Nous avons testé la stabilité theirmique des hybrides formés à saturation dans les conditions expérimentales décri tes pour la figure 12. Les résultats exprimés dans la figure 13 montrent une courbe de dénaturation thermique dont le pente
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FIGURE
12._-
hybridation ENTRE LE cDNATG SYNTHETISE A PARTIR DE mRNA 33S DE BOEUF ET LE RNA TOTAL CYTOPLASMIQUE EXTRAIT DE THY-ROIDES D'ESPECES DIFFERENTES.
Les hybridaticns s'effectuent selon la méthode 1 (Méthodes) et les résul tats sont exprimés cotme décrit pour la figure 7. Le pourcentage de matériel résistant à la SI nucléase au tençs zéro de l'incubation a été soustrait. Le cDNATG de boeuf (préparation B) est hybridé avec :
ù.
le RNA 33S modèle extrait de thyroïde bovine (Rot 1/2 = 8,82 x 104 le RNA extrait de thyroïde de chèvre (Rot 1/2 = 2,47 x 10°) 0 le RNA extrait de thyroïde de chien (Rot 1/2 = 12,1 x 10°) • le RNA extrait de thyroïde humaine (Rot 1/2 = 20,1 x 10°) ■ le RNA extrait de foie de chèvre.
est très aiguë pour les hybrides formés entre le cDNA et le mRNATG de boeuf avec une température de demi-fusion (tj^) de
94°C dans nos conditions.
Les courbes obtemes avec les RNAs de chèvre, de chien et hiomain sont caractérisées par les valeurs de tj^ de 90°, 82,5° et 81 °C respectivement.
FIGURE
13.-DENATURATION THERMIQUE DES HYBRIDES FORMES ENTRE LE cDNA DE THYROGLOBULINE DE BOEUF ET LE RNA EXTRAIT D'ESPECES VARIEES.
65 70 75 80 85 90 95 100
TEMPERATURE
Les hybridations sont pratiquées j\isqu'à saturation pendant 40 heures
selon la méthode 1 (Méthodes) . Le cDNA de boeuf (préparation B) est h^biridé avec • le RNA 33S de boeuf
A le RNA extrait de thyroïde de chèvre O le RNA extrait de thyixiîde de chien ■ le RNA extrait de thyroïde humaine
Les hit)rides en capillaires sont ensuite incubés en doi±>le à différentes tanpé- ratures pendant 10 minutes et traités carme décrit dans Méthodes.
La première partie de notre travail a consisté à pré parer un outil pour doser spécifiquement des séquences thyro globuline. Nous avons utilisé le mRNA 33S de thyroglobuline de boeuf comme modèle et la transcriptase inverse provenant du virus de la myéloblastose aviaire (figure 6). La qualité de la copie dépend essentiellement de la pureté du mRNA modèle. Bien qu'il soit difficile de déterminer la pureté du mRNATG dans nos préparations (figure 3), la taille inhabituelle de ce messager (figures 3 et 5), le fait qu'il présente une seule bande au cours d'électrophorèse dans un gel de polyacrylamide en présence de formamide (figure 4) et que la majorité des polysomes de thyroïde liés aux membranes sont impliqués dans la synthèse de thyroglobuline (Vassart, 1972; Vassart et Dumont, 1973) suggèrent un degré de pureté raisonnable.
Le poids moléculaire minimal d'un mRNA codant pour une chaîne polypeptidique de PM 300000 doit se situer autour de 2,5 x 10^. Les résultats que nous avons obtenus par électrophorèse en gel de
g
polyacrylamide donnent une valeur moyenne de 2,8 x 10 . Bien que l'électrophorèse en gel de polyacrylamide, même en présence de formamide, ne soit pas une méthode absolue pour la détermi nation du poids moléculaire des acides nucléiques (Duesberg
et Vogt, 1973; Woo et coll., 1975), nous pouvons conclure de ces résultats que le mRNA 33S de thyroglobuline a une taille suffi sante pour contenir les 7800 bases requises pour la synthèse d'un peptide de PM 300000, pour le segment polyadénylique et les
autres séquences non traduites.
Si l'on considère la figure 7, on peut estimer que la complexité de la séquence mRNA de thyroglobuline est 10 fois supérieure à celle du mRNA d'hémoglobine (il s'agit d'un mé_ lange de mRNA o( et
là ) de
poids moléculaire 2,2 x 10 (Gould et Hamelyn, 1973). Cette conclusion n'est évidemment valable que pour des mRNAs de pureté semblable; toutefois on peut en déduire que la portion de séquence thyroglobuline transcrite en cDNA n'est pas répétée un grand nombre de fois dans le mRNA.Nous n'avons pu obtenir un cDNA de taille plus grande que 7 à lOS (figure 8) même en présence de hautes concentra tions en désoxynucléotides triphosphates (Efstratiadis et coll., 1975). Ce problème peut être inhérent à nos conditions expé rimentales, à la qualité de la transcriptase inverse (Kacian et Myers, 1976) ou à la présence de "stops" structuraux dans le RNA messager (Getz et coll., 1974; Haseltine et coll., 1976) . Même si cette caractéristique impose des restrictions sérieuses
à certaines expériences, nous pouvons utiliser le cDNATG comme sonde pour doser spécifiquement des séquences thyroglobuline
(figure 11). En effet la grande majorité des cDNAs synthétisés jusqu'à présent se situent dans la même gamme des tailles
(Schechter, 1975; Cox et coll., 1974) et rien ne permet de sup poser une relation quantitativeentre la taille du mRNA et la
longueur des séquences non traduites à l'extrémité 3'. De plus il ne semble pas exister d'homologie importante, excepté pour de très petites séquences, entre les séquences non traduites à l'extrémité 3' de mRNAs différents au sein des mêmes espèces
(Proudfoot, 1976) ou même de mRNAs codant pour des protéines
homologues dans des espèces différentes (Crawford et coll., 1977) D'autre part, lorsque le cDNA est synthétisé par la transcrip tase inverse soit à partir d'oligo(dT)cOTiiie amorce, soit à partir de DNA fragmenté, les courbes d'hybridation pratiquée dans des condi tions expérimentales identiques avec le mRNA modèle ne montrent pas de différence frappante (figures 9 et 10). Or, dans les conditions de synthèse où l'amorce est du DNA fragmenté, on peut raisonnablement émettre l'hypothèse que la copie est re présentative de l'ensemble du mRNA alors que la transcription à partir d'oligo(dT) ne représente probablement que l'extré mité 3' terminale du messager.
La comparaison entre les valeurs de Rot 1/2 (figure 9) obtenues par hybridation du cDNA à son modèle (Rot 1/2 = 8,82 x
-3
10 ) et au RNA total riche en poly(A) extrait des polysomes
- 2
séquences mRNA de thyroglobuline représentent la majorité des mRNAs dans les polysomes liés. Toutefois, si une contamination importante du mRNA modèle est peu probable, nous n'avons pu
synthétiser un cDNA qui s'hybride à plus de 70 % avec son modèle. Les 30 % qui restent n'ont pu être hybridés, même à des valeurs de Rot très élevées, ni avec du RNA total riche en poly(A) ex trait des polysomes de thyroïde liés aux membranes (figure 9), ni avec le RNA riche en poly(A) (figure 9),ni avec le RNA ribo- somial (figure 10) extraits de foie de boeuf. Ces résultats suggèrent que pendant la synthèse de cDNA, la transcriptase inverse synthétise une proportion de séquences aberrantes ou transcrit préférentiellement des contaminants très rares pré sents dans les préparations de mRNA. Remarquons que si ces contaminants se composent d'une seule séquence de la même com plexité que le mRNATG, ils doivent être présents à une concen tration au moins 10000 fois inférieure à celle du mRNATG dans le RNA riche en poly(A) des polysomes liés aux membranes (figu re 9). Nous n'observons aucune hybridation significative entre le cDNATG et le RNA provenant de tissus non thyroïdiens (figu res 7, 9, 10, 12), ceci confirme que la sonde utilisée dose spécifiquement des séquences thyroglobuline.
Un exemple de dosage du mRNATG est illustré dans la figure 11. Les hybridations sont pratiquées entre le cDNATG et le RNA total extrait des polysomes libres
;
des polysomes liés et les RNAs poly(A)-plus et poly(A)-moins extraits des polysomes liés aux membranes. Nous obtenons un enrichissement du mRNATG d'environ 85 fois dans le RNA poly(A)-plus (figure 11). Cette valeur est comparable à celle obtenue avec le mRNA purifié (figure 10) et confirme les résultats illustrés dans la figure 9 selon lesquels le RNA poly(A)-plus est constitué en majorité de mRNATG.Le RNA poly(A)-moins contient 7 fois moins de séquences thyro globuline que le RNA total extrait des polysomes liés. Nous ne savons pas si ces séquences représentent vraiment le mRNATG sans poly(A) ou des fragments de mRNA ayant perdu le segment polyadénylique ou encore si les résultats reflètent l'ineffi cacité relative de la poly(U)-sépharose. La concentration
du mRNATG dans les polysomes libres est 30 fois inférieure à celle dans les polysomes liés aux membranes. Ceci confirme les résul tats obtenus précédemment par Vassart (1972) selon lesquels la thyroglobuline est synthétisée sur les polysomes liés et
indique que les polysomes libres ne contiennent pas un réservoir de mRNATG inactif.
Notre but est de préparer une sonde pour l'étude de
l'expression du gène thyroglobuline,en particulier dans certains goitres congénitaux déficients en thyroglobuline. Nous avons donc déterminé si le cDNA d'origine bovine pouvait s'hybrider à des séquences thyroglobuline provenant d'espèces différentes susceptibles d'être étudiées.
L'hybridation croisée avec les 3 espèces que nous avons testées (figure 12) est satisfaisante et nous n'avons pas observé de différences très importantes dans la quantité d'hybrides formés à saturation. Sur base des courbes de dénaturation thermique des hybrides (figure 13) nous pouvons classer les espèces dans l'ordre d'homologie de séquence décroissant comme suit : boeuf, chèvre, chien, homme. Cette divergence dans les séquences se traduit par une diminution dans la vitesse d'hybri dation (figure 13) de sorte que de très grandes valeurs de Rot doivent être atteintes (Sutton et Mc Callum, 1971) pour que le cDNATG de boeuf s'hybride au mRNA provenant par exemple de tissu humain. Afin de tester la spécificité des hybrides formés dans ces conditions, le RNA total extrait de foie de chèvre est incubé avec le cDNATG à une valeur de Rot égale à 5x10^- Nous ne détectons pas de matériel résistant à la SI nucléase en quantité significative (figure 12) .
Dans les limites imposées par les divergences d'espèces, nous pouvons donc conclure que le cDNATG, bien qu'il ne repré sente qu'une partie de la séquence thyroglobuline, constitue un moyen efficace pour étudier l'expression du gène thyroglo buline .