooth (lisse) R : rough (rugueux)

S-R : aspect de la culture en bouillon intermédiaire entre les aspects S et R

- R : l'aspect de la culture en bouillon, l'agglutination en NaCl 2 % et l'agglutination par les antisérums spécifiques font penser à la présence de chaînes S encore relativement nombreuses dans le lipopolyoside

Polyoside O ; polyoside spécifique porteur des antigènes O, lié à la structure core-lipide A dans le lipopolyoside (Lipo)polyoside S : (lipo)polyoside complet

(Lipo)polyoside R : (lipo)polyoside limité au core ou à une partie du core.

Ac : groupement acétyle ATP : adénosine triphosphate CMP : cytosine monophosphate CoA : coenzyme A

E. : Escherichia

FH R : mutants R de Shigella flexneri désignés par le sigle général FH F6 R : mutants R de Shigella flexneri désignés par le sigle général F6,

issus de la souche F6S Gai : galactose

Glc : glucose GlcN : glucosamine

GlcNAc : N - acétylglucosamine Hep : heptose

KDO : cétodésoxyoctonate (ou mannooctulosonate) LANa : milieu nutritif gélosé LA rendu 0,4 M en Na"*^

LAnalA : milieu nutritif gélosé LA contenant 40 Mg/ml d'acide nalidixique

LAstr : milieu nutritif gélosé LA contenant 600 Mq/ml de streptomycine

2.

LBCa LBNaCa LBOx

MBmtlstr

rfa

rfb

Rha Sh.

S.

TDP Tr

X

Tr X/Y

<pS

[ TxTy .. .] ^ [ TxTy .. .] -r

UDP

Bouillon LB rendu 2.10 en Ca^'*'

bouillon LB rendu 0,4 M en Na^ et 2.10 en Ca^"*^

bouillon LB additionné d'oxalate de sodium (concentration finale lO M)-2

milieu synthétique MB contenant 2 % de mannitol et 600 Mg/ml de streptomycine

désignation de gènes de biosynthèse du core du lipopolyoside

désignation de gènes de biosynthèse de la partie spécifique O du lipopolyoside

rhamnose Shigella Salmonella

thymidine diphosphate résistance au phage Tx

résistance aux phages Tx et Ty sensibilité a\ix phages Tx et Ty résistance aux phages Tx, Ty, ...

résistance aux phages Tx, Ty, ... mais la résistance à certains phages n'est que partielle

uridine diphosphate

mobilité électrophorétique d'une souche S

mobilité électrophorétique d'un variant R de cette souche S.

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

TABLEAUX.

Introduction.

1. Shigella flexneri dans la classification des Entérobactéries.

2. Sérotypes de Shigella flexneri.

3. Comportements smooth et rough.

4. Structure des antigènes 0 de Shigella flexneri.

Matériel et méthodes.

5. Souches bactériennes : caractères étudiés.

6. Souches bactériennes : propriétés de surface.

7. Souches de bactériophages et milieux adaptés.

Résultats.

Obtention_de souches £°ugh.

8. Sensibilités aux phages et propriétés sérologiques de souches dérivées de Sh. flexneri F6S.

9. Efficacités d'étalement des phages Lisbonne.

10. Adsorption de phages Pl.

11. Colicinotypie.

12. Sensibilités aux colicines M, El, E2, E3 et aux phages (j)80, Tl, T5, BF23, T2, T6.

13. Adsorption du phage Tl sur les souches F6S et F680.

14. Etalement des phages Plkcvir, Plfvircl et Plfvirtu sur diverses souches de Sh. flexneri et d'E. coli.

15. Réactions d'agglutination.

Rôle du phage Pl.

Page

8

39 41 43

57 59 61 63

65 67

69 71

16. Test de fluctuation. Expérience 1. 81

17. Test de fluctuation. Expérience 2. 83

ChimiotYges rou2h_et_sensibilité aux ghages.

18. Mutants FH R de Sh. flexneri.

19. Activité de phages spécifiques de formes R chez Salmonella.

20. Efficacités d'étalement des phages spécifiques de formes R chez Salmonella minnesota.

21. Efficacités d'étalement des phages spécifiques de formes R chez Shigella flexneri.

22. Teneurs relatives en lipopolyosides S et R chez la souche F6S et des mutants R.

23. Composition en sucres des lipopolyosides R.

24. Rapports molaires des sucres dans les lipopolyosides R.

25. Composition du lipopolyoside et activité réceptrice de phages.

Localisation de gènes de biosynthèse du lipopolyoside.

26. Souches Hfr de Sh. flexneri F6S.

27. Caractérisation par les phages de différents cores lipopolyosi- diques.

28. Conjugaison Sh. flexneri F6S Hfr x Sh. flexneri F680 F . 29. Conjugaison Sh. flexneri F6S Hfr x E. coli Kl2 2.1 F . 30. Conjugaison Sh. flexneri F6S Hfr x E. coli Kl2 PA409 F . 31. Propriétés de surface des hybrides E. coli - Sh. flexneri.

32. Caractères d'hybrides E. coli - Sh. flexneri S ou + R.

33. Conjugaison E. coli Kl2 P4X Hfr x Sh. flexneri F680 F ,

34. Composition en sucres du lipopolyoside de l'hybride Sh. flexneri E. coli FC74.

35. Composition en sucres du polyoside O de l'hybride Sh. flexneri - E. coli FC74.

36. Nombres de chaînes S et R dans le lipopolyoside de l'hybride Sh. flexneri - E. coli FC74.

90

90

91

94 96 97 99

103

105 107 110 llO 112 114 116

119

121 87

123

Discussion.

37. Sélection de mutants rough de Sh. fexneri F6S par les phages.

38. Structure du lipopolyoside et activité réceptrice de phage chez

Shigella flexneri. ^28

39. Oligosides R chez Sh. flexneri, Salmonella, E. coli.

40. Réactions sérologiques croisées entre chimiotypes R de

Sh. flexneri et de Salmonella ou d'E. coli. 134

41. Différents cores lipopolyosidiques chez les Entérobactéries. 136

FIGURES.

Introduction.

1. Enveloppe cellulaire d'une bactérie gram-négative. 12 2. Membrane externe d'une Entérobactérie.

3. Schéma du lipopolyoside. 17

4. Structure chimique du lipopolyoside de S. typhimurium. 19 5. Gènes de biosynthèse du lipopolyoside de S. typhimurium LT2. 2U 6. Modèle physico-chimique du lipopolyoside S. 29

Résultats.

Obtention_de_souches_rough.

7. Adsorption du phage Plfvircl sur le variant F680, 67 Chimiotypes rough_et_sensibilité_aux_phages.

8. Chimiotypes de mutants R de Salmonella. 89

9. Fractionnement des polyosides S et R chez des souches de Sh. flexneri. 95

^calisation_de_qènes j3^e_biosynthèj>e_ du_J.j.poppJ.yo_sj._de^^

10. Carte génétique d'E. coli Kl2. lOl

11. Cinétique de transfert lors de la conjugaison Sh. flexneri

F6S Hfr X Sh. flexneri F680 F . 108

12. Fractionnement des polyosides S et R de l'hybride Sh. flexneri -

E. coli FC74. 122

Discussion.

13. Gènes de biosynthèse du lipopolyoside chez Sh, flexneri F6S,

E. coli Kl2 et S. typhimurium LT2. 138

6.

RESUME

Le lipopolyoside de la membrane externe de Shigella flexneri F6S sérotype 5^3 se compose de trois parties : le polyoside spécifique 0, le core ou polyoside de base et le lipide A. La présence du polyoside spécifique 0 à la surface de la bactérie confère à celle-ci le caractère smooth et les propriétés anti­

gèniques qui en déterminent le sérotype.

Dans les mutants rough, le lipopolyoside se limite au core^ou à une partie du core, lié au lipide A. Nous avons isolé des mutants rough après

infection de Sh. flexneri F6S par le bactériophage Plkcvir. Grâce à ces l -

mutants nous avons pu établir la séquence des réactions d'addition de sucre dans la formation du core, sauf une étape ; d'autre part, nous y avons loca­

lisé les récepteurs de divers bactériophages. Nos résultats peuvent se schématiser de la façon suivante :

^ T

Sucres : Glc—> „—>Gal—) Glc—)( Hep ) —>( KDO )_---lipide A

(jJlCJN d 3

tï 1T IT 1Î 1T

Bactériophages : 6SR TT Plkcvir V FP3 C21

Tl+

T3

Nous avons réalisé des expériences de conjugaison et de transduction afin de localiser une mutation, responsable du blocage de l'addition du glucose final, sur le chromosome de Sh. flexneri F6S. Cette mutation, désignée rfa-T, se situe à environ 1 minute d'un gène mtl et, plus approximativement, à

environ 65 minutes d'un marqueur lac"*” préalablement introduit par conjugaison avec E. coli Kl2. Une telle localisation correspond à celles de gènes rfa chez S. typhimurium et chez E. coli. En outre, nous avons montré que le

lipopolyoside d'un recombinant contenant la plus grande partie du chromosome de Sh. flexneri F6S et la région rfa d'E. coÜK12 PUX était vraisemblablement formé du polyoside 0 spécifique de Sh. flexneri F6S lié au core d'E. coli K12 PUX. La fréquence d'attachement du polyoside 0 au core hétérologue semblait proche de celle que l'on observait vis-à-vis du core homologue.

Par des expériences de conjugaison avec E. coli K12, nous avons confirmé dans le cas de la souche F6S la localisation des gènes rfb responsables de la synthèse de la structure de base du polyoside 0 de Sh. flexneri

( antigènes 3,4 ) près de la région his et la localisation des gènes déterminant les antigènes V et 7,8 près de la région lac.

Dans le contexte des données existantes, nos résultats permettent de proposer que plusieurs régions génétiques analogues quoique non identiques déterminent la biosynthèse du lipopolyoside chez Sh. flexneri, chez E. coli et chez Salmonella.

Tableau 1 : Classification des Entérobactéries - Position de Shigella flexneri F6S (38, 60, 27^, 205). CD

Genre

Escherichia Espèce

Shigella --- --- ^ Shigella

Salmonella Shigella

Arizona Shigella

Citrobacter Shigella

Edwardsiella Shigella

Klebsiella Enterobacter Serrâtia

Pectobacterium Proteus

Providencia

sérotype dysenteriae

flexneri --- > la, Ib newcastle (x) 2a, 2b

boydii 3a, 3b

sonnei Ua, Ub

5a, 5h variante X variante Y

(x) : D'abord considérés comme faisant partie de l'espèce Shigella flexneri, les membres du

groupe Shigella newcastle pourraient être placés dans l'espèce Shigella boydii ou constituer ime espèce indépendante.

INTRODUCTION

1. - SHIGELLA FLEXNERI F6S DANS LA CLASSIFICATION BACTERIENNE.

Les bactéries Shigella flexneri font partie du grand groupe des bactéries négatives à la coloration de Gram. Elles s’y classent dans le groupe des bactéries entériques (264, 86) - au sein de la famille classique des Entérobactéries (130, 6o). Celles-ci sont des organismes bacillaires de dimension < 5 anaérobies facultatifs, organotrophes, se reproduisant par division binaire, mobiles ou immobiles; les Shigella sont immobiles.

La définition du genre Shigella et de l'espèce Shigella flexneri parmi les Entérobactéries (tableau 1) se base sur les propriétés biochi­

miques et antigéniques, ainsi que sur la localisation dans la nature et le comportement pathogène (59» 60). Nous remarquerons que les membres du genre Shigella se définissent essentiellement par des caractères biochimiques négatifs relativement aux membres des autres genres de la famille des Entérobactéries : ce sont des bacilles non mobiles, non aéro­

gènes, capables de ne fermenter que peu d'hydrates de carbone et incapables de décarboxyler la lysine ou d'hydrolyser l'arginine. D'autre part, les membres du genre Shigella provoquent chez l'homme des dysenteries aiguës ou chroniques très caractéristiques, de nature épidémique. Etudiée dans le cas de Shigella flexneri notamment, la caractéristique pathologique princi­

pale de la dysenterie bacillaire classique est associée à la pénétration des bactéries dans les cellules de l'épithélium intestinal avec production de lésions ulcératives de la muqueuse intestinale; du mucus, des globules rouges et des cellules inflammatoires apparaissent dans les selles (T2, 205b). Une perte d'eau et d'électrolytes s'observe également dans certains cas, peut-être due à la production d'une exotoxine par les bactéries;

chez Shigella flexneri, les préparations de ce type de toxine obtenues jusqu'à présent ne possèdent qu'une activité spécifique extrêmement faible comparativement à celles de Vibrio cholerae, d'Escherichia coli, de

Salmonella typhimurium ou de Shigella dysenteriae (139, 191, 136, 205b).

Tableau 2 • Subdivision de l'espèce Shigella flexneri en sérotypes (50, 255, 27U, 205

Sérotype Formule abrégée

antigénique (1)

Agglutination par les sérums spécifiques (2) Type

I II III IV V

Groupe

3,4 6 7,8

la I ^• 4 +++ ^- - +++ - - ( + )

1b I : (4) : 6 +++ - - ++(-) +++ ^-

2a II 3,4 ^{+++ -} - ⁺⁺⁺ - ^-

2b II 7,8 ^{- +++} - ^- - ⁺⁺⁺

3a III (3,4) : 6 +++ - - ++(-) +++ -

3b III 6 : 7,8 +++ - - -(+) +++ +++

4a IV 3,4 ^{- ^ -} +++ - +++(-) - -

4b IV 6 ^{- - -} +++ - -(++) +++ -

5a V 3,4 ^{_ -} T- +++ ++ - -

5b V 7,8 ^{_ - ^} - +++ - - +++(-)

X - 7,8 ^{^ ^} - - - ^{T- +++}

Y ^- 3,4 , ^{— — — - +++ — —}

+++ : agglutination forte; + à ++ : agglutination relativement faible; ^ : pas d'agglutination;

{ ) : réactions occasionnelles.

(1) : en plus des antigènes cités, des antigènes de groupe 1, 2, 5» 9» ••• ont été reconnus lors des études sérologiques préalables au classement en sérotypes,

(2) : agglutination sur lame par des antisér\ims absorbés.

En fait, les genres Escherichia, Shigella et Salmonella,

ainsi que les genres Arizona et Citrobacter qui rendent compte de caractères intermédiaires par rapport a\ix trois premiers, forment un groupe de

microorganismes étroitement apparentés. Leurs ADN ont la même composition en bases (i+8-53 ^ GC) et peuvent s'hybrider relativement facilement

(pourcentage relatif d'hybridation de l'ADN avec celui d'E. cbli K12 à 60°C : 85 “ 100 ^ pour les bactéries Escherichia, 80 - 89 ^ poiir les bactéries Shigella et kh - k3 % pour les bactéries Salmonella) {26k, 39).

Il se pourrait que des hybrides entre Escherichia coli et Shigella flexneri aient été obtenus lors d'infections mixtes dans l'intestin de souris gnotobiotiques (I66),

Le genre Shigella comprend les espèces citées dans le tableau 1.

L'utilisation d'une série de sérums spécifiques de type et de groupe permet d'encore subdiviser l'espèce Shigella flexneri en sérotypes (tableau 2).

La souche Shigella flexneri f6S que nous avons placée au centre de notre étude appartient au sérotype 5L, de formule antigénique V : 7,8, selon Khomehko (cf. p. 42).

ro

Fig. 1 : SECTION DE L'ENVELOPPE CELLULAIRE D'UNE BACTERIE GRAM-NEGATIVE (262, 290, 224, 266).

PAROI ]] MEMBRANE EXTERNE

^PEPTIDOGLYCANE___________

JmEMBRANE CYTOPLASMIQUE

CYTOPLASME

ESPACE PERIPLASMIQUE (20-40% DU VOLUME DE LA CELLULE)

Le schéma n'est pas strictement à l'échelle.

2. - LE CONSTITUANT LIPOPOLYOSIDIQUE DE LA MEMBRANE EXTERNE DES ENTEROBACTERIES.

2,1 - L'enveloppe des bactéries Rram-neRatives.

Le caractère Gram" correspond à une structiire multilamellaire de la paroi cellulaire telle qu'elle se présente lors de l'examen au microscope électronique (fig. l). Dans l'enveloppe cellulaire des bactéries gram-négatives l'on peut en effet distinguer 3 couches : la membrane cytoplasmique ou membrane interne, une couche mince et rigide de peptidoglycane et la membrane externe;

entre la membrane cytoplasmique et la membrane externe s'étend l'espace péri- plasmique; l'ensemble de la couche de peptidoglycane et de la membrane externe constitue la paroi cellulaire; en outre, l'on trouve parfois au-delà de la membrane externe une capsule ou une substance visqueuse peu liée à la surface bactérienne, le "slime" (262, 86, U8).

La membrane cytoplasmique contient principalement des protéines et des phospholipides. A son niveau se situe le métabolisme énergétique et le transport actif d'éléments nutritifs et d'électrolytes (200, 1^+7),.

Des réactions de biosynthèse s'y déroulent aussi et notamment des réactions impliquées dans la formation des éléments extérieurs de l'enveloppe : lipopolyoside (199), phospholipides (215), peptidoglycane ( 3^ ) et, vraisemblablement, protéines de l'espace périplasmique et de la membrane externe (216, 259)-

Outre les macromolécules que l'on pense en transit vers la périphérie de la bactérie, l'on localise principalement dans la zone périplasmique de nombreuses molécules d'enzymes ayant une activité hydrolytique et des protéines impliquées dans la reconnaissance et le transport de métabolites, les "binding proteins", qui sont peut-être associées à la face externe de la membrane cytoplasmique ou à d'autres composants de l'enveloppe (U9, 266, 117, 137).

Le peptidoglycane peut être considéré comme une énorme macromolécule constituant un réseau rigide autour de la membrane cytoplasmique, réseau formé par la polymérisation en chaînes linéaires d'unités disaccharide-oligopeptide unies par des liens osidiques et par l'interconnexion de ces chaînes au moyen de liens peptidiques; environ 50 % des peptides sont ainsi dimérisés (3I+, U9).

Fig. 2 : MODELE D'ARRANGEMENT DES CONSTITUANTS PRINCIPAUX DE LA MEMBRANE EXTERNE D'UNE ENTEROBACTERIE (290,49,277,257, 187;

--- riikaido. H.-, communication présentée au Xlle Congrès International de Microbiologie, Munich, septembre 1978).

POLYOSIDE

POLYOSIDE 0

POLYOSIDE DE BASE (CORE)

□ EXTREMITE POLAIRE (GLUCOSAMINE)^

CHAINE

HYDROCARBONEE

LIPIDE A J

CHAINE

HYDROCARBONEE

LIPOPOLYOSIDE PHOSPHOLIPIDE PROTEINE LIPOPROTEINE CATION

LIEE AU PEPTIDOGLYCANE BIVALENT

Une lipoprotéine (dite "de Braun") est, chez plusieurs espèces gram-nêgatives dont Shigella flexneri, en partie liée de façon covalente au composant peptidique du peptidoglycane; elle entre par ailleurs dans la composition de la membrane externe et servirait à l'ancrage de celle-ci vis-àvvis de la couche peptidoglycane ( 3^+ ) •

La membrane externe contient des protéines, du lipopolyoside et des phospholipides (290), soit, en poids, approximativement hO % de protéines, 30-1^0 % de lipopolyoside et 20-30 % de phospholipides chez E. coli K12, par exemple (277, 249). Sa fonction principale concerne l'opposition à la pénétration de certaines substances du milieu extérieur dans la cellule (54, 34, 292).

Il semble exister des sites d'adhésion, à travers le peptidoglycane, entre la membrane cytoplasmique et la membrane externe : au nombre de

200 à 400, ces sites seraient par exemple utilisés par les bactériophages pour injecter leur acide nucléique (l4,75).

2.2 - La membrane externe des Entérobactéries.

L'étude de la membrane externe des bactéries gram-négatives

représente actuellement un domaine de recherches intenses. Nous rapporterons principalement des résultats obtenus chez E. coli et S. typhimurium.

La distribution des composants de la membrane externe paraît bien asymétrique (fig. 2 ) : les phospholipides seraient essentiellement situés dans le

feuillet interne (277 ), alors que le lipopolyoside serait intercalé dans le feuillet externe par sa partie hydrophobe de telle façon que les chaînes polyosidiques hydrophiles, longues d'environ 20 nm (il arrive même qu'elles atteignent 150 nm), se projettent vers l'extérieur (252, 182, l8l).

Un calcul portant sur deux souches sauvages de S. typhimurium et sur un g

mutant à lipopolyoside incomplet montre que les quelque 10 motifs

lipopolyosidiques que l'on trouve sur la bactérie occupent par leur partie lipidique 15 à 25 ^ de la surface (l82). L'on trouve des protéines dans les de\ix feuillets et plusieurs d'entre elles seraient transmembranaires (129, 185, 62).

La membrane externe s'oppose à l'entrée dans la cellule bactérienne de nombreuses substances hydrophobes telles que les sels biliaires, des détergents, des colorants et des antibiotiques : il

semble que cet effet d'exclusion soit lié à l'absence de zones signi­

ficatives de double-couche lipidique susceptibles d'interagir avec les molécules hydrophobes (1+8, l88 ). La membrane externe constitue également une barrière de perméabilité vis-à-vis des substances hydrophiles mais

il s'y trouve des pores permettant, par exemple pour des osides chez Salmonella, le passage des molécviles hydrophiles de masse inférieure à 600 daltons ( 5I+ ). Des molécules de protéines majeures de la membrane, encore appelées porines, peuvent former ces pores, par où pénètrent de façon non spécifique les éléments nutritifs nécessaires à la bactérie : sucres, nucléotides, acides aminés, anions sulfate et phosphate, ...

(13, 185, 73» 189 ). D'autres protéines,mineures»sont capables de faciliter de manière spécifique le passage de certaines substances (maltose, vitamine B12, complexes ferriques, nucléosides) (271, 61, 11, 31, I65, II8, 36, 111, 35).

Dans la membrane externe des quelques souches bactériennes déjà étudiées l'on distingue un petit nombre de protéines majeures, présentes en un nombre de molécules de l'ordre de 10^ à 10^ (158, 3^). Parmi celles-ci, il en est qui contribuent au maintien de la forme de la bactérie, en association avec le peptidoglycane (3^, 2^+9, 292).

La membrane externe semble n' être le siège que de peu d'activités enzymatiques : l'on y a décelé des activités de phospholipase et peut-être de protéase (215, 260).

Les lipopolyosides extraits des bactéries tendent à former des

"solutions" aqueuses opalescentes contenant des agrégats polydisperses dont la masse atteint plusieurs millions de daltons. Les forces impliquées dans cette agrégation, comme probablement celles qui régissent les interactions avec les autres composants de la membrane, sont de nature hydrophobe, ionique

(cations bivalents) et lien hydrogène (29O, 292, 3^, 29^+, 2^+8, 253, IO8, I87, 278). Il se pourrait encore que la partie lipidique du lipopolyoside soit liée à une protéine par un lien covalent (290, 290b).

16.

EtN.9

X

3-C

(D

CDO CJ

EtN

XZZTH

1

(Do_

O®(_) a

✓ O LJ

— NH -•--- (14) -<16

T

--- (12)--- -NH -•--- (14)-

■— (14)- -(14) —

1 II II il J

POLYOSIDE CORE EXTERNE CORE INTERNE LIPIDE A

SPECIFIQUE 0

HOOC —.--- (14)--- - ACIDE (8 -HYDROXY-MYRISTIQUE - r"m SUCRE HOCC --- (12)--- - ACIDE LAURIQUE ACIDES COD®

ro AC 1_______1 ACIDE CETODESOXYOCTONIQUE : CH^DH - (CHOH)^- CH^- CO HOOC --- (14)--- - ACIDE MYRISTIQUE

EtN ETHANCLAMINE HOOC --- (16)--- ACIDE PALMITIQUE

P GROUPEMENT PHOSPHATE

COOH

D'après H. Nikaido, 1973 (187) et S.G. Wilkinson, 1977 (290). La figure n'est pas à l’échelle; la disposition spatiale des groupements ionisés et des résidus acide gras est arbitraire; l'existence de liens pyrophosphates entre les motifs lipopolyosidiques n'èst pas certaine (183).

18.

L'isolement de germes mutés dans la partie hydrophobe du

lipopolyoside n'a été possible qu'à l'aide d'artifices : il semble que de telles altérations soient létales ( 1^6),

Nous aborderons plus loin les propriétés biologiques

du lipopolyoside. Signalons cependant encore que lipopolyosides et protéines portent des sites récepteurs de bactériophages et de bactériocines.

(6l, 11, 35, 111, 1H9, 295).

2.3 - Structure chimique et biosynthese du lipopolyoside.

L'essentiel des connaissances actuelles sur les lipopolyosides des bactéries gram-négatives concerne Salmonella, le plus souvent S.

typhimurim ou S. minnesota. Il semble cependant que l'on retrouve ou doive retrouver des macromolécules comparables dans les autres espèces gram- négatives (290 ).

Le lipopolyoside comporte 3 parties, soit de l'intérieur vers l'extérieur de la bactérie : le lipide A, le polyoside de base ou core et le polyoside spécifique 0 (fig. 3 ). Les parties core-lipide A et

polyoside 0 sont synthétisées séparément au niveau de la membrane cytoplasmique, aux dépens de précurseurs nucléotidiques formés à l'intérieur de la cellule.

Le polyoside 0, lié à un lipide porteur au cours de sa biosynthese, serait ensuite transféré à l'ensemble core-lipide A à l'intervention d'une ligase ( 201, 223). Une étude chez E. coli J5 a montré que la translocation de la molécule lipopolyosidique vers la membrane externe était pratiquement totale

après 10 min à 30°C, l'on en ignore le mécanisme ( 20U). Il semble que,

chez Salmonella, cette translocation se fasse par les sites d'adhésion entre membrane cytoplasmique et membrane externe; l'on retrouve ensuite les

molécules de lipopolyoside réparties sur toute la surface externe de la

bactérie après 2 à 3 minutes de croissance en milieu synthétique à 3T°C ( 182).

Il se pourrait qu'un remodelage continuel du peptidoglycane entraîne une reformation dynamique des sites d'adhésion à des endroits différents, permet­

tant ainsi la dispersion des molécules lipopolyosidiques (j. M. Ghuysen, Cours sur les membranes biologiques, février 1979).

Lipide A :

Le lipide A est un dimère phosphorylé de la glucosamine (6-0-

glucosaminylglucosamine-1'-diphosphate)sur lequel sont branchés des acides gras en des liens ester ou amide. Chez Salmonella, comme chez Shigella, ce sont principalement les acides gras saturés en C12, Cl!+ et CI6 (laurique.

■<---►

LIPIDE A

Abe = abéquose D-Man = D-mannose L-Rha = L-rhamnose D-Gal = D-galactose D-GlcN = D-glucosamine

D-GlcNAc = N-acétyl-D-glucosamine LD-Hep = L-glycéro-D-mannoheptose

KDO = acide cétodésoxyoctonique (ou 3-désoxy-D-manno-octu1osonique) P = groupement phosphate

EtN = éthanol ami ne FA = acides gras

P = forme pyranose

— = substituant occasionnel

20.

myristique, palmitique) et un acide hydroxyalkanoîque en Cl U -

hydroxymyristique); 1'acide |S-hydroxymyristique peut encore être estêrifié par un autre acide gras. La structure du lipide A est schématisée dans les figures 3 et 4. Il s-emhLe que l'on trouve des molécules composites de lipopo- lyoside, ou de lipide A, contenant 2, 3 ou 4 motifs lipopolyosidiques:

l'on a envisagé que des unités diglucosamine y soient liées par des ponts pyrophosphate ou encore par des interactions ioniques et hydrophobes.

Occasionnellement, suivant les conditions de culture, les groupements

phosphate peuvent être substitués par de 1'éthanolamine et du 4-aminoarabinose (290, 145, 183, 108, i5iih).

La biosynthèse du lipide A est encore mal connue. L'on sait que l'UDP-N-acétylglucosamine en est un précurseur et que l'attachement de cétodésoxyoctonate,résidu du core, transféré du CMP-cétodésoxyoctonate, est préalable à l'estérification par les acides gras non hydroxylés. Con­

trairement aux enzymes de transfert de stades ultérieurs de la biosynthèse du lipopolyoside, la transférase du cétodésoxyoctonate serait fortement liée à la membrane cytoplasmique et son activité ne dépendrait pas de cofacteurs phospholipidiques (20I , 145, l46, 18T, 184).

Core :

Le core peut être subdivisé en core externe, formé d'hexoses, généralement en structure pentaosidique branchée, et core interne, formé d'heptoses et de cétodésoxyoctonates, en structure branchée chez Salmonella et E. coli et porteurs de substituants phosphate, phosphoryl- et pyrophospho- ryléthanolamine (fig.3et4>* Au niveau du core interne se situent donc

divers groupements ioniques : - PO , - CO^, ~ liaison du core au lipide A se fait entre un cétodésoxyoctonate et la fonction hydroxyle en 3' d'une glucosamine (290^*

L'on a identifié des glycosyltransférases capables de catalyser l'addition séquentielle des sucres de nucléotides précurseurs (UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-N-acétylglucosamine) à l'ensemble cétodésoxyoctonate- lipide A. Ces réactions de transfert exigent la présence de phospholipides, principalement de phosphatidyléthanolamines,contenant des acides gras

non saturés ou des groupements cyclopropane. Les phospholipides interviennent dans la liaison de la glycosyltransférase au lipopolyoside en formation. Une phosphotransférase spécifique intervient dans la phosphorylation de l'heptose par l'ATP. Alors que le glucose semble se lier à l'heptose non phosphorylé, l'addition consécutive de galactose exige la présence de groupements

phosphate dans la région heptose (201, I87).

Polyoside 0 :

Le polyoside 0 est un polymère linéaire d'unités oligosidiques,

elles-mêmes de structure linéaire ou branchée, dont le nombre peut avoisiner ou même dépasser 30. Quoique l'on calcule un degré moyen de polymérisation,

il faut noter que des chaînes de dimensions différentes peuvent se trouver dans la même préparation de lipopolyoside. La variabilité de la nature des sucres des unités répétitives et des liens entre ces sucres permet la définition des très nombreiix sérotypes reconnus chez Salmonella, par exemple, en ce qui concerne les antigènes 0 (156, 290, 123). La figure U montre la structure du polyoside spécifique 0 de S. typhimurium.

Le transfert séquentiel des sucres de leurs nucléotides précurseurs au phosphomonoester d'un lipide particulier, un alcool polyisoprénoïde en

C55, y assure la formation d'une unité répétitive du polyoside 0. La polymé­

risation se produit entre unités répétitives liées, à leur extrémité réductrice, par un groupement pyrophosphate à cet undécaprénol; la chaîne en croissance est constamment transférée au nouvel oligoside activé. Une phosphatase spécifique régénérerait 1'undécaprénylmonophosphate. Il semble bien que le même intermédiaire undécaprénylphosphate intervienne dans la biosynthèse du peptidoglycane et de polyosides capsulaires, il y en aurait environ 10^ molécules par cellule bactérienne. Une modification de l'unité oligosidique par glucosylation ou acétylation peut encore se produire, probablement au cours de l'élongation du polymère lié à 1'undécaprénol.

La glucosylation fait intervenir un glucosylundecaprénylmonophosphate dont l'UDP-glucose est le précurseur; l'acétyl-CoA est le donneur de l'acétylation. La majorité des résultats expérimentaux ont été recueillis chez Salmonella, toutefois les observations faites chez E. coli et Sh.

flexneri vont dans le même sens (223, 270, 121, I87, 255).

Il nous faut cependant encore noter que des données génétiques et biochimiques font soupçonner chez Salmonella et E. coli, un autre mode de biosynthèse, peut-être par simple addition séquentielle des sucres à un intermédiaire différent du polyisoprénylphosphate, pour certains polyosides 0 comme pour les antigènes Tl et EGA mentionnés ci-après {9k ).

Tableau 3 : Comparaison des comportements smooth (S) et rough (R).

Caractère smooth Caractère rough

1. aspect des colonies ( 59 ) lisses rugueuses

2. aspect de la culture en bouillon ( 59 ) ^sédimentation lente

Idépot circulaire peu étalé

rsédimentation rapide Jdépôt large constitué

Id'agrégats 3. évolution de la suspension en NaCl > 7,5 stabilité agglutination

(5)

agglutination

h. évolution de la suspension ' stabilité

en trypaflavine 1/500 (202) ou en auramine 3 ^.(2^5)

5. migration dans un champ électrique ( 56 ) mobilité U

D < mobilité U

K 6. agglutination par les sérums spécifiques

des antigènes 0 ( 59 )

agglutination spécifique pas d’agglutination ou polyagglutinati<

2 2

A propos du polyoside 0, nous remarquerons que l'on peut aussi trouver d'autres polyosides moins spécifiques liés au core : il en est ainsi pour l'antigène commun des Entérobactéries (EGA) lié au core du lipopolyoside de certaines souches d'E. coli et de Shigella mais non chez Salmonella ni Sh. flexneri, ou pour les antigènes Tl, T2, T3, découverts chez Salmonella

(2U3, 156, 290).

2.h - Variation S - R.

Déjà en 1921 l'on décrivit des modifications du comportement de certaines cultures bactériennes qui affectaient la morphologie des colonies, le caractère de la croissance en bouillon et la stabilité en suspension saline. L'ensemble de ces modifications, considérées comme le résultat d'un processus de dégénérescence, fut désigné par l'expression

"caractère rough" (ou R) à cause de l'aspect rugueux de la surface des colonies. Par opposition, le caractère original fut appelé "smooth" (ou S), c'est-à-dire lisse, et l'on parla de variation ou de transformation S - R (59).

L'étude ultérieure, sérologique et chimique, du phénomène montra que le lipopolyoside des bactéries R ne contenait pas de polyoside 0 ou n'en contenait que peu alors que,dans leur majorité, les motifs lipopolyo- sidiques à la surface des bactéries S étaient complets (155).

L'apparition de variants R se produit souvent dans des cultures âgées (1 mois ou plus à 25°C ou à 37°C), en bouillon ou sur gélose

nutritive : il suffit de faire des étalements sur boîtes de Pétri pour repérer des colonies rugueuses. Toutefois,la fréquence d'apparition est très différente suivant la souche; dans les cas extrêmes, une durée de vieillissement moindre peut suffire à l'obtention de variants R ou bien le procédé ci-dessus peut ne pas être efficace (5). Il faut donc éventuel­

lement avoir recours à des techniques plus sélectives et/ou à la mutagénèse.

L'on a observé que l'exposition de cultures à la streptomycine ou au citrate de sodium pouvait permettre d'obtenir des variants rough; d'autre part, l'on a utilisé avec succès l'action d'un bactériophage ou d'un

antisérum spécifiques des chaînes 0 présentes dans la forme S du lipopolyo­

side {^2k, 69, 239, 269, 132). Les caractères de subcultures des formes S et R, faites à des intervalles d'environ une semaine, se montrent généralement stables mais le retour de la forme R à la forme S peut s'observer dans plusieurs cas après de nombreuses subcultures à 2U h d'intervalle (5).

2k.

Fig. 5 - Gènes spécifiquement impliqués dans la biosynthèse de la partie polyosidique du 1ipopolyoside de S. typhimurium LT2 (231, 267).

his = histidine

ilv = isoleucine - valine mtl = mannitol

pro = proline pur = purine trp = tryptophane

rfa = gènes du core du 1ipopolyoside rfb = gènes du polyoside 0

rfc = gène(s) de la polymérase du polyoside 0

rfe = qène(s) du polyoside 0 chez S. minnesota et S. montevideo rff = gène(s) du polyoside EGA

rft = gène(s) du polyoside Tl.

En dehors de l'analyse chimique du lipopolyoside, l'on peut caractériser la transformation S - R par les modifications citées dans le tableau 3. Il faut noter que les diverses modifications associées à ce caractère ne se manifestent pas toujours simultanément,

que les variants R se répartissent en plusieurs classes sérologiques et qu'il y a différents degrés dans le caractère rough (I56, 227). Il ressort des données chimiques, sérologiques, enzymatiques et génétiques,

recueillies essentiellement chez Salmonella, que la variation S - R apparaît comme le résultat du blocage total ou partiel d'une ou plusieurs étapes de la biosynthèse du lipopolyoside, de telle sorte que ce lipopolyoside ne contienne pratiquement plus de polyoside 0 (2^+2, I56, 201, 267» 223).

2.5 “ Gènes de biosynthèse du lipopolyoside.

L'étude de nombreux mutants de S. typhimurium et de recombinants formés entre différentes espèces de Salmonella (267, 289, 231, 232, 127,

168) a permis de reconnaître deux régions génétiques essentielles à la biosynthèse du lipopolyoside et quelques autres gènes (fig. 5).

La région rfa, qui se situe près des gènes mtl (environ 79 min), détermine plusieurs transférases et notamment les glucosyltransférases impliquées dans la synthèse du core,ainsi que probablement la synthèse d'une enzyme participant à l'attachement du polyoside 0 au core.

D'autres gènes rfa, situés à quelques minutes de part et d'autre des précédents, codent pour d'autres transférases et pour la phosphorylation du core.

La région rfb, qui se situe près des gènes his (environ min), détermine la synthèse des nucléotides des sucres spécifiques du polyoside 0, des transférases responsables de leur addition successive pour former les unités répétitives, éventuellement de l'enzyme de polymérisation de ces unités, et probablement d'une enzyme participant à l'attachement du

polyoside 0 au core. Ces gènes semblent fonctionner à un niveau constant, relativement peu élevé, quelles que soient les conditions de culture des bactéries. La polymérisation de certaines unités répétitives nécessite encore le fonctionnement de gène(s) rfc situé(s) près des gènes trp

(environ 32 min ). L'on a aussi identifié des gènes rfe, localisés près des gènes ilv (environ 8U min), probablement nécessaires à la formation d'un intermédiaire servant d'amorce à la synthèse des chaînes 0 dans certains sérogroupes de Salmonella mais pas chez S. typhimurium.

26.

Des gènes supplémentaires peuvent intervenir en modifiant les unités répétitives du polyoside 0, par exemple par méthylation ou par glucosylation d'un sucre de la structure déterminée par les gènes rfb. Dans plusieurs cas, il est apparu que ces gènes étaient portés par des prophages de conversion souvent intégrés danq le quadrant

supérieur droit du chromosome bactérien. En effet, le génome de certains bactériophages comprend des gènes qui interviennent dans la détermination de propriétés antigéniques chez la bactérie hôte; Ces gènes s'expriment aussi bien lorsqu'il y a lyse que lorsqu'il y a lysogénisation.

Par ailleurs, certaines enzymes (par exemple la glucose-1- phosphate uridylyltransférase) participent à la fois à la biosynthèse du lipopolyoside et à d'autres fonctions métaboliques importantes, les gènes correspondants se situent en dehors des régions rfa et rfb.

2.6 - Rôle biologique du lipopolyoside.

Le lipopolyoside montre une grande variété de propriétés biologiques, soit intégré dans la membrane externe, soit isolément.

L'on a établi un rapport entre la virulence d'une bactérie et l'intégrité de son lipopolyoside (222, l63, 195» 193, ^7). C'est ainsi

que la présence du polyoside 0 confère, en l'absence d'anticorps spécifiques anti-0, une certaine protection contre l'absorption ou la lyse au cours de la phagocytose par les cellules défensives de l'organisme infecté, ou encore contre la lyse par le complément, complexe protéique capable de s'insérer dans les membranes biologiques en y formant de larges pores (265, 219, 273, 220, 7^j 258). Il se pourrait que la membrane des cellules

eucaryotes soit davantage susceptible d'interagir avec la surface des

mutants rough, dépourvus de polyoside 0, parce qu'elle présente un caractère plus lipophile que celle des bactéries smooth, possédant un lipopolyoside complet; il s'agirait d'une interaction lipide-lipide non spécifique (138,

167, 128, 197). D'autre part, des sites d'interaction avec le complément situés au niveau du lipide A, ou peut-être d'autres sites d'interaction sur la surface bactérienne, pourraient être plus ou moins masqués par la chaîne polyosidique 0 liée à ce lipide A (89, 220). Nous signalerons aussi qu'il existe des indications concernant un effet spécifique de la structure de certains polyosides 0 sur la virulence (135, 275, 195, 205b).

Au lipopolyoside, essentiellement à sa partie lipide A, sont encore rattachées de multiples activités toxiques, d'ailleurs causes de la

dénomination d'endotoxine qui lui est attribuée depuis longtemps (287, 26l , 178, 208, 205b). La partie osidique servirait plutôt à solubiliser le lipide A (85). Des molécules d'endotoxine peuvent être libérées au cours d'infections et rendre compte d'effets pathologiques, tels que leucopénie, pyrexie, choc et mort dans le cas de la fièvre typhoïde (I78, 258, 15^b). Parmi les

activités toxiques étudiées nous citerons encore un effet inflammatoire

au niveau de la peau (178), des cas de sensibilisation à l'histamine (17), la production de lésions allergiques du derme (réaction de Schwartzman) ou

d'autres tissus (178), un effet d'agglutination et de fragilisation des cellules sanguines, notamment des plaquettes, que l'on rapproche de l'effet de gélification du lysat de Limulus largement utilisé actuellement pour détecter et doser les endotoxines (113, 221, 15).

Quoique l'on puisse obtenir des anticorps dirigés contre les lipopolyosides incomplets de mutants rough ou contre le lipide A (293, 33,

15^h), le polyoside 0 joue un rôle antigénique essentiel et permet la distinction de très nombreuses classes sérologiques chez les bactéries gram-négatives (156, 130, 123, 51, 208). Nous remarquerons que, si la

réponse immunologique est principalement dirigée contre des motifs antigéniques du polyoside 0, il semble toutefois que la présence de matériel protéique

augmente le pouvoir immunogène (156, I78). En fait, le pouvoir protecteur chez la souris d'immunsérums préparés contre S. typhimurixim s'est montré associé à la fois à la présence d'anticorps dirigés contre les antigènes 0 et à celle d'anticorps contre d'autres antigènes de la surface bactérienne (172).

Par ailleurs, de nombreux travaux sont consacrés à la stimulation de l'immu­

nité non spécifique par les extraits lipopolyosidiques (178, 287, 98, U5, 92), à leur rôle possible dans la libération d'interféron par les cellules

eucaryotes (233, 178) ainsi qu'à leur effet d'induction d'une activité cytotoxique vis-à-vis de tumeurs (178, I86, 7), cependant que certains auteurs envisagent l'intervention de lipopolyosides dans la stimulation de la formation de t\imeurs (207).

Les divers sites lipopolyosidiques peuvent constituer des structures réceptrices de bactériophages d'une grande spécificité (217, IU8, 1U9; nos résultats ).

Le lipopolyoside semble jouer un rôle dans la configuration

de plusieurs protéines de la membrane externe, probablement par le lipide A.

Il s'est révélé nécessaire à l'expression in vitro par ces protéines d'une activité réceptrice vis-à-vis de bactériophages ou vis-à-vis de la conjugaison

(276, 52, 2h8, 2l+T, 170).

Par contre, le polyoside 0 des bactéries smooth est susceptible de masquer des sites protéiques actifs tels que des récepteurs de bactério­

phages et de bactériocines (ce point a été abordé dans notre travail), de réduire l'expression des propriétés immunogènes de la lipoprotéine "de Braun"

(3^) ou de gêner la conjugaison (282).

Une influence de la composition du lipopolyoside sur la nature et la fluidité des phospholipides dans la membrane externe a été décrite (68, 225).

Selon plusieurs observations faites chez E. coli et S. typhimurium, l'altération profonde du lipopolyoside dans les mutants de chimiotypes Rd et surtout Re - le lipopolyoside de ces derniers ne contenant que

cétodésoxyoctonate et lipide A - résulte en une augmentation du rapport phospholipides/protéines de la membrane externe avec la diminution ou la disparition de certaines protéines et l'apparition de zones de double-couche phospholipidique (257, 159» 2l8, 112, li+l). Des substances hydrophobes

(antibiotiques, colorants, détergents, ...) normalement exclues par la membrane externe peuvent pénétrer dans ces mutants, alors que des enzymes

périplasmiques sont libérées dans le milieu extérieur (279, 20U, 3, 188, k3, 16U). Il semblerait aussi qu'un lipopolyoside incomplet soit présent en un plus grand nombre de motifs par unité de surface bactérienne que le lipopolyoside complet correspondant (95b).

Fig. 6 : MODELE DE LA STRUCTURE DU LIPOPOLYOSIDE EXTRAIT DE Sh. FLEXNERI F6S (108).

jMotifs

11 ipi cliques .

Motif polyosidique ’ i

I(9.000 daltons)

sous-unité ou unité chimique (25.000 daltons; 42 nm/1 nm)

30.

3. - LE LIPOPOLYOSIDE DE SHIGELLA FLEXNERI.

3>l - Structure physico-chimique.

Hannecart-Pokorni a réalisé une étude physico-chimique approfondie du lipopolyoside extrait de Sh. flexneri f6S par l'acide trichloracétique ou par un mélange phénol-eau (208, 108 ). A l'examen au microscope

électronique celui-ci se présente sous la forme de longs filaments d'épaisseur variable (de 5 à 30 nm) et dont la masse est comprise .entre

10 et i+5 millions de daltons. Cet édifice macromoléc\ilaire résiilte de l'association de sous-unités de 25-000 daltons que l'on peut considérer comme représentant l'unité chimique du lipopolyoside. Elles seraient reliées entre elles par les interactions hydrophobes de leur partie

lipidique ainsi que par des liens ché-lateurs entre groupements carboxylate et cations Ca^"*" ou Mg"*”*^. Dissociées par l'action du désoxycholate de sodiiim, elles semblent avoir la forme d'un ellipsoïde de révolution allongé ou

d'un cylindre de U2 nm de long sur 1 nm de diamètre (fig. 6 ).

D'après les résultats de l'hydrolyse par l'acide acétique à 10^

et en accord avec les données recueillies chez Salmonella, l'on peut proposer que la structure de 25-000 daltons comporte deux chaînes

polyosidiques longues de 17 nm liées à des motifs lipidiques qui seraient unis entre e\ix ( 183, 108)-

3-2 - • Structure chimique du polyoside 0.

Les polyosides correspondant aux antigènes 0 des différents séro­

types de Sh. flexneri sont construits sur la base d'une même unité répétitive contenant de la N-acétylglucosamine et du rhamnose, dont la structure serait la suivante :

- 3)- /3 - D - GlcNAc (l-2) - n - L - Rha (1-2) - n - L - Rha (l-3) - a - L - Rha - (1 les sucres sont sous la forme pyranose (152, 133)-

Le polyoside 0 de la variante Y de Sh- flexneri résulte de la polymérisation de ces unités de base. Les sérotypes et la variante X se différencient par la présence d'embranchements glucosyle ou de groupements 0-acétyle en diverses positions. Le tableau ,4 réunit les séquences

structurales immunodominantes proposées poizr chacun des antigènes de type et de groupe. C'est ainsi que le polyoside 0 de la souche Sh. flexneri F6S, sérotype 5b, qui fait l'objet de notre étude, se compose vraisemblablement

Tableau 1+ : Séquences structurales immunodominantes des antigènes 0 de Shigella flexneri proposées par divers auteurs.

Antigène séquence immunodominante Références

Type I Glc - a 1,3 - GlcNAc (251)

Glc - 0. 1,4 - GlcNAc (255)

II Glc - a 1,4 - Rha (251 )

III (2 - 0 - Ac - Rha) - a 1,3 - GlcNAc (T34h. 205) (2 - 0 - Ac - Glc) - a 1,2 - Rha (255)

IV Glc - a 1 ,4 - GlcNAc (251 )

Glc - a 1,6 - GlcNAc (255)

V Glc - a 1,3 - Rha - a 1,3 - Rha (255,134)

Groupe H Rha - a 1,3 - Rha (205)

Rha - a 1,3 - Rha - P 1,3 - GlcNAc (255,133)

6 2 - 0 - Ac - Rha (l34b, 205)

7,8 Glc - a 1,3 - Rha - a 1,2 - Rha (134,251)

Glc = glucose; Rha = rhamnose; GlcNAc = N - acétylglucosamine;

Ac = groupement acétyle.

32.

d'unités répétitives de structure :

3) - P - D - GlcNAc(l-2) - a - L - Rha (1-2) -a - L - Rha (1-3) - a - L - Rha (1 -

3 3

I I

1 1

a - D - Glc a - D - Glc

groupe 7,8 type V

les glucoses sont également sous la forme pyranose; il se peut que la glucosylation ne soit pas totale le long de la chaîne polyosidique (i3U ).

La biosynthèse du polyoside 0 de Sh, flexneri pourrait se dérouler de la même manière que chez Salmonella. Dans une fraction lipidique de Sh. flexneri on a identifié un intermédiaire undécaprénylphosphate et une fonction accepteur de glucose en présence d'une polyprénylphosphoglucose synthétase extraite de l'enveloppe bactérienne (121, 70 ); l'étude de

mutations au niveau de ce système a fait supposer en outre l'existence d'une transférase capable d'effectuer le transfert -ultérieur du résidu glucose aux unités polyosidiques ( 70 ).

Nous remarquerons qu'il semblerait que la présence de glucoses dans le polyoside 0 de Sh. flexneri augmente la capacité de multiplication de ces bactéries dans les tissus animaux (l35, 205b).

3.3 - Structure chimique du core.

Johnston et coll. {^2k) ont partiellement déterminé la structure du core du lipopolyoside d'une souche dérivée de Sh. flexneri sérotype 4b.

Ce core contient de la N-acétylglucosamine, du glucose, du galactose, du L-glycéro-D-mannoheptose, du cétodésoxyoctonate, du phosphate et de 1'éthanolamine dans la disposition probable :

D

a - D - Glc 1

a - D - Glc 1

il ■ ^{P, EtR}

GlcNAc (1-4) - D - Gai (l-3) - D - Glc - (LD - Hep)^ - (KDO)^

les hexoses seraient sous la forme pyranose (255, 290).

Johnston et coll. (124) ont isolé, chez divers sérotypes de

Sh. flexneri, des mutants correspondant à 3 des étapes de la biosynthèse du core. La composition en sucres des lipopolyosides de ces mutants s'accorde avec la structure ci-dessus.

- PUT DU TRAVAIL.

Les propriétés biologiques du lipopolyoside et son influence

directe ou indirecte sur l'architecture et le fonctionnement de la membrane externe des bactéries gram-négatives se sont révélées extrêmement importantes Ainsi, le lipopolyoside intervient de façon essentielle dans le potentiel de surface de la bactérie et le fait que le motif lipopolyosidique soit complet ou incomplet modifie notablement ce potentiel (tableau 3 ; nos résultats). Par ailleurs, le lipopolyoside conditionne en partie la nature et le nombre des protéines dans la membrane externe. Il semble aussi inter­

venir dans la composition en phospholipides. Les interactions entre les divers constituants de la membrane externe sont nombreuses, elles peuvent influencer la réactivité de ceux-ci et peuvent causer des problèmes lors de leur isolement. C'est ainsi que, par exemple, si le lipopolyoside ne peut constituer lui-même un vaccin à cause de son caractère toxique, son étude est néanmoins indispensable à la mise au point d'extraits vaccinants.

La connaissance de la structure du lipopolyoside et de la façon dont celle-ci se construit sous da direction du génome bactérien est donc essentielle à une bonne compréhension des propriétés de la membrane externe et des autres éléments qui la composent. Chez Salmonella, les recherches dans ce domaine ont commencé il y a plusieurs décades et les résultats recueillis ont permis de réaliser l'image que nous avons présentée plus haut. Les données sont beaucoup plus fragmentaires dans les autres genres bactériens mais commencent à s'accumuler,notamment chez E. coli. Le genre Shigella, proche des genres Salmonella et Escherichia, se compose de pathogènes intestinaux susceptibles de poser des problèmes épidémiques.

Si l'incidence des souches de Shigella est inférieure à celle des souches de Salmonella parmi les souches isolées de cas d'infection intestinale humaine en Belgique, elle est supérieure à celle des autres genres d'Entérobactéries (En 1977» le Dr. Ghysels de l'Institut d'Hygiène et d 'Epidémiologie a comptabilisé G.'J&k souches de Salmonella, I+85 souches de Shigella et moins de 60 souches dans chacun de plusieurs autres genres ).

Nous basant sur les observations déjà faites à l'institut par Beiamer Beumer-Jochmans, Dekegel, Dirkx et Hannecart-Pokorni concernant les formes S et R de Sh. flexneri, nous nous sommes proposé d'étudier des gènes

impliqués dans la biosynthèse du lipopolyoside de la souche S Sh. flexneri F6s (formule antigénique V : 7»8) et de déterminer les étapes de la

34.

biosynthèse du core de ce lipopolyoside.

La grande spécificité des interactions entre les bactériophages et leurs récepteurs à la surface des bactéries fait de ceux-ci un excellent outil pour l'étude de cette surface. Nous avons fréquenment utilisé cet outil.

4.1 - Réceptexirs de bactériophages sur le lipopolyoside. Récepteur du bactériophage PI chez Sh. flexneri F6S.

L'agression d'une bactérie par un bactériophage débute par l'adsorption de la particule virale à la surface de cette bactérie.

Quoique les modes d'adsorption de phages de dimensions et de structure différentes doivent différer, une spécificité élevée semble d'ordre général

(l48). Déjà dans les premiers temps de 1'étude des bactériophages, l'on a reconnu que le phénomène complexe de l'adsorption était spécifique du couple bactérie-bactériophage et dépendait du milieu environnant (l, 56, l48).

Ainsi,le rôle des cations dans le milieu s'est révélé très important. D'après l'effet des cations et la spécificité de cet effet, l'on peut distinguer deux étapes dans l'adsorption d'un phage tel que Tl ou t4 : la première, relativement peu spécifique, serait de nature électrostatique et réversible, la seconde consisterait en une véritable réaction chimique entre le phage et la paroi bactérienne, donc serait essentiellement spécifique et irréversi­

ble. Lors de cette seconde étape, des cations tels que Ca"*"*” pourraient jouer un rôle de cofacteurs enzymatiques (56, 213). Cette seconde étape couvre elle-même probablement une série d'événements successifs qui ne sont pas encore vraiment élucidés (l49).

L'existence de récepteurs spécifiques, que l'on pouvait

extraire de la paroi des bactéries sensibles a également été établie rapide­

ment (voir référence 56 p. 6t-72; 25, 97, 285, l48). En fait,les phages s'adsorbent sur des structures de surface très diverses, telles que les flagelles, les pili, les capsules, les lipopolyosides, les complexes acide teichoïque - peptidoglycane et les protéines (l48). Cependant, l'architecture moléculaire des sites récepteurs reste inconnue, même si l'on a pu rapprocher la spécificité d'adsorption et des éléments de la

^ de ces sites.

structure de la macromolecule porteusëV^Lorsqu'il s'agit de récepteurs lipopolyosidiques, la spécificité semble liée à la configuration spatiale d'un ou plusieurs sucres et/ou d'un lien osidique. Par exemple, les phages El5 et g34l attaquent Salmonella anatum dont le polyoside 0 est formé par