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Texte intégral

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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Dinsart, C. (1979). Expression du gène thyroglobuline dans la thyroïde: approche moléculaire d'une maladie congénitale (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire

Expression du Gène Thyroglobuline dans la Thyroïde : Approche Moléculaire d’une Maladie Congénitale

Mémoire présenté pour l'obtention du grade de Docteur en Sciences

L ^ ^

CHRISTIANE DINSART

(3)

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire

Expression du Gène Thyroglobuline dans la Thyroïde : Approche Moléculaire d'une Maladie Congénitale

Mémoire présenté pour l'obtention du grade de Docteur en Sciences

CHRISTIANE DINSART

19 7 9

(4)

Les techniques d'hybridation différentielle pourraient permettre la détection du défaut responsable de la mucoviscidose.

sur filtres primaire

(5)

Je tiens à remercier vivement Monsieur le Professeur

J.E. DUMONT pour l'accueil qu'il m'a réservé dans son laboratoire et l'intérêt constant qu'il a manifesté à l'évolution de ce tra­

vail .

J'ai eu la chance de bénéficier du savoir et de l'expérience de Mr. G. VASSART qui a guidé la progression de ce travail. Je lui dois un enrichissement intellectuel inestimable. Qu'il trou­

ve ici l'expression de ma profonde reconnaissance.

Une partie de ce travail est le résultat d'une collaboration étroite avec Mr. F. VAN VOORTHUIZEN (Amsterdam). Il m'est parti­

culièrement agréable de le remercier pour les échanges fructueux auxquels elle a abouti.

Mes remerciements s'adressent également à Mr A. BURNY pour ses conseilsavisés et pour la transcriptase inverse qu'il m'a aimablement fournie au début de ce travail.

Je remercie enfin Mme M.T. GUY de son aide précieuse lors des préparations du RNA messager de la thyroglobuline ainsi que Mme D. LEEMANS du soin qu'elle a apporté dans la dactylographie de ce mémoire.

Ce travail a été réalisé en grande partie grâce à une bourse de spécialisation de l'I.R.S.I.A. et s'est poursuivi sous contrat du Ministère de la Politique Scientifique (Actions Concertées).

-o-o-o-o-

(6)

Pages - INTRODUCTION

I. BIOSYNTHESE DES PROTEINES CHEZ LES EUCARYOTES ... 1

ji. Biosynthèse et structure des RNAs messagers d'eucaryotes ... 1

B. Traduction des mRNAs ... 6

II. CONTROLE DE LA SYNTHESE PROTEIQUE CHEZ LES EUCA­ RYOTES... 7

1. Contrôle au niveau de la transcription ... 8

2. Contrôle au niveau de la maturation des pré- mRNAs en mRNAs fonctionnels ... 9

3. Contrôle au niveau de la traduction ... 10

4. Défauts génétiques ... 12

III. MODELE EXPERIMENTAL ; BIOSYNTHESE DE LA THYROGLOBULINE DANS LA

thyroïde

... 14

1. La thyroïde ... 14

2. Structure et biosynthèse de la thyroglobuline ... 15

3. Contrôle de la synthèse protéique dans la thyroïde. 16 4. Défauts génétiques ... 17

IV. BUT DU TRAVAIL ET DEMARCHE EXPERIMENTALE... 18

- METHODES ... 20

I. TAMPONS ... 21

II. PREPARATION DES RNAs ... 23

1. Prélèvement et conservation des glandes ... 23

2. Homogénéisation ... 23

3. Isolement et purification du RNA messager 33S de la thyroglobuline ... 24

4. Préparation et analyse des polysomes de thyroïdes. 26 5. Isolement des RNAs d'origines diverses ... 29

6. Fractionnement subcellulaire de thyroïdes de chàure. 30

7. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en pré­

sence de formamide ... 31

(7)

globuline de boeuf ... 32

2. Synthèse d'un cDNA à partir de mRNA 33S de thyro­ globuline de chèvre ... 34

3. Mesure de la radioactivité ... 35

4. Mesure de la taille du cDNA thyroglobuline du gra­ dient alcalin de saccharose ... 35

5. Hybridations moléculaires ... 36

6. Mesure des hybrides cDNA-RNA et cDNA-DNA ... 37

7. Dénaturation thermique des hybrides cDNA-RNA... 39

8. Ajustement des courbes d'hybridation cDNA-RNA .... 39

IV. TRADUCTION DES RNAs DANS L'OOCYTE DE XENOPUS LAEVIS .. 40

1. Traitement des oocytes de Xénope ... 40

2. Caractérisation des produits de traduction dans les

4.

40 oocytes ... V. PREPARATION ET CLIVAGE DU DNA DE FOIE DE CHEVRE... 42

1. Extraction du DNA ... 4 2 2. Clivage du DNA ... 4 2 3. Purification du DNA ... 4 2 -RESULTATS_ _ _ _ _ _ _ _E_JT_ _ _ _ _ _ _ _ _DISCUSSION ... 44

1ère partie : SYNTHESE ET CARACTERISATION D'UN DNA RADIO­ ACTIF COMPLEMENTAIRE AU RNA MESSAGER DE LA THYROGLOBULINE DE BOEUF... 45

I. PREPARATION DU m-RNA 33S DE THYROGLOBULINE DE BOEUF... 46

II. MESURE DE LA TAILLE DU mRNA 33S DE THYROGLOBULINE DE BOEUF ... 50

III. SYNTHESE D'UN DNA COMPLEMENTAIRE (=cDNA) AU RNA MESSAGER DE THYROGLOBULINE DE BOEUF... 53

IV. CARACTERISATION DU cDNA DE THYROGLOBULINE DE BOEUF... 57

(8)

le cDNA TG de boeuf ... 63 4. Hybridation du cDNA synthétisé à partir de mRNA 33S

de boeuf avec le RNA extrait de thyroides provenant d'espèces différentes... 65 5. Stabilité des hybrides formés avec le cDNATG de boeuf

et le RNA extrait de thyroïdes d'espèces différentes 65

- DISCUSSION ... 70 2ème PARTIE : ETUDE D'UN GOITRE CONGENITAL PRESENTANT

UNE DEFICIENCE EN THYROGLOBULINE ... 75 I. INTRODUCTION ... 76 II. DOSAGE DU mRNA DANS UN GOITRE CONGENITAL HUMAIN

DEFICIENT EN THYROGLOBULINE ... 77 III. DOSAGE DES SEQUENCES DE mRNATG DANS LA THYROÏDE DE

CHEVRE NORMALE ET DANS UN GOITRE CONGENITAL DEFI­

CIENT EN THYROGLOBULINE ... 83 IV. STABILITE THERMIQUE DES HYBRIDES FORMES ENTRE LE

cDNATG DE BOEUF ET LE RNA DE CHEVRE NORMALE ET

GOITREUSE ... 85 V. ANALYSE DES PROFILS DES POLYSOMES THYROÏDIENS CHEZ

LA CHEVRE NORMALE ET GOITREUSE... 8 5 VI. DISTRIBUTION SUBCELLULAIRE DES SEQUENCES DE mRNATG

DANS LA

thyroïde

DE CHEVRE NORMALE ET LE GOITRE

SANS THYROGLOBULINE ... 91 VII. TRADUCTION DES SEQUENCES mRNATG DU GOITRE SANS

THYROGLOBULINE DANS L'OOCYTE DE XENOPUS LAEVIS_ _ _ _ _ 95 1. Introduction ... 95 2. Préparation du mRNA 33S de thyroïde de chèvre

normale ... 9 6 3. Comigration en gel de polyacrylamide des peptides

synthétisés par l'oocyte de Xénope après injec­

tion de mRNA 33S de boeuf et de chèvre ... 9 7 4. Préparation du RNA riche en poly(A)- de grande

taille du goitre congénital sans thyroglobu­

line ...

5. Traduction dans l'oocyte de Xénope du RNA riche en poly(A) de taille supérieure à 25S extrait

97

(9)

2. Cinétiques d'hybridation du cDNATG de chèvre "lourd"

avec le cDNA de foie de chèvre normale et goitreuse. 108

- DISCUSSION ... 111

RESUME ET CONCLUSION ...120

BIBLIOGRAPHIE

(10)

mRNA : acide ribonucléique messager.

rRNA : acide ribonucléique ribosomial.

tRNA : acide ribonucléique de transfert.

DNA ; acide désoxyribonucléique.

CAMP : adénosine 3*,5'-monophosphate cyclique.

CDNA : DNA complémentaire à une séquence de mRNA.

Rot 1/2 : produit de la concentration (moles de nucléo­

tides/litre) et du temps (en secondes) donnant la valeur de la moitié de l'hybridation maxi­

male du cDNA.

TG ; thyroglobuline.

TCA : acide trichloroacétique.

EDTA : adide éthylènediamine tetra acétique.

SDS : dodécyle sulfate de sodium.

TSH : thyrotropine.

-o-o-o-o-o-o-

(11)
(12)

I - BIOSYNTHESE DES PROTEINES CHEZ LES EUCARYOTES.

A. B iosynthèse et structure des RNA s messagers d ' eucaryotes .

1) BIOSYNTHESE DES IllRNAs

La biosynthèse des protéines d'organismes supé­

rieurs comporte une série d'étapes qui peuvent se résu­

mer de la façon suivante : une fraction du DNA est trans­

crite en une population de RNAs hétérogènes de grande taille (HnRNAs). Certains de ces HnRNAs subissent un en­

semble de modifications qu'on désigne par maturation ou

"Processing", impliquant ; clivages, excisions de séquen­

ces, addition d'une chaîne polyadénylique à l'extrémité 3'OH terminale du HnRNA, "capping" à l'extrémité 5'termi­

nale du HnRNA et méthylation dans des sites internes spéci­

fiques . Ce sont ces RNAs modifiés qui quittent le noyau pour migrer vers le cytoplasme et deviennent les mRNAs fonctionnels.

Récemment une découverte importante a remis en cause un concept admis pour le codage de l'information génétique et son expression, à savoir la colinéarité entre gènes de structure et chaînes polypeptidiques.

En effet on a mis en évidence la présence de séquences insérées au sein même des gènes de structure chez certains virus d'eucaryotes d'abord, en particulier l'Adénovirus 2 et ensuite chez les eucaryotes (cf revue de Jordan, 1978) .

Des expériences d'hybridations moléculaires ef­

fectuées avec 1'Adénovirus ont montré que certains mRNAs apparaissant lors de l'infection contiennent des séquen­

ces provenant de régions très distantes sur le génome

(Sambrook, 1977) . La preuve est faite que le mRNA est

produit à partir d'un long précurseur (Weber et coll.,

1977) qui correspond à la transcription de séquences

(13)

codantes (exons) interrompues par des séquences non codan- ' tes (introns) qui sont éliminées au cours de la maturation du RNA. De telles observations ont été faites également avec d'autres virus tel le SV40 (Lavi et Groner, 1977;

Berk et Sharp, 1978; Aloni et coll., 1977) .

Des introns ont été retrouvés dans plusieurs gènes d'eucaryotes. Les premiers résultats ont été obte­

nus dans les cas du gène de la globine (Jeffreys et Flavell, 1977) et du gène de l'ovalbumine (Breathnach et coll.,

1977; Weinstock et coll., 1978; Dugaiczyk et coll., 1978;

Lai et coll., 1978). On connaît à présent l'existence d'in­

sertions dans les gènes des immunoglobulines (Brack et Tonegawa, 1977) , du lysozyme et de la fibroïne du ver à soie. Il existe également des insertions dans des gènes codant pour des RNAs structuraux : les gènes de RNAs ribo- somiaux chez la Drosophile (cf revue de Jordan, 1977;

Glover et Hogness, 1977) et plusieurs gènes de tRNAs chez la levure (Valenzuela et coll., 1978). La présence de gènes interrompus par des insertions semble être un phéno­

mène général chez les eucaryotes : il y a transcription d'un long précurseur (Tilghman et coll., 1978; Gilmore- Hebert et Wall, 1978) contenant les séquences codantes et les séquences destinées à être excisées après transcrip­

tion, puis "splicing" de ce précurseur pour donner le mRNA. Remarquons que certains gènes comme celui du cyto­

chrome C chez la levure et celui de 1'actine chez Dictyos- telium ne semblent pas contenir d'insertions.

2) STRUCTURE DES mRNAs

Les mRNAs sontprésents dans le cytoplasme sous la

forme de ribonucléoprotéines dont la majorité est associée

aux ribosomes. Il existe cependant une fraction d'entre

elles qui reste libre dans le cytoplasme. Tous les RNAs

(14)

messagers d'eucaryotes étudiés jusqu'à présent ainsi que de nombreux mRNAs de virus d'eucaryotes contiennent une structure méthylée en position 5'terminale connue sous le nom de "cap". La formule générale du cap peut se représen­

ter par m^G^^ Dans cette structure la

7-méthylguanosine (m^G) et l'avant-dernier nucléoside (X) sont liés par les groupes 5'-hydroxyles grâce à un pont triphosphate. Les nucléosides X et Y sont souvent méthylés en position 2'-0- et on rencontre parfois une , 2'-0- diméthyladénosine en position X.

Le rôle du cap n'est pas encore totalement élucidé, cepen­

dant deux fonctions principales de la 7 méthylguanosine en position 5' terminale semblent se dégager sur base des expé­

riences de traduction in vitro (Griffin, 1976; Filipowicz,1978) .

De nombreux travaux ont montré l'importance du "cap"

pour l'efficience de la traduction "in vitro"

1°) Les expériences effectuées avec des mRNAs et des ribo- polymers dont on a ou non enlevé le "cap" (Both et coll.,

1975; Muthukrishnan et coll., 1975; Muthiikrishnan et coll., 1976, Gedamu et Dixon, 1978).

2°) La comparaison des activités messagères de mRNAs possé­

dant un cap intact ou partiellement modifié (Both et coll., 1975; Muthukrishnan et coll., 1976; Wodnar-Fili- powicz et coll., 1978).

3°) L'utilisation d'analogues du cap. Les analogues du cap agissent comme inhibiteurs spécifiques de la traduction de mRNAs possédant un "cap" (Hickey et coll., 1976;

Roman et coll., 1976) . Ils agissent au niveau de l'ini­

tiation en inhibant la liaison du mRNA aux ribosomes (Canaani et coll., 1976; Roman et coll., 1976). Leur effet inhibiteur sur la traduction ou la liaison aux

«

ribosomes de mRNAs possédant le cap est démontré dans

(15)

le germe de blé (Lodish et Rose, 1977; Levin et Samuel, 1977; Rao et coll., 1977), Artemia salina (Filipowicz et coll., 1976), les cellules L (Canaani et coll., 1976), les cellules Hela (Weber et coll., 1976), les cellules d'ascites (Sharma et coll., 1976) et le lysat de réti­

culocytes (Pelham et coll., 1978; Shafritz et coll., 1976; Suz\aki, 1976, 1978; Weber et coll., 1978).

4°) Les expériences de compétition au niveau de la liaison aux ribosomes : lorsqu'on utilise un mélange contenant des mRNAs avec et sans cap, les molécules qui portent un cap sont préférentiellement liées (Muthukrishnan et coll.,

1976; Muthukrishnan et coll., 1978).

En fait, il semble bien que la méthylguanosine 7 en position 5'terminale ne soit pas indispensable à la

traduction (Abraham et Pihl, 1977) mais facilite la liaison du mRNA aux ribosomes (Lodish et Rose, 1977; Muthukrishnan et coll., 1976; Held et coll., 1977; Kozak et Shatkin,

1978). La m G pourrait provoquer un changement conforma­

tionnel à l'extrémité 5'terminale du messager (Kozak et Shatkin, 1978) qui faciliterait la liaison du messager à la sous-unité 40S probablement par interaction avec ure ou plusieurs protéine(s) spécifique(s).

e_y^§_â§gr

La structure du cap en position 5' terminale des messagers semble augmenter la stabilité de messagers inciibés

dans le germe de blé (Shimotohno et coll., 1977) et les cellules L de souris (Furuichi et coll., 1977). Cette sta­

bilisation du mRNA pourrait résulter d'une protection contre la dégradation du mRNA par des nucléases.

Récemment Lockard et Lane (1978)ont mis en évidence

1'importance du cap pour la traduction du mRNA de la globine

(16)

in vivo dans l'oocyte de Xénope. Ils ont montré la perte quasi totale de l'activité messagère dans l'oocyte en éli-

7

minant le résidu m G dans des conditions très douces qui ne provoquent pas une dégradation du messager.

Remarquons que si ces deux fonctions de la m^G blo­

quant l'extrémité 5' des mRNAs d'eucaryotes semblent géné­

ralement admises, un rôle possible du cap pendant la trans­

cription ou le Processing et le transport du messager du noyau vers le cytoplasme n'est pas exclu (Rottman et coll.,

1974) . Précisons que de nombreiix travaux ont été réalisés sur le cap mais que le rôle des méthylations internes dans les messagers d'eucaryotes reste encore à élucider.

Le rôle du segment polyadénylique à l'extrémité 3' du messager semble être une stabilisation du mRNA (Marbaix et coll., 1975; Huez et coll., 1975). L'absence de ce segment conduit à une dégradation rapide du messager injecté aux oocytes de Xénope dans des conditions où le mRNA contenant le poly(A) est traduit efficacement (Marbaix et coll., 1975).

La réadénylation d'un mRNA dont on a enlevé préalablement le segment poly(A) confère à ce messager la même stabilité dans l'oocyte que celle d'un messager natif (Huez et coll.,

1975) .

(17)

B. T raduction des m RNA s .

Les protéines Sont synthétisées sur les ribosomes associés à la partie 5' terminale du mRNA par laquelle dé­

bute la formation de la chaîne polypeptidique définie par ce messager (cf Chapeville et Haenni, 1974) . Le ribosome se déplace avec la chaîne en croissance jusqu'à lecture

complète du messager puis se détache de ce dernier et libère la chaîne formée. En même temps, durant son déplacement, d'autres ribosomes qui se sont attachés successivement ef­

fectuent le même parcours, formant le polysome qui permet la synthèse simultanée du même polypeptide en plusieurs exemplaires. Pour être incorporé dans la protéine, chaque acide aminé doit d'abord être activé. Cette activation néces site un enzyme spécifique et de l'ATP comme source d'énergie.

Il est alors lié à un tRNA spécifique et conduit au complexe ribosome-messager. Le mRNA dicte l'ordre dans lequel sont incorporés les acides aminés; l'incorporation correspond à la formation d'une liaison peptidique entre l'acide aminé por té par son tRNA et la chaîne polypeptidique en construction.

Cette chaîne est fixée au complexe ribosome-messager par

l'intermédiaire du tRNA qui a apporté l'acide aminé précédent Au cours de chaque élongation, la chaîne abandonne ce tRNA pour être liée à 1'aminoacyl-tRNA suivant et ainsi de suite,

jusqu'à lecture complète du messager. On peut dissocier le processus de traduction en deux phases ;

1°) la réaction d'activation et d'estérification d'un acide aminé à un tRNA.

2°) la mise en place des aminoacyl-tRNAs et la polyméri­

sation programmée des acides aminés au niveau du complexe ribosome-mRNA

L'ensemble des mécanismes complexes impliqués dans le sys­

tème de traduction fait intervenir de nombreux facteurs pro­

téiques spécifiques.

(18)

II - CONTROLE DE LA SYNTHESE PROTEIQUE CHEZ LES EUCARYOTES.

Chez les eucaryotes pluricellulaires, la différen­

ciation conduit à la spécialisation des différentes cellules qui constituent l'organisme. Si dans chaque cellule le DNA contient l'information nécessaire à la synthèse de toutes les protéines de l'organisme, seule une petite fraction du génome est exprimée. La différenciation cellulaire doit donc s'expliquer par le contrôle de l'expression du génome depuis sa transcription en RNA jusqu'à sa traduction en une protéine active (cf Lewin, 1974) .

Il existe de nombreux agents qui contrôlent la synthèse protéique et, parmi eux, les hormones. Chez les eucaryotes, les mécanismes hormonaux qui contrôlent l'ex­

pression du génome ont été abondamment étudiés dans les tis­

sus qui répondent aux stéroïdes (Mc Knight et coll., 1975;

Green et Tata, 1976; Steinberg et coll., 1975; O'Malley et coll., 1977). Ces hormones induisent dans leur tissu cible la synthèse de protéines spécifiques. L'induction de la vitellogénine (Tata, 1976; Deeley et coll., 1977; Ryffel et coll., 1977; Jost et coll., 1978) et de 1 'ovalbixmine (Chan et coll., 1973; Palmiter et Carey, 1974; Mc Knight et coll.,

1975) par les oestrogènes est particulièrement bien étudiée.

Dans les tissus d'animaux mâles ou femelles immatures expo­

sés pour la première fois à des oestrogènes (effet primaire) on observe une période de latence avant l'apparition de

vitellogénine dans le foie du Xenopus mâle ou d'ovalbumine dans l'oviducte de poule. Lorsque le stimulus hormonal est enlevé, la production de ces protéines décroît progressive­

ment. Si une seconde dose d'oestrogènes est administrée à

l'animal, la période de latence est virtuellement abolie

et la synthèse de ces protéines atteint rapidement une

vitesse maximale (effet secondaire).

(19)

On a pu mettre en évidence un effet des stéroïdes au niveau de la transcription de gènes spécifiques et au niveau de la traduction.

1 i Çontrôle_au_niveau_de_la_transçrigtion.

Un premier contrôle se situe au niveau de la sélec­

tion des séquences de DNA à transcrire.

Dans de nombreux cas, des auteurs ont pu établir, in vivo et in vitro, un parallélisme entre la synthèse de protéines spécifiques et l'abondance de leurs mRNAs respectifs sous l'action des stéroïdes ; les cellules hypophysaires de rat accxamulent le mRNA de la préhormone de croissance en présence de glucocorticoïdes (Tushinski et coll., 1977), Tata (1976) et ses collaborateurs ont montré l'induction par les oestro­

gènes du mRNA de la vitellogénine dans des fragments de foie de Xenopus et Burns et coll. (1978) dans le foie de coq, divers auteurs ont mis en évidence que la synthèse d'ovalbu­

mine est contrôlée au niveau de l'accumulation de son mRNA (Palmiter, 1973; Chan et coll., 1973; Mc Knight et coll.,

1975; Cox et coll., 1974), les observations de Stone et coll.

(1977) et Seo et coll. (1979) indiquent que la production de prolactine par les oestrogènes est liée à l'accumulation du mRNA de la prolactine.

D'autre part des cinétiques d'accumulation du mRNA de la vitellogénine lors de stimulations primaire et secondaire ont montré que l'accumulation de ce messager est beaucoup

plus rapide au cours d'une stimulation secondaire par les oestrogènes (Deeley et coll., 1977; Jost et coll., 1978;

Ryffel et coll., 1977; Baker et Shapiro, 1977). Des obser­

vations similaires sont décrites par Seo et coll. (1979) sur l'accumulation du mRNA de la prolactine par les oestro­

gènes ainsi que la disparition de la période de latence lors

d'une stimulation secondaire.

(20)

Dans les cas d'hormones qui exercent leurs effets par l'intermédiaire du cAMP, les phénomènes impliqués dans le contrôle de la synthèse protéique sont peu connus. Le cAMP pourrait jouer un rôle au niveau de la transcription : la phosphorylation des histones en réponse à une hormone et au cAMP a été observée in vivo dans le foie par Langan (1969) en réponse au glucagon et dans des tranches de thyroïde in­

cubées in vitro (Lamy et Dumont, 1974, 1977) en réponse à la TSH. La phosphorylation des histones induite par le cAMP, pourrait intervenir dans le contrôle de la transcription

(Langan, 1969) .

2) Çontrôle_au_niveau_de_la_maturation_des_pré-mRNAs en_mRNAs_fonctionnels.

Toutes les séquences transcrites ne sont pas nécessai­

rement traduites, un contrôle au niveau de l'utilisation des produits de la transcription s'ajoute au précédent. Les possibilités de contrôle qu'offrent les processus de matu­

ration des pré-mRNAs en mRNAs fonctionnels sont pour le moins variées. En particulier, on s'interroge actueUement sur le rôle des insertions dans les gènes de structure chez les eu­

caryotes. On pourrait imaginer l'intervention d'enzymes de spécificités différentes de sorte qu'à un même gêne et un même HnRNA pourraient correspondre des mRNAs, et donc des protéines, différents. L'existence d'introns offre également des possibilités au niveau de l'explication des mécanismes de l'évolution (Gilbert, 1978) : des mutations dans les

introns pourraient modifier le schéma de "splicing" du HnRNA correspondant et aboutir à la synthèse de protéines diffé­

rentes .

D'autre part certains auteurs (Rottman et coll., 1974)

semblent attribuer au "cap", outre son rôle au niveau de la

traduction, un rôle possible lors de la transcription ou le

(21)

Précisons que deux types de structure cap ont été mises en évidence : les unes de type m^G(5 ' ) ppp (5 ' ) x"^pYp sont

7

appelées structures cap I et celles de type m G(5')ppp

( 5 ' ) x’^'^pY^'pZp sont appelées structures cap II (Desrosiers et coll., 1975). Des cinétiques de méthylation des extrémités 5' des mRNAs suggèrent que les structures cap I sont portées par les RNAs nucléaires hétérogènes et sont conservées au cours de la maturation. Au contraire les structures cap II ne se retrouvent pas dans le noyau mais apparaissent lors d'une méthylation secondaire qui a lieu dans le cytoplasme

(Perry et Kelley, 1976) .

3) Çontrôle_au_niveau_de_la_traduçtion.

Au niveau de la traduction, un cas particulièrement bien documenté de contrôle à l'initiation est le rôle de

l'hémine dans la synthèse de la globine dans les réticulocytes.

En l'absence de fer, la synthèse de globine s'arrête dans les réticulocytes intacts (Bruns et London, 1965). De même

lorsqu'un lysat de réticulocytes est incubé en l'absence

d'hêmine, la synthèse de globine est normale pendant quelques minutes puis s'arrête. Gross et Rabinovitz (1972) ont montré qu'en l'absence d'hêmine un inhibiteur de l'initiation de la chaîne polypeptidique est formé à partir d'un "pro-inhibiteur"

inactif de poids moléculaire similaire. L'inhibiteur est une protéine kinase, indépendante du cAMP, qui catalyse, en présence d'ATP, la phosphorylation de la petite sous-unité du facteur d'initiation eIF-2 (Farrell et coll., 1977; Levin et coll., 1976; Kramer et coll., 1976; Gross et Merelewski, 1977; Ranu et London, 1976) . La conversion du pro-inhibiteur

(kinase eIF-2 inactive) en inhibiteur (kinase eIF-2 active) semble impliquer une phosphorylation catalysée par une pro­

téine kinase dépendante du cAMP (Datta et coll., 1977) .

L'hémine, qui inhibe la conversion du pro-inhibiteur en inhi­

biteur, pourrait bloquer l'activation par le cAMP de la kinase

(22)

dépendante du cAMP (Datta et coll., 1977) en empêchant la liaison du cAMP à la sous-unitê régulatrice de la kinase.

Récemment De Haro et coll. (1978) ont montré que l'inhibi­

tion de la traduction nécessite un facteur protéique dans le lysât et dans les préparations partiellement purifiées de facteur eIF-2. L'activité de ce facteur protéique (ESP ;

"eIF-2 stimulating protein"), qui stimule la capacité de

eIF-2 non phosphorylé de former un complexe ternaire avec le Met-tRNA et le GTP ou le complexe 40 S est abolie en incu­

bant eIF-2 avec l'inhibiteur et de l'ATP. A faible concen­

tration (c'est le cas dans le lysat de réticulocytes de

lapin) le facteur eIF-2 est virtuellement incapable de former un complexe en l'absence de ESP. ESP n'ayant pas d'effet sur le facteur eIF-2 phosphorylé, l'inhibiteur de traduction, contrôlé par l'hémine, agirait en abolissant l'effet stimu­

lant de cette protéine (De Haro et coll., 1978).

Diverses observations suggèrent que les stéroïdes ont des effets notables non seulement sur la quantité de mRNA présent mais également sur l'utilisation du messager,

en particulier le mRNA d'ovalbximine, en affectant l'initia­

tion et l'élongation (Palmiter, 1972; Pennequin et coll., 1978; Palmiter et Schimke, 1973; Palmiter, 1975). Palmiter

(1971) et Pennequin et coll. (1978) ont mis en évidence un effet de la progestérone sur la distribution des polysomes.

Ces observations ont été développées par Robins et Schimke (1978) qui ont comparé les effets différentiels des oestro­

gènes et de la progestérone sur l'utilisation du mRNA d'oval- bimtiine.

Enfin remarquons que les travaux de Palmiter ont

montré un effet significatif des oestrogènes sur la stabilité du mRNA d'ovalbumine (Palmiter, 1972, 1973; Palmiter et

Carey, 19 74) .

(23)

En ce qui concerne les hormones agissant par l'inter­

médiaire du CAMP, il semblerait que ce dernier ait un effet au niveau de la traduction dans l'induction, par le glucagon, de la tyrosine transaminase (Chua et Oliver, 1971; Wicks et Mc Kibbin, 1972) et de la phosphoénolpyruvate carboxykinase dans le foie. La phosphorylation de protéines ribosomiales par une kinase stimulable par le cAMP a été observée (Blat et Loeb, 1971; Eil et Wool, 1971; Walton et Gill, 1973), toutefois il n'a pas été possible d'établir jusqu'à présent une relation directe entre la phosphorylation de ces protéines et un contrôle à la traduction. Remarquons que la tyrosine transaminase peut être induite par les glucocorticoïdes (Lee et coll., 1970; Lee et Keeney, 1971; Thompson et coll.,

1970; Scott et coll., 1972). Le contrôle par les glucocor­

ticoïdes s'exercerait non seulement à la transcription mais également à la traduction (Tomkins et coll., 1969).

Il existe dans la nature de nombreuses affections carac­

térisées par un défaut d'expression du matériel génétique.

L'exemple actuellement le mieux documenté au niveau des méca­

nismes moléculaires impliqués est celui des thalassémies.

Les thalassémies sont caractérisées par l'existence d'une anémie héréditaire qui résulte d'un défaut quantitatif de la synthèse d'une des chaînes de l'hémoglobine (Weatherall et Clegg, 1972, 1979) . On parlera de thalassémie ou selon que le défaut porte sur la chaîne ou ^ de la globine.

Il existe un très grand nombre de thalassémies et dif­

férentes :

a.- les thalassémies qt.

Elles sont caractérisées par une diminution (forme ot'*’) ou une absence (forme c<°) de la chaîne qui, dans certains casy résulte d'une délétion partielle ou totale des gènes c< de la globine (Ottolenghi et coll., 1974;

Taylor et coll., 1974;Kan et coll.,1975). D'autres tha-

(24)

lassémies c< , dans lesquelles la chaîne U. est synthé­

tisée en très petites quantités, sont dues à des mu­

tations dans le codon de terminaison de la chaîne (Wea- therall et Clegg, 1975) .

b.- les thalassémies ^

Les thalassémies forment un groupe complexe où la diminution de la chaîne ^ peut être compensée par une augmentation de la synthèse des chaînes cT et ^

(dans les thalassémies °) ou de la chaîne ^ unique­

ment (dans les thalassémies J*A °) .

Dans les thalassémies ^ , la chaîne + ^ est synthé­

tisée à une vitesse très réduite et on trouve des quantités réduites correspondantes du mRNA de la chaîne ^ dans les réticulocytes (Housman et coll., 1973; Kacian et coll., 1973) mais probablement pas dans le RNA nucléaire, suggérant un défaut dans le Processing du messager (Nienhuis et coll., 1977) . Dans les thalassémies °, les chaînes sont ab­

sentes. Il existe une grande variété de lésions

génétiques responsables des diverses thalassémies ji

le défaut pouvant aller de la délétion totale des

gènes ^ (Ottolenghi et coll., 1976; Forget et coll.,

1976) jusqu'à une anomalie de traduction du mRNA de

la chaîne (Conconi et coll., 1972, 1975; Temple

et coll., 1977) .

(25)

III - MODELE EXPERIHENTAL ; BIOSYNTHESE DE LA THYROGLOBULINE DANS LA thyroïde .

La thyroïde offre un modèle expérimental de choix qui se prête bien à l'étude des mécanismes impliqués dans le contrôle de la synthèse protéique par une hormone qui exerce ses effets par l'intermédiaire du cAMP. En effet, la thyroïde synthétise en grande quantité une protéine spécifique, la thyroglobuline. Cette synthèse s'effectue sous le contrôle de la thyrotropine, (TSH), une hormone hypophysaire, qui agit en modulant la concentration intra­

cellulaire en cAMP (Dimiont, 1971) . l'existence de diffé­

rentes situations pathologiques caractérisées par une ano­

malie congénitale de l'expression du gène thyroglobuline (Stanbury, 1966) rend particulièrement intéressante l'étude de la biosynthèse de cette protéine.

1. L a thyroïde

La glande thyroïde est constituée d'un ensemble

de follicules sphéroïdes dont la paroi est formée d'une

couche unicellulaire englobant une masse protéique ; la

colloïde, constituée essentiellement d'une glycoprotéine,1a

thyroglobuline. Les fonctions principales de la cellule

thyroïdienne sont la synthèse des hormones thyroïdiennes :

la 3, 5, 3' triiodothyronine (T^) et la 3, 5, 3', 5' tetra-

iodothyronine (T^), leur stockage dans la colloïde et leur

sécrétion dans le flux sanguin.

(26)

L'iodure est capté dans la cellule thyroïdienne par un méca­

nisme actif au niveau de la membrane basale et est concentré dans la lumière folliculaire. Il est oxydé au niveau de la membrane apicale de la cellule et fixé par lien covalent aux résidus tyrosyles d'une glycoprotéine : la thyroglobu­

line (TG). Celle-ci constitue une forme de réserve de

l'iode. La peroxydase qui oxyde l'iodure est susceptible de coupler dans la thyroglobuline certains résidus iodotyro- syles en iodothyronines et . La thyroglobuline repré­

sente donc également une forme de réserve des hormones thyroïdiennes.

La glande thyroïde est soumise au contrôle d'une hormone hypophysaire : la thyrotropine ou TSH qui agit en modulant la concentration intracellulaire en 3',5'-AMP cycli­

que. Sous l'action de la TSH, la cellule thyroïdienne pha­

gocyte la thyroglobuline et l'hydrolyse au niveau de ses lysosomes. Cette hydrolyse a pour effet de libérer les hormones thyroïdiennes dans la circulation sanguine.

Les acides aminés non iodés sont recyclés dans les voies anaboliques de la cellule thyroïdienne, les iodotyrosyles sont désiodés et l'iode libéré est réutilisé.

2. S tructure et biosynthèse de la thyroglobuline .

La thyroglobuline est une glycoprotéine d'un poids moléculaire de 660000 et de coefficient de sédimentation de

19S (Edelhoch, 1965). Elle contient environ 10 % d'hydra­

tes de carbone (Spiro et Spiro, 1965), 101 ponts disul­

fures (Edelhoch et Rail, 1964) et est formée de deux sous- unités de poids moléculaire équivalent (Vassart et coll.,

1975) . Elle représente normalement 75 % des protéines

thyroïdiennes (Schulman et coll., 1955) et est le précurseur

des hormones thyroïdiennes. Toutefois sa composition en

acides aminés n'est en aucune manière exceptionnelle : elle

ne contient pas de quantités particulièrement élevées de

tyrosines.

(27)

La synthèse de la thyroglobuline s'effectue au

niveau des polysomes lourds liés aux membranes du réticulum endoplasmique (Vassart et D\amont, 1973) . Elle est program­

mée par un RNA messager de coefficient de sédimentation de 33S qui contient toute l'information nécessaire à la synthèse d'une molécule complète de thyroglobuline (Vassart et Coll.,

1975). Les chaînes terminées migrent dans le réticulum lisse puis dàns l'appareil de Golgi où elles sont glycosylées.

De;ix chaînes polypeptidiques s'associent pour former une préthyroglobuline de coefficient de sédimentation de 17S qui est sécrétée dans la lumière folliculaire et est iodée.

Au cours de son iodation, la thyroglobuline subit une modi­

fication conformationnelle et acquiert un coefficient de sédimentation de 19S.

3. C ontrôle de la synthèse protéique dans la thyroïde .

La TSH contrôle toutes les étapes essentielles de la fonction thyroïdienne; la sécrétion des hormones thyroïdien­

nes, leur synthèse et la croissance tissulaire. En parti­

culier la TSH stimule globalement la synthèse protéique dans le tissu thyroïdien. Cette hormone se fixe à un récepteur spécifique situé sur la face externe de la mem­

brane plasmique des cellules thyroïdiennes et active l'adé- nylate cyclase qui catalyse la transformation de l'ATP en 3',5'-AMP cyclique. Celui-ci est le médiateur intracellu­

laire des effets de la TSH sur la thyroïde (Dumont, 1971) . Le contrôle de la TSH sur la synthèse protéique s'effectue à la fois au niveau de la transcription et de la traduction.

In vitro l'augmentation tardive de la synthèse protéique globale par la TSH semble nécessiter une nouvelle syn­

thèse de RNA (Sherwin et Tong, 1976) . Par ailleurs

(28)

Lamy et coll. (1977) ont montré que la TSH stimule la phosphorylation des histones riches en lysine (Hj^) dans la partie N terminale de ces protéines. Cette stimulation, cAMP dépendante, de la phosphorylation des histones pour­

rait jouer un rôle dans le contrôle de la transcription (Langan, 1969) .

La TSH stimule l'incorporation d'acides aminés radioactifs dans les protéines thyroïdiennes in vivo (Pisarev et coll., 1970; Ochi et De Groot, 1969) et in vitro (Lecocq et Dumont, 1972; Sherwin et Tong, 1976). Le fait que ce phénomène

s'accompagne d'une modification rapide du profil des poly­

somes totaux où l'on observe une augmentation relative des polysomes de grande taille (Lecocq et Dumont, 1973) suggère un contrôle de la TSH au niveau de la traduction (Vassart et coll., 1971). Plus récemment, Davies et coll. (1978) ont démontré que la TSH provoque l'accumulation spécifique des polysomes responsables de la synthèse de la thyroglobuline.

4. D éfauts génétiques .

La thyroïde présente diverses situations pathologiques (De Groot et Stanbury, 1975) qui affectent différentes étapes de la synthèse des hormones thyroïdiennes (Stanbury, 19 66) . Certains défauts qui altèrent la biosynthèse de la thyroglo­

buline présentent des analogies avec les thalassémies. En parti­

culier, il existe dans la nature, des goitres congénitaux humains (Stanbury, 1966; Riesco et coll., 1973; Lissitzky et coll., 1973) et animaux (Rijnberk et coll., 1977) caractérisés par une défi­

cience en thyroglobuline. L'absence de synthèse de thyroglo­

buline chez ces véritables "mutants" engendre un goitre héré­

ditaire et une hypothyroïdie profonde. L'existence de tels

goitres accroît considérablement l'intérêt que présente l'étude

de l'expression du gène thyroglobuline dans la thyroïde et de son

contrôle par la TSH.

(29)

IV - BUT DU TRAVAIL ET DEMARCHE EXPERIMENTALE.

Si l'on schématise la biosynthèse d'une protéine comme suit :

DNA

transcription

T

Pré-mRNA ---turnover

maturation ou Processing transport

T

mRNA cytoplasmique ---turnover

traduction

r

Protéine ---turnover

Toute altération ou absence du produit final peut pro­

venir d'un défaut à l'une ou l'autre de ces étapes : augmentation de la dégradation de la protéine, défaut de traduction ou augmentation de la dégradation du mRNA,

défaut de transport ou de maturation du messager, augmen­

tation de la dégradation des RNAs nucléaires, défaut de transcription ou délétion du gène.

Notre travail a consisté à tenter de localiser le niveau de l'altération génétique responsable de certains goitres congénitaux présentant une déficience en thyro­

globuline. La première partie de ce travail décrit la synthèse, par la transcriptase inverse, et la caractéri­

sation d'un DNA radioactif, complémentaire (= cDNA) au

(30)

RNA messager de la thyroglobuline. Dans la deuxième partie de notre travail/ nous avons utilisé ce cDNA comme sonde pour doser spécifiquement le mRNA de la thyroglobuline dans des populations de RNAs totaxix extraits de thyroïde normale et d'un goitre congénital déficient en thyroglobuline.

Nos résultats montrent une concentration des séquences mRNA

de thyroglobuline nettement inférieure à la normale dans le

goitre ainsi qu'une distribution intracellulaire anoimiale

de ces séquences.

(31)
(32)

TAMPONS.

- Tampon A tris 200 mM HCl pH 8,5

KCl 50 mM

MgCl2 25 mM saccharose 200 mM

- T50N100M5 tris 50 mM HCl PH 7,5 NaCl 100 lîiM

MgCl2 5 mM

- T10N100E6 tris 10 mM HCl pH 7,5 NaCl 100 mM

EDTA 6 mM

- Tampon H tris 10 mM HCl pH 7,5 NaCl 300 mM

EDTA 1 mM

SDS 0,2 %

- Tampon E tris 10 mM HCl pH 7,5

EDTA 1 mM

SDS 0,2 %

- TIONIOEI tris 10 mM HCl PH 7,5 NaCl 10 mM

EDTA 1 mM

- Tampon B tris 50 mM HCl pH 7,4 KCl 25 mM

MgCl

2

5,25 rtiM

Dithiothreitol 1 mM

EDTA 0,25 mM

(33)

Tampon C

PBS

T10N150E1

Tampon SI

tris 50 mM HCl pH 7,5 NaCl 25 mM

MgCl

2

5,25 mM dithiothreitol 5 mM

EDTA 0,25 mM saccharose 250 mM

tampon phosphate 20 mM NaCl 140 mM

pH 7,5

tris 10 mM HCl pH 7,5 NaCl 150 mM

EDTA 1 mM

tampon acétate 30 itiM pH 4,5 NaCl 150 mM

ZnSO^ 0,12 mM

(34)

II - PREPARATION DES RNAs.

1. P rélèvement ET conservation des glandes .

Les thyroïdes de boeuf et de chèvre sont prélevées à l'abattoir dans les minutes qui suivent la mort de l'ani­

mal et transportées dans de la glace. Les glandes sont nettoyées de leur tissu conjonctif et adipeux puis coupées en petits fragments d'environ 1 cm 3 , gelées brutalement dans l'azote liquide et conservées au freezer à - 60°C.

2. H omogénéisation .

Les fragments de tissu congelé sont pulvérisés sous azote liquide et homogénéisés entre 0°C et 4°C dans un homogénéisateur téflon-verre dont le fiiston est animé d'un mouvement rotatif. Cette méthode d'homogénéi­

sation, peu agressive, empêche la détérioration mécanique des organites cellulaires et du mRNA de thyroglobuline, molécule particulièrement fragile et dont la taille peut

g

être estimée à 3 x 10 daltons environ.

(35)

3. I solement et purification du RNA messager 33S de la thyro - GLOBULINE.

a) ISOLEMENT_DU_RNA_A_PARTIR_D^yN_ÇULgT_27gog_x_2•

50 g à 100 g de thyroïdes sont pulvérisés et homo­

généisés dans du tampon A (250 ml pour 50 g de tissu) conte­

nant 3 mg/ml de RNA de levure (Koch Light - Colnbrook, GB).

L'homogénat est filtré au travers de 2 épaisseurs de gaze et centrifugé à 27000 x g pendant 10 minutes (rotor SS34 -

Sorvall) . Toutes les opérations s'effectuent .entre 0° et 4°C. Le culot obtenu contient en plus des mitochondries et des lysosomes une grande quantité de polysomes liés aux mem­

branes (Davies et coll., 1977). Il est suspendu dans du

tampon A (40 ml pour 100 g de tissu) contenant 2 % triton XlOO et incubé à 0° C pendant 10 minutes. Cette opération

permet de détacher les polysomes des membranes. La suspen­

sion est centrifugée à 27000 x g pendant 10 minutes et le surnageant est déposé sur des gradients discontinus formés de 3 couches de saccharose superposées, de densités différentes : 70 % saccharose ; 3 ml

40 % saccharose : 10 ml 20 % saccharose ;13 ml

Ces solutions de saccharose sont préparées dans le tampon T5ON10CM5 contenant 0,5 mg/ml d’héparine (Schwartz Mann).

Les gradients sont centrifugés à 25000 rév/min (rotor SW27- Beckman) pendant 110 minutes. On recueille la fraction qui migre à l'interface 40 % - 70 % de saccharose ainsi que la couche de saccharose 70 % et le culot. Ce matériel est enrichi en polysomes lourds liés aux membranes dont Vassart et Diimont (1973) ont montré qu'ils sont responsables de la synthèse de thyroglobuline. A ce mélange est ajouté un volume de T10N100E6 contenant 1 % SDS et 1 mg/ml de protéinase K

(Merck). La digestion se pratique pendant 15 minutes à 0°C

(36)

puis pendant 30 minutes à 37°C. On précipite le RNA par addition de 2 volumes d'éthanol.

b) ÇHROMATgGRAPHIE_D^^FINITE_Dy_RNA_RIÇHE_EN_POLY__(A)_

Le RNA total précipité provenant du culot 27000 x g est centrifugé à 3000 rév/min (Martin Christ) et solubilisé dans 3 ml de tampon d'hybridation (tampon H). Le RNA riche en poly(A) est extrait par chromatographie d'affinité sur colonne de poly(U)-Sépharose 4B (Pharmacia). La séquence polyadénylique des RNA messagers s'hybride au cours d'une incubation à 44°C pendant 15 minutes au poly(U) fixé sur la Sépharose (Vassart et coll., 1975). La suspension est trans­

férée dans une colonne thermostatisée et lavée avec le tampon H pour la débarasser du RNA non retenu par la poly(U)-Sépha­

rose (principalement le rRNA). Le RNA riche en poly(A) est élué avec le tampon E en augmentant la température à 50°C et en abaissant la force ionique. Les fractions contenant le RNA- poly(A) sont rassemblées et précipitées à l'éthanol.

C) ISgLEMENT_DU_mRNA_33S_DE_LA_THYRQGLgBULINE_PAR_ÇENTRIFy- GATigN_EN_GRADIENT_LINEAIRE_DE_SACCHARgSE.

Le RNA-poly(A) précipité est centrifugé à 10000 rev/

min pendant 30 minutes (Hb4-Sorvall) , dissous dans 200 jal de TIONIOEI, brièvement chauffé à 80°C (1 min.) et déposé sur un gradient linéaire de saccharose (5 % à 30 % dans le

/

même tampon). Le gradient est centrifugé à 60000 rev/min (rotor SW65ti-Beckman) pendant 150 minutes et l'absorbance à 260 mm est mesurée en continu dans une cellule en quartz

(chemin optique 3 mm) montée sur un spectrophotomètre (Zeiss

PMQ2). Le gradient est poussé de bas en haut et des fractions

de 6 gouttes sont collectées. Le RNA-poly(A) de la région 33S

(37)

du gradient est précipité à l'éthanol et conservé à - 20°C.

Le schéma de la figure 1 résume les différentes étapes qui conduisent à l'isolement et à la purification du mRNA de la thyroglobuline.

A. P réparation et analyse des polysomes de thyroïde .

La méthode est décrite dans la figure 2.

Environ 1 g de tissu thyroïdien pulvérisé et homo­

généisé dans 10 ml de tampon A est centrifugé pendant 10 minutes à 800 x g (rotor SS34-Sorvall). Le culot est écarté

et le surnageant centrifugé à 27000 x g pendant 10 minutes.

a) PREPARATigN_DES_PgLYSgMES_LIES_AUX_ME^RANES_A_PARTIR_DU Çyî;9î!_ 2ZQgg_x_2.

Le culot 27000 x g est suspendu dans 300 ^ul de tampon A contenant 1 mg/ml d'héparine, 1 % déoxycholate de sodium

(Koch Light-Colnbrook, GB) et 1 % Brij 58 (Sigma - St Louis, USA). La suspension est centrifugée à 27000 x g pendant 5 mi­

nutes, 200 }il du surnageant contenant les polysomes liés sont déposés sur un gradient linéaire de saccharose (15 % à 50 % dans le tampon B) et centrifugés pendant 15 minutes à 60000 rév/min (rotor SW65ti-Beckman).

b) PREPARATigN_DES_PgLYSgMES_LIBRES_A_PARTIR_DU_SURNAGEANT 27ggg_x_2.

Le surnageant 27000 x g est centrifugé pendant 2 heures à 50000 rév/min (rotor SW56ti) au travers d'un gradient discon­

tinu constitué de deux couches superposées de saccharose (respectivement 2 ml de saccharose 2M et 1ml de saccharose 0,5 M dans le tampon A) . Le culot est suspendu dans 300 ^ul de tampon B et centrifugé sur gradient linéaire de saccharose

(15 % à 50 %) dans les conditions décrites précédemment.

(38)

FIGURE 1 : ISOLEMENT ET PURIFICATION DU RNA MESSAGER DE LA THYROGLOBULINE.

HOMOGENAT

CULOT T

T

Centrifugation 10 min, 27000xg

27000xg (polysomes liés aux membranes)

2% triton XlOO , centrifugation 10min, 27000xg

SURNAGEANT 27000xg

Purification des polysomes liés sur gradient discontinu, centrifugation

110 min 25000 rév/min

PROTEINASE K : RNA total

0,3 M NaCl

rRNA

Chromatographie sur poly(U)-Sépharose

OM NaCl, 50°C

RNA-poly(A)

t

gradient linéaire de saccharose

y

mRNA 33S

(39)

FIGURE 2

PREPARATION DES POLYSOMES DE THYROÏDE

HOMOGENAT

Gradient linéaire

de saccharose

(40)

La distribution de ces deux catégories de polysomes dans les gradients linéaires est mesurée en continu par l'absor­

bance à 260 mm.

5, I solement DES RNAs d ' origines diverses .

a) RNA_TOTAL_ÇYTOPI^SMIQ

ü

E_PROVENANT_DE_THYROIDES_DE_ÇHIENS ET_HU]^INESt_DE_FgiE_ET_DE_PrAÇENTA_Hy^INS .

Le tissu pulvérisé et homogénéisé dans du tampon A (5 ml/g de tissu). L'homogénat est amené à 1 % triton XlOO et centrifugé à SOOxg pendant 10 minutes (rotor Hb4-Sorvall).

Le surnageant est dilué avec 5 volumes de EDTA 10 itiM pH 8,5, NaCl 100 mM contenant 1 % SDS et le RNA est purifié par extrac tiens successives avec un mélange de phénol/chloroforme (volume/

volume) saturé par du TlONlOOEl. Lorsque l'interphase ne pré­

sente plus de protéines dénaturées, le RNA est précipité de la phase aqueuse par addition de 2 volumes d'éthanol après ajus tement de la concentration saline à 300 mM NaCl.

Le précipité est centrifugé et lavé successivement avec 66 % éthanol contenant 0,1 M NaCl, 2 M LiCl et à nouveau avec 66 % éthanol 0,1 M NaCl. Le RNA est conservé dans l'éthanol à -20°C.

Le RNA total extrait et lavé comme décrit au point a) est chromatographié sur colonne de poly(U)-Sépharose.

Les fractions éluées de la colonne à 50°C sont collectées et précipitées à l'éthanol. Le RNA non retenu par la colonne

(principalement le rRNA) est conservé gelé à - 20°C.

(41)

RNA_total_de_thYroIdes_et_de_foie_de_çh|vre

Le tissu pulvérisé est homogénéisé dans un mélange (5 ml/g de tissu) contenant 2 % SDS, 1 % triisopropyl- naphtalène sulfonate de sodi\am (Eastman, Kodak) et 3 % 2-butanol. L'homogénat est extrait plusieurs fois avec un volixme égal de phénol/chloroforme/alcool isoamylique

(25/24/1, volume/volume). Après une extraction à l'éther, la phase aqueuse est incubée pendant 30 minutes à 37°C avec 100 ^ug/ml de protéinase K et 0,5 % SDS et réextraite au phénol. Le RNA présent dans la phase aqueuse est précipité à l'éthanol. Le précipité est centrifugé, le culot dissous dans 1 ml de T50N100M5 et incubé à 37°C pendant 20 minutes en présence de DNAase I (Worthington DPFF). La DNAase est détruite par un traitement à la protéinase K suivi d'extrac­

tions au phénol. La phase aqueuse est ensuite filtrée sur colonne de Sephadex GlOO (Pharmacia) conditionnée dans une solution de tris 10 mM HCl pH 7,5. Les fractions correspon­

dant au volxome exclu de la colonne sont précipitées à l'étha nol et conservées à - 20°C.

6. F ractionnement subcellulaire de thyroïdes de chèvre .

Les thyroïdes de chèvres pulvérisées sous N

2

liquide sont homogénéisées dans le tampon C contenant 50 ^ug/ml

de sulfate de polyvinyl (Eastman). Le fractionnement se

pratique par centrifugations de 10 minutes de manière à obtenir un culot 800 X g composé principalement de noyaux et de débris cellulaires, un culot 27000 x g essentiellement membranaire et et un surnageant 27000 x g qui constitue la fraction "cytoplas­

mique". Le surnageant post-nucléaire a été préalablement addi­

tionné de 100 unités/ml d'héparine. Les noyaux sont ensuite

purifiés de la façon suivante ; le culot 800 x g est suspendu

dans le tampcn d'homogénéisation contenant 0,5 % de nonidet P40

(42)

on ajoute à la suspension 10 voliames d‘une solution 2,4 M saccha­

rose contenant 3,3 mM d'acétate de calcium avant de la centri­

fuger à 40000 X g pendant 1 heure (Busch et coll., 1972) .

Les noyaux et le culot 27000 x g sont suspendus dans du TlONlOOEl contenant 100 unités/ml d'héparine et 50 ^g/ml de sulfate de

polyvinyl.

Le RNA est extrait des trois fractions par la méthode décrite au point précédent. Les déterminations colorimétriques du RNA, par la réaction à l'orcinol, ont été corrigées pour la réaction croisée avec le DNA.

7. E lectrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de FORMAMIDE.

La méthode est dérivée de celle décrite par EXiesberg et Vogt (1973). La formamide est désionisée par agitation avec environ 5 % (poids/volume) de résine (mixed bed resin - Bio-Rad, Richmond, Californie) pendant une heure à température ambiante et filtrée au travers d'un filtre en fibre de verre

(Whatman GF/C) . La fo:rmamide désionisée est tamponée par addition de Na

2

HPO^ et NaK

2

P

0

^.H

2

O jusqu'à une concentration finale en phosphate de 0,02 M à pH 7,0. Les gels (2,7 % ou 3 %) sont préparés au moyen de cette solution dans 10 % de

glycérol et surmontés de 100 ^1 de formamide tamponée contenant les catalyseurs;pour 20 ml : 250^ul de persulfate d'ammonium

(100 mg /ml d'eau) et 40 ul de tetraméthylethylènediamine

(temed) . Les gels sont soximis à l'électrophorèse (l,5mA/tube) pendant 6 heures (gels 2,7 %) ou pendant 18 heures (gels 3 %).

Ils sont ensuite colorés avec le "Stains Ail" (Dahlberg et coll.,

1969) .

(43)

III - SYNTHESE ET CARACTERISATION DE DNA RADIOACTIF COMPLEMENTAIRE (=cDNA) AU RNA MESSAGER 33S DE LA THYROGLOBULINE.

Nous avons effectué plusieurs synthèses de DNA radioactif complémentaire au mRNA 33S de thyroglobuline en utilisant la transcriptase inverse provenant du virus de la myéloblastose aviaire (aimablement fournie par Dr J.

Beard, Life Sciences Research Laboratories - Floride, USA).

Les conditions expérimentales de synthèse ont été légère­

ment modifiées afin d'améliorer le rendement et la qualité du cDNA.

1. S ynthèse d ' un c DNA à partir de m RNA 33S de thyroglobuline

DE BOEUF.

Le mRNA 33S modèle obtenu à partir de thyroïdes de boeuf est rapidement chauffé à 80°C et incubé à 37°C pendant une heure dans un volime final de 200 ^1 con­

tenant :

dithiothreitol 10 mM

actinomycine D (PL Biochemicals) 50 ^g/ml oligo (dT) (Pl Biochemicals) 1 p.g/ml

mRNA 33S de boeuf : 5 ^g

transcriptase inverse purifiée : 20 unités

et soit :

- préparation A

dATP, dGTP, dCTP (Boehringer) 800 ^uM

^HdTTP 47Ci/mmole :1 mCi ( 200 ^uM) tris 50 mM HCl pH 8,3

50 mM 6 mM NaCl

MgCl2

(44)

- préparation B

dATP, dGTP 800 ^uM

^HdTTP 47 Ci/mmole 1 mCi (200

^HdCTP 23 Cl/nmole i mCi (400

Les désoxynucléotides tritiés sont obtenus chez Radio- chemical Center (Amersham, GB).

On arrête la synthèse en refroidissant le milieu réactionnel à 0°C. Le RNA est hydrolysé dans 0,3 M NaOH à 100°C pendant 5 minutes, le milieu est ensuite neutralisé, amené à 2 mM EDTA et filtré sur colonne de Séphadex-G50

(10 ml) équilibrée avec 0,1 M NaCl. Le cDNA contenu dans les fractions (35 gouttes/fraction) exclues de la colonne est précipité à l'éthanol après adjonction de 25 ^g/ml de DNA d'Escherichia coli (Sigma) comme entraîneur. Le cDNA précipité est centrifugé, dissous dans de l'eau bidistillée

(+ 1300 cpm/pl) et conservé à - 20°C. Un DNA complémen­

taire au mRNA d'hémoglobine est synthétisé dans des condi­

tions expérimentales identiques. Le volume réactionnel est de 50 ^ul et la quantité de mRNA d'hémoglobine modèle, préparé selon la méthode décrite par Mach et coll. (1973) est de 1 ^ug.

- préparation C

Pour cette préparation, nous avons utilisé comme amorce à la transcription inverse, non plus l'oligo (dT), mais du DNA de thymus de veau, fragmenté par sonication et dénaturé.

Le milieur réactionnel (100 ;al) contient : tris 25 mM HCl pH 8,3 MgCl

2

6 mM

dithiothreitol 50 juM actinomycine D 100 p.g/ml DNA fragmenté 1 mg/ml

BSA(fraction V-Armour) 0,5 mg/ml mRNA 33 S de boeuf ; 3 ^ug

transcriptase inverse : 18 unités

(45)

et dTTP

^HdATP

^HdGTP

^HdCTP)

(47 Ci/mmole) (22 Ci/mmole) (16,4Ci/mmole) (23 Ci/mmole)

0,5 mCi 0,2 mCi 0,2 mCi 0,2 mCi

(200 ^)

(170 ^) (230 pM) (160 pM)

L'incubation se pratique pendant une heure à 37°C. Le milieu est ensuite traité comme décrit précédemment.

2. S ynthèse d ' un c DNA à partir de m RNA 33S de thyroglobuline DE CHÈVRE.

Préparation A

La réaction s'effectue dans le même milieu (200 ^1) que pour les préparations A et B de cDNATg de boeuf avec les modifications suivantes ;

mRNA 33S de chèvre dTTP

^HdCTP (15,5 Ci/mmole)

^HdATP (22 Ci/mmole)

^HdGTP (16,4 Ci/mmole)

: 5 ^ug 800 ^

1 mCi 1 mCi 1 mCi

(600 ^4) (420 ^) (570 yiM)

La colonne de Sephadex G50 a un volume de 20 ml et est saturée avec 1 mg de DNA d'E.coli. Le mode opératoire est identique à celui décrit pour le cDNA bovin.

Préparation B

La synthèse s'effectue à 37°C pendant une heure dans un voliime réactionnel de 100 ul contenant :

/

tris 50 mM HCl pH 8,2 KCl 52 mM

MgCl

2

7,6 mM dithiothreitol 4 mM actinomycine D 50 ^ug/ml

oligo (dT) 24 ^ug/ml

(46)

transcriptase inverse 72 unités mRNA 33S de chèvre

dTTP

^HdCTP (15,5 Ci/mmole)

^HdATP (22 Ci/mmole)

^HdGTP (16,4 Ci/mmole)

20 ^ug 500 pM

0,5 mCi 0,5 mCi 0,5 mCi

(800 ^uM) (4 20 ^) (570 |iM)

Après arrêt de la réaction à 0°C, le mRNA est hydro- lysé à 75°C pendant 30 minutes dans 0,2 M NaOH. Le milieu est ensuite ajusté à 15 mM EDTA, neutralisé et filtré sur colonne de Sephadex-G50 (25 ml) conditionnée dans 0,1 M NaCl et saturée avec 1 mg de DNA d'E.coli. Les fractions correspondant au volume exclu de la colonne sont précipitées à l'éthanol avec un entraîneur (25 pig/ml DNA E.coli) .

Le cDNA est centrifugé, dissous dans de l'eau bidistillée et conservé à - 20°C.

3. M esure DE la radioactivité .

Les mesures de radioactivité sont effectuées en

scintillation liquide (scintillateur de type Mark II, Nuclear Chicago) soit dans un mélange omnifluor (NEN)-toluène

(4 g/litre) soit dans le mélange commercial Lipoluma (Lumac).

A. M esure de la taille du c DNA thyroglobuline en gradient alcalin

^ ... . I II I

DE SACCHAROSE.

La méthode utilisée est celle décrite par Stavnezer

et coll. (1974). Le cDNA (environ 25000 cpm) est dissous

dans 200 ^1 d'une solution composée de 0,1 M NaOH, 0,9 M NaCl

et 0,01 M EDTA et centrifugé pendant 6 heures à 20°C dans un

gradient linéaire de saccharose (5 % à 20 % dans la même

solution) à 60000 rêv/min (rotor SW65ti-Beckman).

(47)

Des fractions de 6 gouttes sont collectées et la radioactivité mesurée dans un mélange contenant 1 ml de soluène 350 (Packard) ou de Lumasolve (Lumac) et 10 ml d'omnifluor - toluène ou de Lipoluma. Les coefficients de sédimentation sont déterminés approximativement en utilisant 1'équation décrite par McEwen

(1967) .

5. H ybridations moléculaires

a) HYBRIDATIONS cDNA-RNA EN EXCES DE RNA

Nous avons utilisé deux conditions expérimentales d'incubation pour les réactions d'hybridation cDNA-RNA.

Dans chaque cas elles se pratiquent en excès de RNA.

Méthode_l

Les hybridations se font à 65°C en capillaires scellés contenant environ 20 ^1 de milieu réactionnel composé de ; tris 50 mM — HCl pH 7,4; NaCl 300 rtiM, EDTA 1 mM, SDS 0,1 %; 0,1 mg/ml de RNA de levure, environ 1300 cpm de cDNA et une concentration fixe de RNA. Les capillaires sont chauffés à 100°C pendant 3 minutes et incubés ensuite à 65°C pendant les temps correspondant aux différentes valeurs de Rot désirées. On arrête la réaction en refroidissant bruta­

lement le capillaire à 0°C et en diluant l'échantillon avec le tampon utilisé pour le traitement à la SI nucléase (voir plus loin).

Mêthode_2_.

L'incubation se pratique à 40°C pendant un temps fixe

dans un volume réactionnel de 100 pl contenant (Ross et coll., 1973) ; tris 13 mM HCl pH 6,8, NaCl 600 mM, EDTA 0,13 mM,

formamide 50 %, 0,1 mg/ml de RNA de levure, le cDNA et les

concentrations de RNA appropriées. Après hybridation, les

échantillons sont traités comme les précédents.

(48)

b) HYBRIDATIONS cDNA-DNA EN EXCES DE cDNA

Les réactions ont lieu à 68°C dans des tubes de type microfuge (Beckman) contenant 20 p.1 de tampon phosphate 0,12 M pH 6,8 EDTA 1 mM, (Tolstoshev et coll., 1977), des quantités fixes de cDNA de thyroglobuline de chèvre (environ 3000 cpm) et de DNA de foie de chèvre (100 ^g) clivé par sonication.

Le mélange est surmonté de 100 }il d'huile de paraffine afin d'éviter toute évaporation. Les échantillons sont chauffés à

100°C pendant 10 minutes avant l'incubation à 68°C dans un bain de glycérol. On suit la formation d'hybrides en termi­

nant les incubations au cours du temps comme décrit plus haut.

6. flESURE DES HYBRIDES cDNA-RNA ET cDNA“DNA.

Elle consiste à mesurer la radioactivité résistante à l'action de la SI nucléase provenant d'Aspergillus oryzae.

Cette enzyme a la propriété d'hydrolyser spécifiquement le DNA monocaténaire.

a) PREPARATION DE LA SI NUCLEASE

La SI nucléase est extraite d'Aspergillus oryzae.

Elle se prépare à partir d'o(- amylase (Sigma - St Louis) selon les 2 premières étapes de la méthode décrite par Vogt

(1973). Environ 4 g d'c< -amylase sont solubilisés pendant 1 heure à 4°C dans 200 ml d'une solution contenant : tampon acétate 0,02 M, NaCl 0,05 M, ZnSO^ 0,1 mM, glycérol 5 %, pH 4,6. La suspension est centrifugée penfant 10 minutes à

lOOOOxg, le matériel insoluble est écarté et le surnageant est ajusté à pH 5,0. On chauffe rapidement la solution à 75°C et on la refroidit ensuite brutalement à 0°C; les protéines qui précipitent sont éliminées par centrifugation. L'étape de chauffe dans ce tampon permet d'éliminer pratiquement

toute activité RNAase. Les opérations suivantes s'effectuent

Figure

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Références

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