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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
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DBM 00717
Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences
Institut de Biologie et de Médecine Moléculaire (IBMM) Laboratoire de Biologie du Développement
ANALYSE GENETIQUE DU CANCER MAMMAIRE CHEZ LE RAT : ETUDE DE LIGNEES CONGENIQUES
Thèse soumise en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences
Géraldine Piessevaux
VLB - IBMM
BIBLIOTHEQIÆ
Promoteurs : Pr. C. Szpirer et Pr. J. Roscam-Szpirer Juin 2008
Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences
Institut de Biologie et de Médecine Moléculaire (IBMM) Laboratoire de Biologie du Développement
ANALYSE GENETIQUE DU CANCER MAMMAIRE CHEZ LE RAT : ETUDE DE LIGNEES CONGENIQUES
Thèse soumise en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences
Géraldine Piessevaux
Promoteurs : Pr. C. Szpirer et Pr. J. Roscam-Szpirer Juin 2008
« La vérité ne se possède pas, elle se cherche ».
Albert Jacquard
Le moment est arrivé de mettre par écrit le chemin que j’ai parcouru depuis six années. Chemin parfois sinueux, truffé de passages difficiles, parsemé d’embûches, mais tellement stimulant lorsque le paysage se dégage. Tours, détours, demi-tours m’ont permis de contourner les obstacles, tantôt tirée par la passion et la motivation, tantôt poussée par 1a nécessité d’avancer, sans vraiment savoir vers où la route menait. Heureusement, je n’étais pas seule et à tous ceux qui m’ont permis de découvrir ce chemin, à tous ceux qui m’ont accompagnée, guidée, orientée et encouragée, j’aimerais leur témoigner ma plus vive reconnaissance.
J’aimerais, en premier lieu et tout spécialement exprimer mes plus vifs remerciements à mes Promoteurs, le Professeur Josiane Roscam-Szpirer et le Professeur Claude Szpirer. J’ai eu dès le départ, la grande chance de pouvoir suivre le conseil de Nicolas Boileau « Faites choix d’un censeur solide et salutaire, que la raison conduise et le savoir éclaire ». Merci de m’avoir accueillie au sein de votre équipe dans le Laboratoire de Biologie du Développement de l’ULB, de m’avoir orientée et guidée dans le labyrinthe de la recherche.
Contrairement à ce que prétend Benjamin Constant, ma reconnaissance n’aura pas la mémoire courte, au contraire, elle sera toujours bien présente dans mon esprit pour les Professeurs de l’ULB qui m’ont offert, chacun à leur manière, une partie de leur précieux savoir.
Merci au Professeur E. Pays, président du jury, à Madame A.M Marini secrétaire du jury, à mes accompagnateurs de thèse le Professeur L. Vanhamme et le Professeur J. Urbain et au Professeur V. Bouts, expert extérieur, de me faire le grand honneur de juger mon travail. « L'intérêt et le talent sont les seuls conseillers consciencieux et lucides ». Honoré de Balzac.
Mes remerciements les plus sincères vont à l’ensemble de l’équipe du Laboratoire de Biologie du Développement.
O Pascale, je te remercie tout particulièrement pour ton aide précieuse mais surtout pour ton amitié. Merci d’avoir partagé mes peines dans les moments de doutes et de découragements mais aussi mes joies. Rien n’est plus vrai que les mots de Francis Bacon : « L'amitié double les joies et réduit la moitié des peines ».
O Michèle, merci pour l’ensemble de ta collaboration. C’est Biaise Pascal qui l’a dit : « les rivières sont des chemins qui portent où l’on veut aller ».
O Pierre, merci pour ces discussions scabreuses et quelques fous rires. Quel plaisir.
O Merci à Jean-ffançois et Daniel de m’avoir précédée sur ce chemin emprunté par ceux qui pensent que L'avenir appartient à ceux qui se demandent comment ». Bernard Weber.
O Une pensée émue pour Christelle, Sophie, Valérie et Virginie qui poursuivent leur route. Bonne chance.
O Merci à Louis Delhaye et son équipe de l’animalerie. Merci pour votre efficacité et votre courage.
Mes remerciements les plus vifs vont à toute l’équipe de DNA Vision et l’équipe de P. Hilbert de l’IPG pour leur contribution dynamique à l’aboutissement de ce travail.
Je tiens également à témoigner ma gratitude la plus sincère au PRIA et à la direction du Télévie pour leur soutien financier. Albert Einstein a dit ; « La recherche procède par des moments distincts et durables, intuition.
aveuglements, exaltation et fièvre. Elle aboutit, un jour, à cette joie et connaît cette joie celui qui a vécu des moments singuliers ». Ces moments là, je les ai vécus, en partie, grâce à votre soutien.
Je remercie infiniment Monsieur E. Quanten, directeur de recherche au sein de la société PB Gelatins- Tessenderlo de m’avoir accordé sa confiance.
Mes remerciements, vraiment très particuliers, vont à mes amis, Amaury, Antoine, Laurent et Nathalie qui m’ont accordé avec générosité et sympathie leur temps si précieux et apporté une aide efficace dans la réalisation pratique de cette thèse.
Pour terminer, j’aimerais remercier très affectueusement ma famille, spécialement mes parents et mon beau-père, ainsi que tous mes amis pour leur soutien moral...Et ce n’est pas peu dire. Je ferai un premier clin d’œil à Sébastien, Caroline, Coralie, Audrey, Jessica et évidemment Gaëtan et un second à Catherine, Alexandre et Bob des îles.
A vous tous : votre patience et vos encouragements inconditionnels m’ont été tellement précieux. J’aimerais vous adresser ces mots : « De tous les biens que la sagesse procure à l’homme pour le rendre heureux, le plus grand est l’Amitié ». Epicure.
C’est donc très humblement que je dis merci à tout Ceux et Celles qui m’ont accompagnée et épaulée jusqu’à l’aboutissement de ce travail. Ce qui fut, je Pavoue un... « Etrange exercice. La science c’est avant tout un monde d’idées en mouvement. Ecrire pour rendre compte d’une recherche, c’est un peu immobiliser ses idées.
C’est aussi transformer la nature même de cette recherche, la formaliser. Remplacer par un défilé bien ordonné de concepts et d’expériences, un fouillis d’efforts désordonnés, de tentatives nées d’un acharnement à voir plus clair ; mais aussi de visions, de rêves, de rapprochements imprévus, de simplifications souvent enfantines, de coups de sonde au petit bonheur, dans toutes les directions, sans bien savoir où l’on va déboucher ». François Jacob.
Table des Matières
Introduction 1
1. Le cancer du sein 1
1.1 Généralités 1
1.2 Les facteurs de risque 1
1.2.1 Les facteurs environnementaux 2
1.2.2 L’âge 2
1.2.3 Les facteurs hormonaux 2
1.2.4 Les facteurs génétiques 3
1.2.4.1 Les gènes à haute pénétrance 3
1.2.4.2 Les gènes à faible pénétrance 4
1.2.5 Les nouveaux facteurs génétiques 5
1.2.6 Conclusion 6
2 Le modèle animal 6
2.1 La souris 6
2.2 Le rat 8
2.3 Les étapes vers l’identification de gène 9
2.3.1 La recherche de QTL 9
2.3.1.1 Identification de locus de sensibilité au cancer mammaire 10 chimiquement induit
2.3.1.1.1 Croisement SPRD-CU3 X WKY/E56 11
QTL de multiplicité 12
QTL de latence 13
QTL d’agressivité 13
2.3.1.2 Identification de locus de sensibilité au cancer mammaire 13 induit par oestrogènes
2.3.2 Lignées congéniques 15
2.3.2.1 Principe de la réalisation d’une lignée congénique 15
2.3.2.2 Congéniques chez le rat 16
2.3.3 Méthode du gène candidat 17
3 Mécanismes impliqués dans la carcinogenèse 18
3.1 Mécanismes de réparation des dommages causés à T ADN 18
3.2 La mort cellulaire programmée 19
3.3 La sénescence cellulaire 20
3.4 L’angiogenèse 22
3.5 Les mécanismes de résistance identifiés chez le rat 23
4 Les gènes impliqués dans la carcinogenèse 24
But du travail 27
Résultats 28
1 Recherche de gènes suppresseurs de tumeurs dans les QTLs 28
2 Réalisation et étude des lignées congéniques 30
2.1 Les lignées congéniques simples 30
2.1.1 Générations des lignées congéniques 30
2.1.2 Caractérisation des lignées congéniques pour la sensibilité 31 au cancer mammaire induit au DMBA
2.1.2.1 Lignée congénique du chromosome Ip.tel 32
2.1.2.2 Lignée congénique du chromosome Iq.tel 34
2.1.2.3 Lignée congénique du chromosome 5 35
2.1.2.3.1 Lignées sous-congéniques du chromosome 5 36
2.1.2.4 Lignée congénique du chromosome 9 36
2.1.2.5 Lignée congénique du chromosome 10 38
2.1.2.6 Lignée congénique du chromosome 18 39
2.2 La lignée double congénique des chromosomes 5 et 18 41
2.2.1 Génération de la lignée double congénique 41
2.2.2 Caractérisation de la lignée double congénique pour la sensibilité 42 au cancer mammaire induit au DMBA
3 Application de la méthode du gène candidat 44
3.1 Analyse des taux d’expression de gènes candidats 45
3.1.1 Gènes candidats localisés sur le chromosome 5 46 3.1.2 Gènes candidats localisés sur le chromosome 10 46 3.1.3 Gènes candidats localisés sur le chromosome 18 47
Discussion 48
1 Analyse de perte d’hétérozygotie 48
2 Etudes de lignées congéniques 48
2.1 Phénotype de multiplicité tumorale 49
2.2 Phénotype de latence tumorale 51
2.3 Phénotype de vitesse de croissance tumorale 51
2.4 Evaluation des effets d’une combinaison génétique entre 52 les QTLs localisés sur les chromosome 5 et 18
3 Etude de gènes candidats 54
4 Conclusion 56
Bibliographie 57
Annexes
Annexe 1 : Liste des abréviations
Annexe 2 : Résultats d’analyse de perte d’hétérozygotie par la méthode GeneScan Annexe 3 ; Séquences des régions contenant les marqueurs microsatellites
DlRatl etD5Ratl90
Annexe 4 : Résultats d’analyse de perte d’hétérozygotie par pyroséquençage Annexe 5 : Listes de gènes différentiellement exprimés entre les lignées
SPRD-Cu3 et WKY Annexe 6 : Matériel et Méthodes Annexe 7 : Publications
INTRODUCTION
Estimated New Cases
Males Females
Prostate 218,890 29%
Lung & bronchus 114,760 15%
Colon & rectum 79,130 10%
Urinary bladder 50,040 7%
Non-Hodgkin 34,200 4%
lymphoma
Melanoma of the skin 33,910 4%
Kidney & rena pelvis 31,590 4%
Leukemia 24,800 3%
Oral cavity & 24,180 3%
pharynx
Pancréas 18,830 2%
Ail sites 766,860 100%
Estimated Deaths
Lung & bronchus 88,510 31%
Prostate 27,050 9%
Colon & rectum 26,000 9%
Pancréas 16,840 6%
Leukemia 12,320 4%
Liver & intrahepatic 11,280 4%
bile duct
Esophagus 10,900 4%
Urinary bladder 9,630 3%
Non-Hodgkin 9,600 3%
lymphoma
Kidney & rena pelvis 8,080 3%
AU sites 289,550 100%
Breast 178,480 26%
Lung & bronchus 98,620 15%
Colon & rectum 74,630 11%
Uterine corpus 39,080 6%
Non-Hodgkin 28,990 4%
lymphoma
Melanoma of the skin 26,030 4%
Thyroid 25,480 4%
Ovary 22,430 3%
Kidney& rénal 19,600 3%
pelvis
Leukemia 19,440 3%
AU sites 678,060 100%
Males Females
Lung & bronchus 70,880 26%
Breast 40,460 15%
Colon & rectum 26,180 10%
Pancréas 16,530 6%
Ovary 15,280 6%
Leukemia 9,470 4%
Non-Hodgkin 9,060 3%
lymphoma
Uterine corpus 7,400 3%
Brain & other 5,590 2%
nervous System
Liver & intrahepatic 5,500 2%
bile duct
Ail sites 270,100 100%
Figure 1 : Ten leading cancer types for the estimated new cancer cases and death by sex, US, 2007 La figure ci-dessus nous montre les estimations des cancers les plus communs chez l'homme et chez la femme pour l’année 2007. On constate que les trois sortes de cancers les plus communément diagnostiqués chez les femmes sont le cancer du sein, des poumons et des bronches ainsi que du colon et du rectum. Les cancers du sein diagnostiqués représenteraient à eux seuls 26% des cas, pour un taux de mortalité estimé à 15% (Cancer Statistics, 2007)
Introduction
INTRODUCTION
1. Le cancer du sein
1.1 Généralités
Le cancer du sein est un des cancers les plus souvent diagnostiqués chez la femme dans le monde, il affecte environ 10 % des femmes dans les pays industrialisés tels que les Etats-Unis, le Canada, l'Europe du Nord, l'Australie et la Nouvelle Zélande (Sandelin et al., 2002). L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et le Centre International de Recherche sur le Cancer (CIRC, Lyon) recensent chaque année environ 7000 nouveaux cas de cancer du sein et plus de 2500 décès dus à ce cancer en Belgique (population de 4.4 millions de femmes). La Belgique est d'ailleurs un des pays de l'Union Européenne les plus touchés (OMS, 2008). Aux Etats-Unis les cas de cancer sont répertoriés depuis 1973 par des programmes tels que le Surveillance, Epidemiology, End Results Program (SEER) du National Cancer Institute qui collecte les doimées de 18 registres SEER différents représentant environ 26 % de la population américaine et rapporte les taux d'incidence et de survie. Ces données ont permis de mettre en évidence que l'incidence de la plupart des cancers a augmenté de 15 % depuis les trois dernières décennies alors que les taux d'incidence du cancer du sein ont eux augmenté de près de 23 %, amenant à mie estimation de environ 178 480 nouveaux cas diagnostiqués en 2007 aux Etats Unis (Jemal et al., 2007) (American Cancer Society, 2007). L'augmentation de l'incidence du cancer du sein a été partiellement attribuée à l'amélioration de la détection précoce, comme l'indiquent les chiffres sur l'augmentation progressive du pourcentage de patientes présentant des stades précoces de la maladie. Même si dans un premier temps ces diagnostics précoces ont permis d'améliorer le taux de guérison et de prolonger le temps de survie, on remarque malgré tout que les taux de survie ont peu augmenté depuis les années 70. Le cancer du sein reste, après le cancer du poumon, la seconde cause de mortalité des femmes, causant plus de 40 000 décès par an aux Etats-Unis (Jemal et al., 2007) (American Cancer Society, 2007) (Figure 1).
1.2 Les facteurs de risque
Comme la plupart des cancers et de nombreuses autres maladies, le cancer du sein est vm trait multifactoriel ou complexe. Un des facteurs de risque de cancer du sein est une prédisposition génétique mais d'autres facteurs interviennent en plus de cette composante génétique. Les facteurs de risque établis pour le cancer du sein incluent: les facteurs environnementaux, l'âge, les facteurs hormonaux et les facteurs génétiques.
1
Introduction
1.2.1 Les facteurs environnementauxDes études épidémiologiques ont révélé une nette variation de l'incidence du cancer mammaire à travers le monde. Le taux de détection de cancer du sein (corrigé en fonction de l'âge) aux Etats-Unis et en Europe du Nord, en Australie et en Nouvelle Zélande avoisine les 130 cas pour 100 000 femmes. Par contre en Afrique de l'Ouest et dans l'Est de l'Asie, son incidence est approximativement de 20 pour 100 000 femmes (Sandelin et al., 2002) (International Agency for Research on Cancer, 2001). 11 a été montré que la faible incidence des pays comme l'Afrique serait principalement attribuée au contexte environnemental plutôt qu’à des facteurs génétiques et que dans les pays en développement dont le style de vie s'occidentalise (stress, exposition aux effets délétères de l'industrialisation, alimentation...) les taux d'incidence et de mortalité du cancer du sein tendent à augmenter (Fregene et al, 2005;
Uganda Brest Cancer Working group, 2003). D'autres études plaidant en faveur de l'intervention des facteurs environnementaux ont montré que les populations asiatiques vivant aux Etats-Unis recouvrent une incidence occidentale de taux de cancer du sein après deux générations. L’identité précise des facteurs environnementaux en question est toutefois encore largement inconnue.
1.2.2 L’âge
La majorité des cancers sont dépendants de l'âge. Le profil d'incidence de la majorité des cancers montre que 75 % de ceux-ci apparaissent chez les personnes âgées de 55 ans et plus, celui du cancer du sein montre une augmentation exponentielle dès l’âge de 30 ans jusqu'à la ménopause (50 ans), suivi d'une légère augmentation jusqu'à l'âge de 70 ans
(National Cancer Institute, 2006).
1.2.3 Les facteurs hormonaux
L'état de développement et structurel de la glande mammaire est influencé par ime multitude de déterminants endocriniens durant toute la vie. L'histoire reproductive tout comme l’histoire hormonale des femmes sont des paramètres pris en compte dans l'estimation du risque de développer un cancer du sein. Par exemple, il a été montré qu'vme grossesse précoce a rni effet protecteur vis-à-vis du cancer du sein. En effet le risque relatif de cancer du sein est de 1.3 pour une femme ayant eu une grossesse après 20 ans, de 1.6 après 25 ans et de 1.9 après 30 ans (White, 1987). Une période de lactation prolongée peut également être associée à la réduction des risques. Par contre, la puberté précoce et une entrée en ménopause tardive peuvent être associés à une augmentation du risque (Feigelson and Henderson, 2001).
Toutefois les facteurs hormonaux liés à la durée d'exposition aux oestrogènes et à la
2
TP53, PTEN, LKB1, MSH2, MLH1 2,5% ATMf HEK2,RAD50, NBS, BRIP I,
PALB2
5% TVVIST1, CASP8, TGFB1, FGFR2, TOX3.MAP3K1 ,LSP1 .MCS5A1/2
< 20% BRCA1, BRCA2
Figure 2: Les gènes de prédisposition au cancer du sein. Les gènes suppresseurs de tumeurs à haute
pénétrance sont repris dans les encadrés. Les gènes impliqués dans les mécanismes de réponse aux dommages à l’ADN sont indiqués en gras. Les pourcentages indiqués ont été tirés des références reprises dans le texte, (d’après Szpirer and Szpirer, 2007).
Introduction
progestérone endogènes et les traitements oestroprogestatifs contraceptifs n’ont généralement été associés qu’à une faible augmentation du risque en comparaison à d'autres facteurs génétiques et environnementaux (Colditz et al., 1990; Romieu et al., 1990).Bien que dans les années 90, on estimait que les bienfaits des oestrogènes exogènes utilisés lors des thérapies de substitution hormonale (diminution de l'ostéoporose et des maladies cardio-vasculaires) prévalaient sur les risques de cancer du sein (Colditz et al., 1990), on considère actuellement ces oestrogènes comme un facteur de risque hormonal important. En effet, plusieurs études indiquent que la propension des femmes post
ménopausées à développer un cancer du sein est augmentée par la prise d'oestrogènes de substitution (1997; Chen et al., 2002; Chlebowski et al., 2003; Colditz et al., 1993). De plus, ces dernières années une diminution de l'incidence du cancer du sein chez les femmes post
ménopausées a été rapportée (Moyer, 2007). Cette diminution peut être associée à une nette réduction de l'utilisation des thérapies de substitution depuis quelques aimées. Malgré le fait que les oestrogènes constituent im facteur étiologique majeur du cancer du sein postménopausal, les mécanismes moléculaires aux travers desquels les oestrogènes induisent et promeuvent le développement de cancer du sein sont encore largement inconnus.
1.2.4 Les facteurs génétiques
L'histoire familiale est un des facteurs les plus importants en ce qui concerne le cancer du sein. L'existence de cancers du sein héréditaires a été mise en évidence par le fait qu'une fraction des cancers présente ime certaine agrégation familiale. Lorsque l'histoire familiale suggère une prédisposition héréditaire, les familles sont décrites comme ayant im cancer familial. Les cancers familiaux représentent environ 10 à 25 % des cancers du sein. Parmi les gènes impliqués il y a les gènes dits de prédisposition majeure, ce sont des gènes suppresseurs de tumeurs dont des mutations ségrègent comme un caractère monogénique, dominant (ou presque). Les mutations germinales de ces gènes ne comptent que pour un faible pourcentage des cancers du sein familiaux, 15 à 20 % pour les plus courants soit moins de 5 % des cancers du sein en général. Il a été montré que beaucoup de femmes possédant un historique familial évocateur d'une sensibilité héréditaire ne possèdent pas d'altération génétique significative au niveau des gènes majeurs connus. Dans de nombreux cas ce sont donc d'autres gènes qui déterminent la sensibilité au cancer du sein (Pharoah et al., 2002). Ces gènes dits de prédisposition mineure sont des gènes de faible pénétrance. Le cancer du sein est donc une maladie polygénique (Figure 2).
1.2.4.1 Les gènes à haute pénétrance
Des études de liaisons génétiques et de clonage positionnel dans des familles
3
Introduction
présentant une fréquence élevée de cancer du sein ont permis d'identifier des gènes majeurs qui modulent la sensibilité à ce cancer (Futreal et al., 1994; Miki et al., 1994; Tavtigian et al., 1996; Wooster et al., 1995). Les premiers gènes de sensibilité au cancer du sein à avoir été identifiés sont BRCAl et BRCA2. Ces gènes qui contrôlent également la prédisposition au cancer ovarien, sont des gènes suppresseurs de tumeurs (gènes dont le produit régule négativement le cycle cellulaire) et sont rarement mutés dans les cancers sporadiques. Ces deux gènes apparaissent être des régulateurs importants du cycle cellulaire, impliquant les mécanismes aux points de surveillance et l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose et la réparation à l'ADN (Gudmundsdottir and Ashworth, 2006; Welcsh et al., 2000).Par la suite, différentes études ont montré que des patientes présentant certains syndromes connus possédaient également un risque accm de développer un cancer du sein.
C'est ainsi que d'autres gènes suppresseurs de tumeurs ont été associés à la sensibilité au cancer du sein. Citons par exemple, TP53, PTEN et STKN/LKBl dont les mutations germinales sont à l'origine des syndromes de Li Fraumeni, Cowden et Peutz-Jeghers respectivement (Martin and Weber, 2000). Ou encore le syndrome de Muir-Torre dû à des mutations des gènes MSH2 et MLHl. Ce syndrome est généralement associé au cancer du colon mais les patientes présentent, dans ce cas, également un risque accru de cancer du sein (2 à 3 fois) (Cohen et al., 1991; Martin and Weber, 2000).
1.2.4.2 Les gènes à faible pénétrance
La majorité des gènes à faible pénétrance connus à ce jour ont été identifiés ces deux dernières années. Le premier gène à avoir été mis en évidence est le gène ATM dont la protéine joue un rôle important dans le mécanisme de réparation à l'ADN. Des mutations germinales dans ATM causent, à l’état homozygote, l'ataxia telangectasia (AT) (Shiloh, 2006;
Swift et al., 1991). L'AT est im trouble neuro-dégénératif héréditaire récessif associé à un risque accru de plusieurs cancers dont le cancer du sein (Lavin and Shiloh, 1997). Et bien que ce syndrome soit récessif, il a été montré que chez les patientes hétérozygotes au locus ATM, l'allèle muté confère un risque relatif de développer un cancer du sein égal à 2 (Ahmed and Rahman, 2006). Cependant les mutations dans ce gène sont peu courantes dans la population humaine (0,5 à 1 % de la population occidentale) (Swift et al., 1991).
CHEK2 a récemment été décrit comme un gène de sensibilité au cancer du sein à faible pénétrance. La protéine CHEK2 est une kinase impliquée dans les mécanismes de réparation à l'ADN. Elle constitue d’ailleurs ime des cibles de la protéine ATM. Les mutations dans CHEK2 seraient présentes dans un peu plus de 1 % de la population générale (Meijers- Heijboer et al., 2002; Nevanlinna and Bartek, 2006; Vahteristo et al., 2002).
Par la suite, d'autres gènes ont également été identifiés. Citons BRIPl et PALB2, qui
4
Introduction
codent pour des protéines interagissant respectivement avec les protéines BRCAl et BRCA2 (Erkko et al., 2007; Rahman et al., 2007; Seal et al., 2006). RAD50 et NBN codent pour des protéines impliquées dans le maintien de l'intégrité de l'ADN (Heikkinen et al., 2006; Lu et al., 2006; Steffen et al., 2006). Et plus récemment TWIST 1, qui code pour un facteur de transcription hélice-boucle-hélice, régulé positivement dans plusieurs cancers dont le cancer du sein (Heikkinen et al., 2006; Lu et al., 2006; Mironchik et al., 2005; Sahlin et al., 2007;Steffen et al., 2006).
Depuis peu, les chercheurs disposent d'un nouvel outil de cartographie fine chez l'humain : une carte dense des polymorphismes de séquence (Single Nucléotide Polymorphism ou SNP) qui a été dressée grâce à la mise en place du projet HapMap (vwvw.hapmap.org). Ces nouvelles données ont permis d'innover et d’élargir l'échelle des techniques de recherche de gènes. Cette nouvelle approche qui fait appel à des programmes statistiques permettant d'associer un ou plusieurs locus à une maladie, a permis d'identifier de nouveaux gènes de sensibilité à différents cancers. Quatre nouveaux gènes candidats au cancer du sein ont été mis en évidence. Des altérations dans les gènes du récepteur à la progestérone PGR, dans TGFBl et dans TNF ont été associées à une augmentation du risque (Cox et al., 2007; Gaudet et al., 2007; Hunter et al., 2007). A contrario, deux allèles de faible pénétrance du gène CASP8 codant pour ime caspase impliquée dans le processus d'apoptose ont été associés à xme diminution du risque de cancer du sein (Cox et al., 2007; Sun et al., 2007). De tels allèles sont dits de résistance. L'existence d'allèles de résistance avait déjà été évoquée lors d'études montrant que la pénétrance des allèles de sensibilité BRCAl et BRCA2 n'est pas totale (56% voir inférieure selon les populations étudiées). Ces données appuient l'hypothèse que des allèles de résistance de certains gènes pourraient réduire les conséquences tumorigéniques des allèles de sensibilité d’autres gènes.
Pour finir, des études d'association à l'échelle du génome ont identifié quatre autres locus de sensibilité au cancer du sein. Ces locus contiendraient des gènes dont les allèles de sensibilité sont relativement fréquents mais dont les effets sont mineurs : FGFR2, TOX3, MAP3K1 et LSPl (Easton et al., 2007; Hunter et al., 2007).
1.2.5 Les nouveaux facteurs génétiques
En plus des risques établis, il existe quelques facteurs de risque nouvellement identifiés ayant une composante génétique. Par exemple la densité de l'épithélium glandulaire mammaire, mesurée lors des mammographies, a été associé à une augmentation du risque de 4 à 6 fois (Boyd et al., 2002; Vacek and Geller, 2004). 11 existe également des évidences suggérant un risque accru de cancer du sein chez les femmes post-ménopausées possédant des taux élevés d'hormones sexuelles telles que les oestradiols ou la testostérone (Key et al..
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Introduction
2002). Et très récemment des études ont montré que certains polymorphismes dans l'ADN mitochondrial moduleraient la sensibilité au cancer du sein (Bai et al., 2007).Ces facteurs émergeants pourraient être des facteurs augmentant encore le risque de développer un cancer chez les patientes porteuses de gènes à risque décrits ci-dessus.
1.2.6 Conclusion
Pour résumer ce qui précède, il est primordial de prendre en considération le contexte environnemental, hormonal et génétique des patientes lors de l'estimation du risque individuel de développer un cancer du sein et la probabilité pour une femme de développer un tel cancer apparaît comme la résultante de ces facteurs.
Les déterminants génétiques identifiés sont multiples et comprennent notamment deux gènes majeurs de sensibilité à haute pénétrance et une douzaine de gènes de faible pénétrance, dont le gène de résistance CASP8. On estime que ces gènes ne comptent respectivement que pour environ 20% et 10% des gènes responsables des cancers du sein familiaux. Il reste donc à identifier la majorité de ces gènes. L'identification de nouveaux gènes et la compréhension des mécanismes impliqués dans le processus de développement du carcinome mammaire sont importantes pour améliorer les modèles d'estimation du risque individuel de développer la maladie et pour développer des thérapies mieux ciblées. Cependant en raison de l'impact le plus souvent modéré de chaque gène, de la difficulté à déterminer si les individus qui apparaissent résistants le sont parce qu'ils ont eu de la chance ou parce qu'ils possèdent un allèle particulier, de l'hétérogénéité génétique des populations humaines et des effets très variés de l'environnement, il est difficile d'identifier des gènes et les allèles de prédisposition mineure ou de résistance chez l'humain. Ceci malgré les nouveaux outils génétiques disponibles (Dahlman et al., 2002) . Pour palier à ces difficultés d'analyse, une approche consiste à avoir recours au modèle animal.
2. Le modèle animal
De tous les systèmes expérimentaux disponibles pour l’étude du cancer mammaire, le modèle du rongeur est particulièrement utilisé, principalement par le fait que des tumeurs mammaires spontanées sont fréquemment observées dans des études de long terme.
2.1 La souris
Le modèle murin est largement utilisé dans le cadre de la recherche svu* la sensibilité au cancer mammaire. D’abord parce que les nombreuses lignées de souris non consanguines et consanguines, les lignées recombinantes et transgéniques et l’existence de « knockout » ou
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Introduction
« knockin » fournissent aux chercheurs une large gamme de ressources génétiques. Ensuite, parce que des tumeurs spontanées sont fréquemment observées dans certaines lignées de souris et que des tumeurs mammaires peuvent être facilement induites. Cependant le développement de cancer mammaire chez la souris est particulier en cela qu’il est le plus souvent dépendant de l’infection des femelles par un rétro virus exogène ou par sa forme provirale moins virulente, le mouse mammary tumor virus (MMTV) (Callahan and Smith, 2000; Kozak et al., 1987). Cette dernière caractéristique du modèle murin a fourni un outil de choix pour l’identification de gènes qui peuvent être activés par insertion provirale (pour revue récente voir Szpirer et Szpirer, 2007). Grâce à ce modèle, de nombreux proto
oncogènes impliqués dans la tumorigénèse mammaire ont été identifiés (Theodorou et al., 2007; Van de Vijver and Nusse, 1991). Parmi ceux-ci citons, les gènes Fgfr2 et MapSkS. De manière intéressante, leurs homologues humains, FGFR2 et MAP3K8 ont également été associés au cancer mammaire (Easton et al., 2007; Hunter et al., 2007). D’autre part, des études de souris transgéniques surexprimant des gènes potentiellement impliqués dans le développement tumoral ont également permis la mise en évidence d’oncogènes de cancer mammaire potentiels, comme les gènes Tgfa, Pakl et Cyclin DI (Coffey et al., 1994;
Humphreys and Hennighausen, 2000; Wang et al., 2006; Wang et al., 1994).
Une caractéristique majeure du modèle murin est qu’il permet l’inactivation de gènes cibles par recombinaison homologue. Dans un premier temps, l’étude de tels modèles d’invalidation (knockout) a permis d’étudier le fonctionnement de gènes déjà impliqués dans la carcinogenèse mammaire comme Brcal, Brca2, Atm et Tp53 (Hakem et al., 1998; Jerry et al., 2000; Ward and Devor-Henneman, 2004). Par la suite, elles ont aussi permis d’incriminer quelques nouveaux gènes dont l’implication dans le développement tumoral mammaire n’était pas évidente. Citons par exemple, les gènes Foxp3 et Atf2 pour lesquels il a été montré qu’ils fonctioiment comme des gènes suppresseurs de tumeurs chez la souris et l’hrmiain (Maekawa et al., 2007; Zuo et al., 2007).
Pour finir, deux gènes, Parpl et Mcm4 ont récemment été associés à la sensibilité au cancer mammaire. Ces deux gènes, tout comme le gène Atf2 sont impliqués dans le maintien de l’intégrité du génome (Bhoumik et al., 2005; Shima et al., 2007; Tong et al., 2007).
L’utilisation du modèle murin a donc fortement contribué à la compréhension de la carcinogenèse mammaire, principalement par l’identification de nombreux oncogènes et a l’instar de la situation humaine, il a permis de souligner l’importance des mécanismes responsables de maintien de l’intégrité du génome (povu' une discussion sur le sujet voir Szpirer and Szpirer, 2007).
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Introduction
2.2 Le ratLe rat (Rattus norvégiens) constitue un modèle de choix en ce qui concerne la sensibilité au cancer mammaire. D'abord parce que l'histopathologie et la réponse aux traitements hormonaux chez le rat sont similaires à la situation humaine. Ensuite, comme chez l'homme, aucune étiologie virale n'est associée au cancer mammaire du rat et ce contrairement à la situation murine (Gould, 1995; Russo and Russo, 1996). Par ailleurs depuis quelques années la richesse des outils génétiques chez le rat a été considérablement améliorée. On dispose de la séquence génomique presque complète (Gibbs et al., 2004), d'ime cartographie bien établie (www.rgd.mcw.edu: www.ensembl.org) et d'un large panel de marqueurs génétiques tels que les SSLP (Simple Sequence Lenght Polymorphism, comprenant les microsatellites) et les SNP (Single Nucléotide Plymorphysm) dans la plupart des souches de rats commercialisées.
De plus, il existe différentes souches consanguines qui présentent des taux variables de cancer mammaire. A titre d'exemple citons: les souches Wistar Furst (WF) et Sprague- Dawley (SPRD) qui sont des souches hautement sensibles, les souches Copenhagen (COP) et Wistar Kyoto (WKY) qui présentent ime résistance complète au cancer mammaire ou encore, les souches Fisher (F344) et Munich-Wistar (MW) qui, elles, présentent un phénotype intermédiaire (Table 1).
Table 1 : Sensibilité au cancer mammaire de différentes lignées de rat (Szpirer and Szpirer, 2007)
Inducing carcinogens Susceptible stains Résistant strains References
No (spontaneous cancers) SPRD, WAG WFY, COP 1,2
Chemicals: DMBA, NMU OM, WF, SPRD, BUF LEW (LE) COP, SHR, WKY (ACI,AUG, WN) 1,3-8
lonizing radiations SPRD, BUF, LE, (LEW) (Wistar-Lewis) 7, 9-10
Hormone (estrogens) ACI, AUG COP, SPRD, BN 10-13
Les lignées entre parenthèses montre un phénotype intermédiaire. Toutes les lignées n’ont pas été testées dans toutes les conditions. Par exemple, les femelles COP ne développent pas de cancer mammaire spontané et sont résistantes au cancer mammaire chimiquement et hormonalement induit mais n’ont pas été pour la sensibilité au cancer mammaire induit par radiations ionisantes.
Référencés: 1: Hedrich, 1990; 2: (Kim et al., 1960); 3: (Harris et al., 1994); 4: (Isaacs, 1986); 5: (Isaacs, 1988); 6:
(Shellabarger et al., 1978); 7: (Gullino et al., 1975); 8: (Haag et al., 1992); 9: (Vogel and Turner, 1982); 10: (Shellabarger et al., 1978); 11: (Dunning et al., 1953); 12: (Stoneetal., 1979); 13: (Spady étal., 1998).
Le caractère de résistance ou de sensibilité est spécifique du parenchyme mammaire et s'exprime de manière cellulaire autonome. Ceci a été démontré par des greffes entre animaux de sensibilités différentes (Gould, 1986; Isaacs, 1988). Le développement de cancer peut être induit par des agents de nature physique, chimique ou hormonale. Il est à noter que dans ce cas le caractère de résistance ou de sensibilité peut dépendre de la nature de l'agent d'induction utilisé. Par exemple, les rats de souche SPRD sont sensibles aux cancers mammaires physiquement et chimiquement induits alors qu’ils sont résistants au cancer induit par administration d'oestrogènes.
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Introduction
2.3 Les étapes vers l'identification de gène2.3.1 La recherche de QTL
Dans la plupart des cas, les traits complexes affichent im phénotype quantitatif (le poids, la taille, la tension artérielle). De manière générale, on appelle les locus génétiques affectant ces traits des QTLs pour Quantitative Trait Locus. Les QTLs sont identifiés grâce à des analyses de liaisons qui corrélent des marqueurs génétiques à un phénotype dans ime population isolée. En pratique, des croisements entre animaux de sensibilité divergente sont réalisés (intercroisement F2 et croisement en retour N2). Les animaux sont caractérisés pour le phénotype étudié et génotypés au niveau d’un large nombre de marqueurs génétiques polymorphes distribués tout le long du génome. Ensuite, une analyse statistique, l’étude de liaison proprement dite, permet d’établir ou non une corrélation entre le phénotype et le génotype des animaux. Pour mesurer la signification d’une corrélation phénotype-génotype établie on utilise généralement le LOD score. Cette valeur statistique permet de confi-onter la vraisemblance de deux hypothèses. Dans le cadre de la recherche de QTLs, le LOD score est le logarithme en base 10 du rapport entre la probabilité d’observer une liaison phénotype- génotype sous l’hypothèse de la présence d’un QTL au marqueur analysé et la probabilité d’observer une liaison sous l’hypothèse de l’absence de QTL. La recherche de QTL consiste finalement à calculer grâce à l’utilisation de programme informatique, un LOD score à chaque position chromosomique (au niveau des marqueurs génétiques étudiés et entre ceux-ci). Une courbe de LOD score qui indique la vraisemblance de la présence d’un QTL, peut être établie tout le long du génome. On conclut à la présence d’un QTL dans une région chromosomique lorsque la courbe passe par un maximum avec une valeur de LOD score supérieure à un seuil de signification. Un LOD score de 3 indique que l’hypothèse de la présence d’un QTL à cette position est 1000 fois plus probable que l’hypothèse de l’absence de QTL. La difficulté première de l'identification de QTLs de traits complexes tient au fait que généralement plusieurs locus contrôlent le trait et que chacun d'eux n'est en général responsable que d'ime petite fraction de la variance du phénotype : il en résulte un faible degré de liaison phénotype- génotype. Malgré cela et le fait que la taille des régions chromosomiques identifiées est en règle commune de plusieurs dizaines de mégabases et contient dès lors des centaines de gènes, l’approche qui consiste à repérer puis analyser des QTLs pour identifier le ou les gènes responsables d’un phénotype a déjà porté ses fiuits dans de nombreuses études de traits complexes. Citons par exemple, le cas des gènes Cd36 et C5 (T/c) qui ont été identifiés suite à des études combinant la cartographie de QTLs et l’analyse de profil d’expression génique.
Les gènes Cd36 et Hc ont été associés respectivement à la résistance à l’insuline chez le rat et à l’asthme chez la souris (Aitman et al., 1999 ; Karp et al., 2000). Citons encore, les gènes CypJlbl et Atplal qui ont été associés au contrôle de la pression sanguine suite à
9
Table 2: Mammary cancer susceptibility QTLs localized in the rat (Sqjirer and S2pirer, 2007).
Traits and crosses OTL Symbol Chromosome position Commenis Référencés
A. Chemicallv-induced mammary cancer.
MultipHcitv
WF X COP U
Mes! 2 close to D2Rat3/D2Uwml Complex QTL: contains 3 sub-QTLs 2,3
Mcsia Centromere - D2Vmnl4 3
kksib D2Uwml 7 - D2RatI6 3
Mcslc D2RaÛ - D2M13ma86 3
Mcs2 7, D7Mghl5 - D7Uwm9 2
Mcs3 UDlMilll -DIWoxô Homology to position of mouse Mtsml 2
Mcs4 8, near D8Mgh6 andD8i^hI3 Cryptic allele 2
WFXWKY 4
Mcs5 5,D5Uwm8-D5Rat6 Complex QTL: contains 3 sub-QTLs 4,5,6
MesSa 5, gUwm41.6- gUmn45-5 Epistatic effect on MesSb', compound QTL 6
McsSal 5, SNP61634906 - SNP61666918 Cryptic allele 6
h^s5o2 5, SNP61667232 - gUwm23-29 6
MesSb 5, gUwmSO-22 - bUmn26-2 Cryptic allele 6
MesSe 5, bUwm36-I -gUwm47-10 Synergie effect with McsScû 6
Mcs6 l,D7Mit28-D7Rat45 4
Mcs7 10, D10Goll24 - D10Ratl87 Cryptic allele; contains Brcal 4.7
Mcs8 \A,D14Ratl-DI4Rat99 4
SPRDXWKY
Unnamed 1P distal, DIRat246- DIR260 Cryptic allele 8
Unnamed Iq distal, DlRat324 - DlRat88 8
Unnamed 2, peak at D2Rat4 Cryptic allele, overlaps MesI 8
Mestm 1 5,DSRatl24~Pla2g2a* Overlaps MesS and Emcal/8 8,9
Mcstm2 18, D]8Ratl02 - DI8Rat44 Uncovered in a congenic strain 9
Latenev
SPRDXWKY 8
Unnamed %D9Rat4I-D9Ratl58 Cryptic allele 8
Unnamed 5,D5RatI24-Pla2g2cf Colocalizes with Mcstml 9
A seressivenes^
SPRDXWKY 8
Mcsia] 10, D10Rat47 -D10PatI9 Distinct from Mcs7; includes Tp53 8,10
Mcstcû 18, DI8Ratl02 - DI8Ral44 Colocalizes with Mestnû 8,10 B. Estroeen-induced mammary cancer
Incidence and latenev
ACIXCOP 11
Emcal 5,D5Rat53-D5Rat57 Also Controls tumor muliplicity 11
Emco2 \&,atDI8Raûl Overlaps Mcstm2/Kksto2 11
MultiDlicitv
ACIXBN 12
EmcaS 2, peak at D2Ratl6 Also Controls latency 13
Emca4 l,D7Rat44-D7RatIS Also Controls latency and incidence 12
EmcaS 3, D3Rat227 - D3RaÛI0 Also Controls latency and incidence 12
Emcaô 4,D4RaU4 - D4Rat202 12
Emca7 6,D6Rat68-D6Pat8I Cryptic allele 12
EmcaS 5,D5Ratl34-D5Rat37 Also Controls latency and incidence; overlaps 12
Emcal
Emca9 18, peak at D18Rat30 Also Controls latency 13
In colutnn 1, the fîrst strain in each cross is the susceptible strain. Mes stands for mammary cancer susceptibility;
Mestm for mammary cancer susceptibility, tumor multiplicity; Mesta for mammary cancer susceptibility, tiunor aggressiveness and Emca for estogen-induced mammary cancer. “ In ref. 8, the distal WKY marker of the congenic segment was D5Ratll4; we hâve now determined that this segment includes the gene Pla2g2a, located at 157,654 Mb; similarly, the proximal internai limit has been modified; D5Ratl24, instead of D5Ratl90. *’ Aggressiveness was measured by growth rate; the fast-growing tumors were invasive (Quan et al., 2006).
Référencés: 1 : (Hsu et al., 1994); 2 : (Shepel et al., 1998); 3: (Haag et al., 2003); 4 : (Lan et al., 2001); 5 : (Samuelson et al., 2003); 6 : (Samuelson et al., 2005; Samuelson et îü., 2007); 7 : (Cotroneo et al., 2006); 8: (Quan et al., 2006); 9 : (Stieber et al., 2007); 10 ; Our unpublished data; 11 : (Gould et al., 2004; SchafFer et al., 2006); 12 : (Schaffer et al., 2006) ; 13 : (Shull, 2007).
Introduction
l’identification de QTL chez le rat. De manière remarquable, l’homologue humain du gène Atplal a également été associé au trait (Cicilia et al., 2001 ; Flint et al., 2005 ; Glorioso et al., 2001). Enfin, notons qu’il est possible d'améliorer la résolution des analyses de liaisons en augmentant fortement la taille des populations étudiées, mais cela nécessite de gérer et stocker un nombre très important d'animaux (un millier), ce qui est incompatible avec les infrastructures de laboratoire de taille modeste.2.3.1.1 Identifîcation de locus de sensibilité au cancer mammaire chimiquement induit Le recours à un carcinogène chimique tel que le DMBA (7,2 diméthyl-benz-a- anthracène), le MNU (1-méthyl-l-nitrosurée), ou plus rarement le Phip (2-amino-l-methyl-6- phenylimidazol-pyridine) accélère le processus de cancérisation. Le développement ou non d'im cancer mammaire chez des rats de souches différentes est indépendant du carcinogène chimique utilisé et si cancer il y a, la progression de la maladie est la même quelle que soit la voie d'induction. Cependant l'efficacité du traitement par un carcinogène comme le DMBA ou le MNU est fortement dépendante de l'âge de l'animal; elle est maximale lorsque le carcinogène est administré à des rats de 45 à 60 jours, c'est à dire juste après qu'ils soient devenus sexuellement matures (Russo et al., 1981).
Il a été observé que le développement des tumeurs mammaires induites par im carcinogène tel que le DMBA a lieu en plusieurs étapes. L'évènement primaire est l'apparition d'une lésion biochimique qui est le résultat de l'interaction du carcinogène et de l'ADN. Si le dommage à l'ADN n'est pas réparé correctement, il en résulte des mutations, des translocations chromosomiques, l'inactivation de gènes de régulation ou des modifications génétiques plus subtiles non encore clairement identifiées. Une transformation néoplasique présuppose que la lésion soit fixée, aidée en cela par la prolifération cellulaire, et que la cellule porteuse de la mutation évolue vers un stade de croissance incontrôlée. Il en résulte un cancer lorsque les cellules deviennent invasives et donnent lieu à des métastases (Russo et ai, 1990). Précisons qu'après traitement par une seule dose intragastrique de DMBA, les rats WF ou SPRD âgés d'une cinquantaine de jours développent des tumeurs mammaires à des fréquences élevées, proches de 100 %, tandis que les rats COP ou WKY ne présentent aucune tumeur dans des conditions équivalentes (Hsu et al., 1994; Isaacs, 1986; Lan et al., 2001;
Shepel et al., 1998). En outre, fait remarquable, il a été établi que la résistance des rats COP est due à une disparition des lésions prénéoplasiques environ 3-4 semaines après le traitement au carcinogène plutôt qu'à une non réponse au traitement (Korkola et al., 1997).
Afin d'identifier le ou les locus impliqués dans la résistance des rats COP, l'équipe de M.Gould de l'Université du Wisconsin a effectué des croisements entre des rats de la souche
10
Introduction
sensible WF et la souche résistante COP. L'approche a consisté à essayer de corréler le nombre de tumeurs produites par les femelles issues d'un croisement en retour (WF X COP) x WF traitées au DMBA, avec un locus génétique particulier. Cette approche a conduit à identifier quatre QTLs, appelés Mcsl, Mcs2, Mcs3 et Mcs4 (Mammary cancer susceptibility 1 to 4). La localisation du premier d’entre eux {Mcsl sur le chromosome 2) a été établie par l’équipe de M. Gould, grâce à ime collaboration avec notre laboratoire (Hsu et al., 1994). Les trois autres QTLs ont ensuite été localisés sur les chromosomes 7 {Mcs2), 1 {Mcs3) et 8 (Mcs4) (Shepel et al., 1998). Ces quatre locus contrôlent la multiplicité tumorale et il est remarquable que dans le cas de Mcs4, c'est l'allèle de la souche résistante qui augmente la sensibilité. Ce type d'allèle est appelé allèle « cryptique » ou « transgressif ». Par après Mcsl a été subdivisé en trois sous-QTLs (Haag et al., 2003).Par la suite, l’équipe de M. Gould a analysé un nouveau croisement en Utilisant des rats de la souche sensible WF, croisés cette fois avec la souche résistante WKY. Cinq autres locus ont été identifiés : Mcs5, Mcs6, Mcs7, Mcs8 et Mcsml (un gène modificateur agissant sur Mcsl) respectivement localisés sur les chromosomes 5, 7, 10, 14 et 6 (Lan et al., 2001).
Mcs5 a été subdivisé en quatre sous-QTLs (McsSal, Mcs5a2, McsSb et Mcs5c) (Samuelson et al., 2005; Samuelson et al., 2007).
Ces études suggèrent que la sensibilité au cancer mammaire est contrôlée par différents gènes dans differentes souches. De telles observations ont effectivement été faites dans le cadre d'autres traits multifactoriels comme la sensibilité au cancer utérin (Roshani et al., 2001) et l'hypertension (Rapp, 2000). C'est donc en analysant plusieurs croisements qu'il sera possible d'identifier tous les QTLs associés au cancer mammaire. Dans cette optique les chercheurs de notre laboratoire ont réalisé l'étude d'un nouveau croisement impliquant la souche sensible SPRD-Cu3 et la souche résistante WKY/E56 (dérivée de WKY) (Table 2) (Quan et al., 2006).
2.3.1.1.1 Croisement SPRD-CU3 X WKY/E56
Afin de permettre l'identification de nouveaux locus de sensibilité au cancer mammaire chez le rat, un croisement impliquant la souche sensible SPRD-Cu3 et la souche résistante WKYE56 a été réalisé dans notre laboratoire par J.F Laes et X. Quan. Les femelles issues du croisement en retour (SPRD-Cu3 X WKY/E56) X SPRD-Cu3 ont été injectées au DMBA 55 joins après leur naissance et testées pour l'apparition de tumeurs mammaires. Au cours de cette étude trois phénotypes distincts ont été suivis: la multiplicité tumorale (le nombre de tumeurs formées par animal après 19 semaines), la latence tumorale (le temps nécessaire à l'apparition chez chaque animal de la première tumeur après traitement au DMBA) et l'agressivité tumorale (la vitesse de croissance tumorale). Une carte génétique a été
11
RNOl
RN02
RN05
2 2
3.5 - » SPRO/SPI
V 1
1 4 RD
1
—
1.
3
t
WKY/SPRD
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0.21
0.16
Figure 3.A: QTLs associés au phénotype de multiplicité tumorale localisés sur les chromosomes 1 (2 QTLs), 2 et 5. (Multiplicité, Latence, Agressivité). Dans les fenêtres encadrées figure l’effet du génotype au marqueur microsatellite sur le phénotype. La barre rouge correspond à l’étendue de l’intervalle de confiance (Quan et al., 2006).
Introduction
réalisée préalablement grâce à l'utilisation de marqueurs polymorphes entre SPRD-Cu3 et WKY/E56 et ime analyse de liaison génétique a permis de repérer les régions chromosomiques (QTLs) associées à chacun des trois phénotypes. Au terme de ce travail, sept QTLs ont été associés à l'un ou l'autre des différents phénotypes (Quan et al., 2006). Certains d’entre eux comme dans le cas des QTLs identifiés par Gould et collaborateurs, sont localisés dans des régions contenant les homologues de gènes humains précédemment impliqués dans le développement de cancer du sein (Table 3).Table 3 : Homologues de gènes de prédisposition et QTLs chez Rattus norvégiens (d’après Szpirer et Szpirer, 2007)
Gene Symbol an position QTL Symbol QTL position Comment
Pten, Rat Chr Iq, 236.7 Mb (Iq.tel is at 267.9 Mb)
Unnammed 229.5-265.8 Mb Close to proximal limit of QTL
Nbn, Rat Chr 5, 30.5 Mb Mestml 25.0-152.9 Mb Close to proximal limit of QTL
Tp53, Rat Chr 10, 56.4 Mb Mcstal 15.3-87.3 Mb RadSO, Rat Chr 10, 39.1 Mb Mcstal 15.3-87.3 Mb Bripl, Rat Chr 10, 74.3 Mb
(predicted)
Mcstal 15.3-87.3 Mb
Brcal, Rat Chr 10, 90.5 Mb Mes 7 89.5-110.3 Mb Close to proximal limit of QTL
QTLs de multiplicité
Quatre QTLs contrôlant la multiplicité tumorale ont été identifiés (Figure 3.AJ. Deux de ces QTLs ont été localisés sur les extrémités du chromosome 1 (Iptel; cryptique et Iqtel).
Ces QTLs sont distincts de Mcs3, précédemment localisé au milieu du chromosome 1 par l'équipe de Shepel (Shepel et al., 1998). Un troisième QTL a été localisé dans la région centromérique du chromosome 2, tout comme Mcsl (Hsu et al., 1994) mais contrairement à ce dernier, celui-ci contiendrait xm ou des allèles cryptiques. Ces deux QTLs seraient donc distincts. Un quatrième QTL de multiplicité, Mestml, a été localisé sur le chromosome 5, dans ime région assez large qui se superpose à Mcs5a, MesSb et Mcs5c (sous-QTL de Mcs5) (Lan et al., 2001; Samuelson et al., 2005; Samuelson et al., 2007). Mestml contiendrait également des sous-QTLs. En analysant les données de polymorphisme des microsatellites dans toute cette région, D. Stieber a montré que les lignées SPRD et WF portent la même structure haplotypique dans la région Mcs5b, alors que la lignée WKY porte une structure différente. Le ou les gènes contrôlant potentiellement la sensibilité au cancer mammaire, qui seraient communs à Mcs5 et Mestml se trouveraient donc quelque part dans Mcs5b (Stieber et al., 2007).
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Figure 3.B: QTLs associés aux phénotypes de latence et d’agressivité tumorale localisés sur les chromosomes 9, 10 et 18. (Multiplicité, Latence, Agressivité). Dans les fenêtres encadrées figure l’effet du génotype au marqueur microsatellite sur le phénotype. La barre rouge correspond à l’étendue de l’intervalle de confiance (Quan et al., 2006).
Introduction
QTL de latenceUn QTL contrôlant la latence ttimorale a été localisé sur le chromosome 9 et décrit comme QTL cryptique (Quan et al., 2006) (FigureS.B). Aucun QTL n'avait encore été défini en association avec ce phénotype dans le cadre du cancer mammaire chez le rat. Seules des études chez la souris ont mis en évidence l'existence de QTLs impliqués dans le phénotype de latence tumorale du cancer mammaire au niveau des chromosomes 15 et 9 (Le Voyer et al., 2000). Ces derniers ne sont cependant pas localisés dans des régions homologues à celle qui contient le QTL identifié sur le chromosome 9 de rat.
QTLs d'agressivité
Deux QTL ont été identifiés (FigureS.B). Le premier, Mcstal, a été localisé sur le chromosome 10, tout comme Mcs7 (Lan et al., 2001). Ces deux QTLs sont distincts puisque ce dernier est situé dans une région distale de Mcstal. Le deuxième a été localisé sur le chromosome 18. Bien que le phénomène d'agressivité tumorale ait été observé dans le cadre du cancer du sein (Mayaudon et al., 1998), aucun QTL n'avait encore été associé au phénotype d'agressivité.
En tenant compte des QTLs définis par Gould et ses collègues, le nombre de locus associés à la sensibilité au cancer mammaire induit chimiquement chez le rat est actuellement de 20, environ (Haag et al., 2003; Lan et al., 2001; Samuelson et al., 2005; Shepel et al.,
1998) (Table 2).
2.3.1.2 Identification de locus de sensibilité au cancer mammaire induit par oestrogènes De nombreuses études épidémiologiques ont souligné l'importance des oestrogènes dans l'étiologie du cancer du sein (Bernstein and Ross, 1993; Clemons and Goss, 2001; Pike and Spicer, 1993). Dans l'optique de mieux définir les mécanismes à travers lesquels les oestrogènes contribuent à la formation de cancer, Shull et ses collègues ont cherché à identifier des facteurs génétiques qui modulent l'action des oestrogènes. Pour cela ils ont analysé des croisements de rats impliquant la lignée AGI, hautement sensible au cancer mammaire induit par oestrogènes (Gould et al., 2004; Schaffer et al., 2006). Il est à noter que pour induire vm cancer mammaire chez ces rats, les oestrogènes doivent être maintenus à un niveau élevé par administrations exogènes durant plusieurs mois, contrairement aux carcinogènes chimiques tels que le DMBA qui sont administrés en une seule dose.
Le premier croisement impliquant des rats de la souche AGI et des rats de la souche résistante GOP a permis d'associer deux QTLs à la sensibilité au cancer mammaire induit par
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Figure 4\ Positions des QTLs de sensibilité au cancer mammaire identifiés sur les chromosomes (A) 5 et (B) 18 de rat. Représentation schématique. Les marqueurs situés le long de la carte sont ceux utilisés pour définir les bornes des QTLs identifiés. Leurs noms sont indiqués à gauche de la carte et leur position correspondante en Mégabases à droite de la carte. Les positions des QTLs ont été tirées des références reprises dans le texte.
