Fig. 7. ~ Fixation du phage Plfvircl sur les bactéries f680 comparée a la fixation sur les bactéries f6S et f60. Fixation apres 10 minutes a 3T°C, exprimée en pourcentage de phage fixé mesuré par centrifugation.
(a) : dans des solutions de maléate de calcium de concentrations molaires croissantes. (1) : souche F6S. (2) : souche F680. (3) : souche f60.
(b) : dans des solutions de maléate de sodium de concentrations molaires croissantes. (1): souche f6s. (2) souche f680. (3) : souche f60.
68.
observe parallèlement à l'apparition de la sensibilité à l'action
lytique des phages T3, T^+, T5 ou TT la présence d'une activité inhibitrice vis-à-vis de ces phages lorsque l'on examine des extraits de la paroi de ces
bactéries (96). L'absorption de Tl sur les constituants isolés de la paroi reste réversible (285, 105).
2°.
Phage Plkcvir :Avec une efficacité d'étalement globale de 10 ^ à 10 ^ par rapport à E. coli K12, Plkcvir forme sur F680 des plages de 2 types : des plages claires, relativement grandes, et des plages très troubles, plus petites, généralement mieux visibles après 36 à 48 h d'incubation à 3T°C. L'aspect trouble se manifeste davantage sur milieu LANa que sur milieu LA et le rapport des efficacités d'étalement sur les deux milieux est d'environ 1/8. La proportion plages claires/plages troubles vaut environ
1/300. Le caractère clair ou trouble est héréditaire et les phages corres pondants ont pu être purifiés et entretenus s\ir la souche F680; ils sont désignés par Plfvircl et Pifvirtu. Dans le tableau l4 nous avons rassemblé les sensibilités de plusieurs souches dérivées de Sh. flexneri F6S et de quelques souches d'E. coli B et Kl2 a\ix phages Plkcvir, Plfvircl et Pifvirtu. Parmi toutes ces souches bactériennes,seules F69 et F639, de même schéma de sensibilité aux phages T que F680, et F60 font la distinction en plages claires et plages troubles et se montrent plus sensibles à Plfvircl et Pifvirtu qu'à Plkcvir. Les particules de ces trois souches de phages, vues au microscope électronique, sont identiques; elles sont sérologiquement apparentées, elles se comportent de même sur E. coli Kl2 803 lysogène pour PI et sur E. coÜK12 803 résistante à PI; enfin, nous avons pu montrer la présence des particules "claires" et "troubles" dans le stock de Plkcvir avant multiplication dans les bactéries F680 (Chapitre 2 en 2.1.3.4°).
Il est donc vraisemblable qu'il s'agisse de mutants d'hôte de Plkcvir.
En bouillon LB, LBCa ou LBNaCa, l'on n'obtient pas de fixation importante de Plkcvir sur F68O (3 à T ^ avec moins de 5^ âe phage fixé irréversiblement), alors que des pourcentages de fixation irréversible d'environ 98^ et 60^ s'observent respectivement sur F6S et son mutant R F60 en bouillon LBNaCa.
D'autre part, nous avons étudié l'absorption de Plfvircl s\ar f680, parallèlement à son absorption sur F6S et sur f60, dans différentes conditions ioniques : le pourcentage de fixation en maléate de sodium et en maléate de
et d'Escherichia coli.
Souche Plkcvir PIfvircl Pifvirtu
eop plages eop plages eop plages
Sh. flexneri :
f6s 1 claires 1 claires 1 claires
f6i 1 10~^ claires 10-^ claires 10-^ claires
F6I4 1 claires 1 claires 1 claires
f6i 1 claires 1 claires 1 claires
f680
f69 10~^ claires + troubles 1 claires 10-^ troubles
F639
f6o 10~^ claires + troubles 1 claires 1 troubles
E. coli :
B 10-2 claires 10-2 claires 10“2 claires
Kl2 C600 2 claires 10-2 claires 10-2 claires
K12 803(5t) 2 claires 1 claires 1 claires
K12 C600 (Pi) 1 +
0
1 très petites i 10-3 très petites CO 10
+ 1 très petites K12 803 (3t)(Pl) 1+0
1 très petites ± 10-^ très petites 10
+ 1 très petites Kl 2 C6OO/PI <10-8 <10-8 <10 ^ K12 803 (*)/P1 <10-8 <10-8eop = efficacité d'étalement, calculée par rapport à Sh, flexneri F6S.
(*) : La souche 803 a perdu la spécificité d'hôte d'E. coli K12 (système de restriction - modification K) (291). Les phages sont titrés en double couche sur milieu LMa.
70.
calcitmi à differentes concentrations a été mesurée par centrifugation. Comme le montre la figure 7» les concentrations de Na"*" de l'ordre de 0,2 M ou supérieures semblent inhiber l'adsorption du phage sur f680 et sur F60. Dirkx (56) attribue cet effet des cations Na"*" sur le phage H Sh - de com portement semblable â PJkcvir - à un possible empêchement stérique dû à la concentration élevée de ces cations au niveau de la surface des bactéries R, dont la charge négative est plus élevée que chez les bactéries S. En maléate de calcium 0,06 M la fixation de Plfvircl sur les bactéries F680 s'élève
à
90%
(88^ irréversiblement). En revanche, dans les mêmes conditions, Plkcvir se fixe dans la proportion de 95^ sur F6S (92^ irréversiblement), 97^ sur le mutant R f60{95%
irréversiblement) mais seulement l6^ sur f680 et ce dernier chiffre comprend 11^ de particules entraînées par les bactéries lors de la centrifugation mais non fixées irréversiblement.Nous n'avons que peu étudié l'adsorption de Pifvirtu, difficile à manipuler. En bouillon LB, LBCa ou LBNaCa, l'on n'observe qu'environ 5^ de fixation sur F680 après centrifugation. En maléate de calcium de concen tration 0,00i+ M à 0,1 H, l'on obtient environ 30^ d'adsorption. Il est donc possible que l'influence marquée de la concentration en Na"*^ sur le dévelop pement en plages troubles se produise au niveau de la fixation.
Alors que l'étude des conditions ioniques nécessaires à l'adsorption du phage Plfvircl met en évidence le caractère R de la souche f680, le faible taux d'adsorption du phage Plkcvir, dans le milieu 0,06 M en Ca"*”*" comme en bouillon, montre qu'il y a chez cette souche variante, outre un changement du potentiel de surface, une altération réelle de la capacité réceptrice pour le phage Plkcvir, la souche restant sensible à un mutant d'hôte de ce phage.
^ .2.h -
Caractère "part-rough".Les résiiltats de l'étude de l'agglutination des souches de sensi bilité élargie aux phages T dérivées de F6S par les antisérums spécifiques de Sh. flexneri montrent une diminution de l'agglutinabilité par les sérums du type V et du groupe
7,8,
qui .définissent le sérotype 5b de la souche F6S (tableaux 8 et 15). Seules les souches dérivées dont le schéma de sensibilité aux phages T est T2T6T1TÎ+T5 font preuve d'un comportement sérologique iden tique à celui de la souche sauvage. Toutefois, tous les variants forment des colonies aussi lisses que celles de F6s et le comportement R lors de la culture en bouillon ne s'affirme pas clairement pour certains d'entre e\ax.Souche Aspect Antisêr\mis spécifiques de Sh. flexneri (2) NaCl 2% Trypaflavine S ou R U ; 1 2 3 1+ 5 X Y t -, (3) aggl. 1/500 (2) F6S S - + - - ++ + +++ - > 6 j. > 6 j. -f6ii S - R - — - - ++ ++ - 10 h 15 h +++ f6o4 R - - - - + + + 9 h 1 J +++ f6U S - + - - +++ +++ - > 6 j > 6 j -f6i R - - - - + + + 4 h 13 h +++ F698 R - - + + + + + h h 10 h +++ f68o R - - - - + + + 3 j j +++ f69 R - - - - + - - U h 10 h +++ F639 R - - - + + + — 8 h 1 j +++ f6o R + + + + + + + <1 h 8 h +++
(1) : S = dépôt ramassé en bouton; R = dépôt large formé d'agrégats-; S~R = aspect intermédiaire. (2) : - = pas d'agglutination; + = agglutination lente et seulement visible sous la loupe
(hx)-,
++ = agglutination non immédiate mais bien visible; +++ = agglutination immédiate en gros agrégats. L'agglutination est observée sur une lame de microscopie, en mélangeant 1 goutte de suspension de bactéries en NaCl
9 %o et ^
goutte de sérum; la solution de trypaflavine se fait en NaCl 7,5^o*(3) : délai (en heures ou en jours) d'apparition d'agrégats visibles à l'oeil nu dans la suspension des bactéries en NaCl
2%
incubée à 50°C.(U) : sédimentation à 50°C des agrégats de bactéries, exprimée par le temps (en heures ou en jours) après lequel l'on observe une chute de la densité optique du surnageant jusqu'au cinquième de la vale\ir initiale.
72.
Nous avons encore examiné deux autres critères d'attribution d'un caractère R : l'auto-agglutination en solution de NaCl à
2%
(56,5)et en solution de trypaflavine 1/500 (202)* L'observation du sédiment de la culture en bouillon LB et l'étude de l'auto-agglutination en NaCl
2%
montrent que les variants ont^pour la plupart^un comportement intermédiaire entre celui des souches S, par exemple F6S, et celui d'une souche R telle que F60 (tableau 15 ). Elles sont, en effet, à l'exception de la souche F6U, agglutinées en NaCl
2%
après des délais plus ou moins longs. Il n'y a pas d'identité dans le comportement des trois souches sensibles à tous les phages T, nous ne pouvons donc déduire de ces essais une relation entre un degré de transformation R, évalué par le délai d'apparition de l'auto agglutination en NaCl 2^, et le schéma de sensibilité aux phages.L'agglutination en trypaflavine, qui donne une réponse moins nuancée, con firme le caractère R.
Comme nous avons fait subir plusieurs réisolements successifs aux souches types de sensibilité élargie aux phages T sans que la dissociation en formes S et R s'y soit manifestée, il semble que nous devions leur attri buer en fait un caractère partiellement R, l'exception de la
souche F6U. De\ix types de souches partiellement R ont été reconnus chez Salmonella. Les souches "part-rough" contiennent un mélange de chaînes lipopolyosidiques complètes et incomplètes à la suite d'une déficience non absolue dans l'une des étapes de la biosynthèse. Les souches "semi-rough" contiennent des chaînes lipopolyosidiques formées du lipide A, du polyoside de base (core) et d'une seule unité répétitive spécifique 0 au lieu de huit ou davantage chez les souches S (267- L'apparition de plusieurs schémas de sensibilité aux phages chez les souches dérivées de Sh. flexneri f6s fait penser à des souches "part-rough".
1.3- Caractère général du phénomène dans l'espèce Shigella flexneri. Le schéma de sensibilité aiix phages T et Lisbonne de plusieurs souches S appartenant aux différents sérotypes de Shigella flexneri (la, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, Ua, 4b, 5a, 5"b et les variantes X et Y) a été déterminé. La sensibilité aux phages T2, T6 et la résistance aux phages T3, t4, TT sont constantes pour l'ensemble des souches. La sensibilité aux phages Tl, T5 et aux phages Lisbonne varie indépendamment du sérotype.
Nous avons réalisé l'infection par Plkcvir, à forte multiplicité, des souches suivantes, sensibles aux phages Lisbonne :
1° 366/54 sérotype la (I : 4) sensible à T2, T6, Tl, T5
2° F263 sérotype 2a (II : 3,4) sensible à T2, T6, T5
3° 351/66 sérotype C\J (II : 7,8) sensible à T2, T6
4° F109 sérotype 5b (V : 7,8) sensible à T2, T6, T5.
Dans tous les cas, nous avons pu isoler des survivants plus ou moins rough présentant les mêmes schémas de sensibilité étendue aux phages T que ceiix observés chez les survivants dérivés de la souche F6S (sérotype 5t).
2. - ROLE DU PHAGE PI DANS L'APPARITION DES NOUVELLES PROPRIETES DE SURFACE CHEZ SHIGELLA FLEXNERI F6S.
2.1 - Recherche d'une relation entre l'apparition de sensibilités aux phases T et lin apport génétique par le phage PI dans la bactérie F6S.
Nous posant la question de la modification éventuelle du génotype de la hactérie F6S par le génome du phage PI, nous avons envisagé les phéno mènes de transduction 1/ (20, 63), de conversion 1/ (20, 115) j de l'élimination
d'un plasmide, porteur de déterminants antigéniques et/ou d'antagonisme vis- à-vis des phages, ou de la recombinaison avec un tel plasmide (196, 120, U,
IU2, 19, 226, 44, 176, 272, 283, 10). Une série d'expériences visant à mettre en évidence l'intervention de ces phénomènes dans l'acquisition des nouvelles propriétés de surface par Sh. flexneri F6S, où nous avons caractérisé la
surface des bactéries par le schéma de sensibilité aux phages T, ont donné les résultats suivants.
2.1.1 - Infection de F6S par Plkcvir régénéré sur f6S.
L'apparition chez F6S des nouvelles sensibilités aux phages T s'observe aussi lors de l'infection par le phage H F6S, lequel est propagé sur la souche F6S elle-même. En outre, nous avons vérifié que l'infection de F6S par du phage Plkcvir régénéré sur F6S (en deux propagations successives) donnait le même phénomène et avec approximativement la même fréquence que l'infection par le phage régénéré sur E. coli Kl2.
La modification des propriétés réceptrices pour les phages après l'infection de F6S par PI ne résulte donc pas essentiellement d'une
transduction.
1/ - Transduction : transfert à une bactérie réceptrice de gènes de la bactérie hôte sur laquelle le phage a été propagé, gènes emportés par quelques particules virales exceptionnelles.
- Conversion ; un ou des gène(s) présent(s) dans chaque particule virale intervien(nen)t dans la détermination de propriétés bactériennes, par exemple les propriétés antigéniques.
2.1.2 - Lysogénisation de F6S par PI.
Plkcvir est un phage virulent. Il donne cependant facilement
lieu à une lysogénisation atortive (nU) mais ce caractère "porteur de phage", chez F6S, est perdu par dilutions successives et n'est pas lié à la présence
de nouvelles sensibilités aux phages T.
Aucun prophage PI n'a pu être mis en évidence chez les souches dérivées types des différents schémas de sensibilité aux phages T apparus chez F6S après l'infection par Plkcvir, H Sh ou H F6s : ces souches ne sont pas immunes vis-à-vis de PI et aucune production de phage n'a été observée sur les souches indicatrices Sh. flexneri F6S, Sh. dysenteriae ShPB ou E. coli 803; l'on n'y observe pas non plus la restriction de Tl, T3, TT associée à la présence d'un prophage PI (ii+1;); seule la présence d'un prophage cryptique ne peut être écartée (250).
La sensibilité aux phages T de ^0 souches F6S lysogénisées indépendamment par Plk est restée identique à celle de la souche F6S originale; or, au moins l'apparition des sensibilités à TU et T5, non restreints par PI, ne pouvait nous échapper. D'autre part, l'infection de F6S par Plk à la multiplicité de phages par bactérie a permis, pour
—6
une survie de U.10 , d'obtenir à la fois des variants de sensibilité aux T non lysogènes pour PI - selon les critères utilisés ci-dessus - et des sur vivants faiblement sensibles à Tl et sensibles à T5, parfois à t4, qui se sont révélés lysogènes pour PI.
Les processus de lysogénisation et de modification des propriétés réceptrices pour les phages T paraissent donc indépendants.
2.1.3 - •
1°. Essai de transférer des résistances aux phages T de F6s à un variant : Deux essais de transfert, par culture mixte, d'un plasmide
hypothétique porteur de déterminants de résistance a\ax phages T de F6s au variant f639s sensible à tous les phages T, ont été négatifs.
2°. Recherche d'une production de phages ou de bactériocines par F6s : Nous avions quelque raison d'attendre la présence de prophages de conversion chez f6s puisque l'intervention de tels prophages dans la détermination des propriétés antigéniques 0 de Sh. flexneri a été décrite dans plusieurs cas et notamment pour les antigènes de type V et de groupe 7,8 caractéristiques du sérotype 5k auquel appartient la souche f6S (9'1»90).
76.
Nous avons recherché la production de phages ou de hactériocines par f6S, par les souches variantes types des différents schémas de sensibi lité aux T et par neuf souches homologues obtenues sans infection virale
(voir plus loin en 2.1.4). Les souches suivantes ont servi de souches indi catrices : E. coli B, E. coli Kl2, E. coli 803, Sh. dysenteriae ShPB,
Sh. sonnei phase II, une souche Sh. newcastle, les souches représentatives des sérotypes la, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, X et Y de Sh. flexneri
(Colindale), Sh. flexneri F6S et son variant F680. Nous n'avons trouvé aucune bactériocine mais un phage, désigné par Fx, présent en faible quantité dans des surnageants de cultures. La souche F6S et toutes les souches dérivées de F6S que nous avons étudiées libèrent le phage Fx, qui lyse les souches représentatives des sérotypes la, 2a, 2b, 4a et Y de
Sh. flexneri. Le spectre d'activité, l'aspect des plages et la morphologie, observée au microscope électronique, sont identiques poiir les phages
produits par F6S et par la souche dérivée F680. D'autre part, les souches la et 2b citées ci-dessus sont sensibles à Fx et ne se montrent pas lyso- gènes, alors que l'infection par Plkcvir y fait aussi apparaître des variants de sensibilité étendue aux phages T. Enfin, lysogénisée par Fx, la souche la garde inchangés son schéma de sensibilité aux phages T et ses propriétés sérologiques. Le prophage Fx ne joue donc pas de rôle dans l'apparition des propriétés réceptrices pour Tl, T3, T4, T5 , T7.
3°. Effet d'un choc thermique sur la sensibilité de f6S aux phages T :
Un choc thermique de 2 min à 56°C fait apparaître chez des staphy locoques la sensibilité au phage 18T par induction d'un prophage bloquant
(6). Un tel choc thermique augmente notablement la sensibilité d'E. coli B au phage h"*" mais ne modifie aucunement la sensibilité de f6S aux phages T. 4°. Recherche de recombinants de PI avec le plasmide hypothétique :
Nous avons recherché la manifestation de recombinants de PI avec un plasmide, qui serait présent dans F6S et perdu dans F680, ou encore avec un fragment de Plkcvir, qui se serait établi dans f680 et serait absent dans f6S. Nous avons comparé les effets de la multiplication dans les bactéries F6S et dans les bactéries F680 sur les phages Plk, Plkc et Plkcvir. Nous pouvions étudier les caractères suivants sur plusieurs milliers de plages isolées : l'aspect des plages sur les souches W1,C600
et 803 d'E. coli Kl2 comme sur Sh. flexneri F6S et F680, la sensibilité à la restriction par Kl2 (29I) et la sensibilité à l'immunité conférée par -un prophage PI. Les stocks des phages Plk et Plkc propagés sur F6S
et sur f680 ne se montrent pas différents des stocks originaux. Plkcvir n'est pas davantage affecté par la propagation sur f6S mais sa multipli cation dans les bactéries F680 fait apparaître deux nouveaux phages qui forment sur cette souche l'un de grandes plages claires, l'autre des plages troubles. En fait, ces nouveaiix phages se comportent comme des mutants d'hôte de Plkcvir (voir chapitre 1 en 1.2.3) et nous avons pu montrer qu'ils préexistaient dans les stocks de Plkcvir obtenus sur E. coli K12 W1. En effet, utilisant la technique de l'examen de plages isolées par repiquage au cure-dent et test sur une boîte portant un tapis de bactéries F680, nous avons pu, après 5 isolements successifs toujours siir K12 W1 , obtenir des plages pures sur K12 W1 contenant des particules toutes capables de former soit des plages claires, soit des plages troubles lorsqu'on les étale sur f680. Des recombinants de PI avec un plasmide éven tuel porté par F6S n'ont donc pas été mis en évidence, pas plus d'ailleurs que des recombinants avec un plasmide éventuel ou un prophage cryptique porté par le variant f680.
5°. Réversion de la souche variante F680 :
La sélection de bactéries f680 résistantes à la colicine Lisbonne, à un mélange des phages Tl et T3 ou à un mélange des phages T5 et T7 a
permis d'obtenir des souches chez lesquelles l'ensemble des propriétés de surface de la souche F6S sont réapparues : résistance aux phages Tl, T5, T3, Ti+, T7 (possibilité d'inhibition de la croissance bactérienne par T5 ), sensibilité complète aux phages Lisbonne, caractère S et formule sérolo gique V:7>8. La possibilité d'\me réversion élimine l'hypothèse que l'apparition du comportement R et des nouvelles sensibilités aux phages chez F680 résulte de la perte d'une séquence nucléotidique.
2.1.U - Obtention des modifications de la sensibilité aux phages T en l'absence d'infection virale.
Dans différentes conditions, qui ne faisaient intervenir aucune infection par le phage, nous avons pu obtenir des souches dérivées de
Sh. flexneri F6S présentant des schémas de sensibilité étendue aux phages T. L'irradiation UV de cultures de F6S a permis d'isoler une souche sensible à Tl, T5 et \me souche sensible à Tl, T5, T4 (voir en 1.1,tableau 8).
78-La majorité des colonies formées par une culture de f6s après
une incuLation d'un mois à 3T°C en bouillon LB et les 12 colonies résistantes à la streptomycine q.ue nous avons examinées se sont révélées sensibles à Tl, T5, t4 (voir en 1.1, tableau 8).
Sur milieu minimimi complémenté en nicotinamide et en acide
aspartique, F6S est capable de se développer dans la proportion de 1 pour 10 germes ensemencés. La culture de F6S sur ce milieu a permis d'isoler (avec une fréquence approximative de 15^) des souches présentant les schémas de sensibilité aux phages T suivants :
T2TÔT1T5, T2T6T1T5T4, T2T6T1T5T4tT,T2T6T1T5TTT3, T2T6T1T5T4TTT3 ,
soit tous les schémas de sensibilité obtenus lors de l'infection par le phage PI.
Le mutant F60, de schéma de sensibilité T2T6t1T5, est un mutant spontané de f6s, isolé par électrophorèse ( 24).
Nous avons constaté une très grande similitude entre les souches décrites ici et les souches homologues obtenues par l'action de PI en ce qui concerne l'aspect S ou R des cultures ainsi que la sensibilité aux phages Lisbonne et aux colicines Lisbonne, M, El, E2, E3.
Par conséquent, l'infection par PI n'est pas indispensable à l'apparition des nouvelles propriétés de surface, telles l'extension de la sensibilité aux phages T, chez Sh. flexneri F6S.
2.2- Test de fluctuation statistique
La diminution générale de la sensibilité à PI et les autres faits expérimentaux que nous avons pu observer sont en accord avec l'hypothèse de la sélection par ce phage de mutants spontanés de Sh. flexneri F6S dont la sensibilité aux phages T s'est etendue et dont la membrane externe s'est modifiée.
Les deux schémas T1T5T4 et T1T5T4tT, qui ne se prêtent pas d'une
façon évidente à la sélection par PI, apparaissent plus rarement que les autres lors des expériences d'infection. A ce sujet, nous remarquerons que l'enrichis sement d'une culture de bactéries F6S en variants T1T5T4T7 à la suite de l'in fection par PI pourrait peut-être résulter d'une légère différence d'adsorption.
telle que nous l'avons observée chez la souche f61. Nous ne savons pas sur quelle hase se ferait la sélection de variants T1T5Ti+...peut-être serait-elle liée à la différence de vitesse de croissance de ce type de variant par rapport à F6s, différence visible au niveau de la taille des colonies et que l'on peut traduire par la comparaison des temps de génération en bouillon LB à 3T°C sans agitation : 20 min pour f6S et 28 min pour la souche dérivée F6U.
Nous soulignerons encore le parallélisme entre une mortalité élevée des bactéries F6S et un bon rendement en variants, sans qu'il y ait pour autant une relation de proportionalité (voir expérience de fluctuation n° I et tableau l6 ). Au cours de 9 expériences où la survie était supérieure à
10 , un maximum de 5^ de souches survivantes de sensibilité élargie a\ix phages T a été observé, alors que le rendement atteignait 30 à 70^ lorsque la survie n'était que d'environ 10 ^ ou inférieure. De même, les réinfections