ETUDE D ' UN GOITRE CONGENITAL PRESENTANT UNE DEFICIENCE EN THYROGLOBULINE
V. ANALYSE DES PROFILS DES POLYSOMES THYROÏDIENS CHEZ LA CHEVRE NORMALE ET GOITREUSE
Puisque le goitre contient des séquences de mRNATG, il nous a semblé intéressant d'y rechercher la présence des polysomes lourds qui synthétisent la thyroglobuline parmi les polysomes liés aux membranes.
Dans le tissu normal, les profils de polysomes liés aux membranes présentent un pic de polysomes lourds
(figure 19 A) caractéristiques des polysomes qui synthéti sent la thyroglobuline (Vassart et Dumont, 1973) . Un tel pic est absent dans les polysomes liés aux membranes prépa rés à partir du goitre (figure 19 B). Si nous comparons les profils des polysomes libres (figure 19 G et D), nous
LE cDNATG BOVIN ET LE RNA EXTRAIT DE THYROÏDES NORMALES DE CHEVRE ET D'UN GOITRE DEFICIENT EN THYROGLOBULINE.
Les hi^Dridations se pratiquent jusqu'à une valeur de Rot = 1000 selon la méthode 1 (Méthodes) entre le cDNATG de boeuf (préparation B) et le RNA total extrait de :
0 thyroïdes normales de chèvre
• goitre congénital sans thyroglobuline
Les échantillons en double sont ensuite incubés aux différentes tanpéra- tures pendant 10 minutes et traités à la SI nucléase.
-reitiarquons que le contenu en monosomes est beaucoup plus élevé dans le tissu goitreux que dans le tissu normal. La présence d'un excès de ribosomes non engagés dans la traduction étant inhabituelle dans un tissu thyroïdien hyperstimulé (Lecocq et Dumont, 1973), ces monosomes pourraient représenter une fraction inactive des ribosomes normalement engagés dans la synthèse de thÿjroglobuline. Afin d'exclure la possibilité selon laquelle l'absence de polysomes lourds parmi les polysomes liés a\ax mem branes dans le goitre soit due à une activité RNAase plus impor tante dans ce tissu, nous avons soit : 1°) mélangé le tissu pulvé risé normal et goitreux en quantité équivalente avant l'homogénéi
sation et analysé les profils de polysomes obtenus à partir du mélange;
soit : 2°) mélangé en quantité équiva lente les préparations de polysomes liés aux membranes des deux tissus et incubé le mélangea 0°C pendant 2 heures (figure 20).
Les résultats sont identiques pour les deux expériences, à savoir : une superposition normale des profils obtenus à par tir des tissus individuels avec un pic net des polysomes lourds qui synthétisent la thyroglobuline (figure 20).
PROFILS DE SEDIMENTATION DES POLYSOMES THYROÏDIENS DE CHEVRE NORMALE ET DU GOITRE SANS THYROGLOBULINE.
Les polysones liés aiox notibranes (A et B) et libres (C et D) sont préparés à partir de thyroïde de chèvre normale et du goitre déficient en thyroglc±iuline
(voir Méthodes) . Les préparations sont centrifugées pendant 15 minutes à 60000 rév/tnin dans des gradients linéaires (15 à 50 %) de saccharose. L'absorbance à 260 nm est mesurée en continu dans les gradients. La sédimentation est repré sentée de la gauche vers la droite.
A ; polyscmes liés aux manbranes dans la thyroïde de chèvre normale. La flèche indique les polysones qui synthétisent la thyroglobuline. B : polysones liés aux manbranes dans le goitre.
C : polysones libres dans la thyroïde normale. D ; polysones libres dans le goitre.
PROFIL DE SEDIMENTATION DU MELANGE DES POLYSOMES LIES AUX MEMBRANES PREPARES A PARTIR DE TISSU NORMAL ET GOITREUX.
FIGURE
20.-Les polysones liés aux membranes, préparés à partir de thyroïde de chèvre nontiale (A) et goitreuse (B) sont incubés pendant 2 heures à 0°C ainsi
qu'un mélange des deux préparations de polysones (C) avant d'être centrifugés en gradients linéaires (15 à 50 %) de saccharose. L'absorbance est mesiarée en continu à 260 nm et la sédimentation est représentée de la gauche vers la droite.
A : polysomes liés aux membranes dans la thyroïde de chèvre normale. La flèche indique les polysones qui synthétisent la thyroglobuline.
B ; polysomes liés aux membranes dans le goitre sans thyroglobuline. C : mélange des préparations de polysones A et B.
Puisque nous n'observons pas de polysomes qui syn thétisent la thyroglobuline parmi les polysomes liés aux
membranes dans le tissu goitreux, nous avons étudié la distri bution subcellulaire des séquences mRNATG détectées dans le RNA total. Différentes fractions subcellulaires : "nuclé aire", "cytoplasmique" (surnageant 27000 x g) et "membranaire"
(culot 27000 X g) sont préparées à partir d'un homogénat du goitre utilisé pour les expériences représentées dans la fi gure 17B (voir Méthodes) et le RNA est extrait de chaque fraction. La quantité totale de RNA récupéré dans chacune des fractions ne présente pas de différence significative entre le tissu normal et goitreux (tableau 1).
Les séquences mRNATG sont dosées dans chaque fraction par hybridation du RNA au cDNATG de boeuf. La figure 21 re présente les courbes d'hybridation obtenues avec le RNA de chaque fraction subcellulaire dans le cas normal et dans le goitre. Les valeurs de Rot 1/2 sont indiquées dans le tableau 1 ainsi que la concentration relative des séquences mRNATG et leur distribution relative dans les deux tissus. Les résultats exprimés dans la figure 21 et le tableau 1 mon trent une différence frappante entre le tissu normal et goi treux. En effet ; 1°) la concentration des séquences mRNATG dans la fraction nucléaire du goitre n'est qu'environ 2 fois inférieure à la normale (42 % de la valeur normale);
2°) la concentration de ces séquences dans la fraction cytoplasmique du goitre représente 7 % de la valeur normale et
3°) elle représente seulement 1 à 2 % de la valeur normale dans la fraction membranaire du goitre.
HYBRIDATIQNS DU cDNATG AVEC LE RNA DE FRACTIONS SUBCEL- LULAIRES PREPAREES A PARTIR DE THYROÏDE DE CHEVRE NORMALE ET DU GOITRI
FIGURE
21.-Les h^ridations se pratiquent selon la méthode 1 (Méthodes) entre le cDNATG de boeuf (préparation B) et :
0 • le RNA extrait de la fraction nucléaire û 4 le RNA extrait de la fraction cytoplasmique
dm le RNA extrait de la fraction matibranaire
Les symboles clairs et les traits interrompus correspondent à la thyroïde normale; les symboles noirs et les traits continus, au goitre.
Les résultats sont exprimés ccnme pour la figure 14. Les valeurs de Rot 1/2 sont indiquées dans le tableau 1.
COMPARAISON DES VALEURS DE Rot 1/2 OBTENUES PAR HYBRIDATIONS DU cDNATG AU RNA DE FRACTIONS SUBCELLULAIRES ET DISTRIBUTION DES
SEQUENCES mRNATG
FRACTION RNA récupéré
mg/10 g de tissu Rot 1/2 Concentration relative des sé quences mRNATG dans le goitre % de la valeur normale Distribution des - séquences mRNi^. TG % des séquences récupérées. Normal Goitre Normal
! Goitre Normal Goitre
Nucléaire 1.4 1.1 15 36 42 5 35 Cytoplasmique 3.8 3.4 7 100 7 25 38 Membranaire 1.7 1.7 CM • r — 1 70 1-2 70 27
Les valeurs de Rot 1/2 sont calculées à partir des courbes d'hybridation représentées dans la figure 21.
La concentration relative des séquences mRNATG dans le goitre est déterminée par le quotient des deux valeurs de Rot 1/2 correspondantes.
La distribution relative des séquences est estimée en fonction de la proportionnalité de ces séquences dans chaque fraction
(1/Rot 1/2) et du pourcentage de RNA dans chaque fraction (quan tité de RNA récupéré).
Alors que 5 % des séquences mRNATG récupérées se situent dans la fraction nucléaire de thyroïde normale (cette valeur pourrait être légèrement surestimée à cause d'une contamination possible par la fraction membranaire), dans le goitre 35 % des séquences mRNATG mesurées sont trouvées dans cette fraction.
La situation s'inverse dans la fraction membranaire où l'on trouve la majorité (70 %) des séquences mRNATG dans le cas normal et
27 % seulement dans le goitre. Remarquons cependant qu'en l'ab sence d'une évaluation précise des pertes lors des extractions de RNAs dans chaque fraction subcellulaire, il est impossible de déterminer la distribution exacte des séquences mRNATG.
Des résultats similaires sont obtenus avec 2 préparations indé pendantes de RNA à partir de 2 fractionnements subcellulaires.