C18.Mcstm2/Mcsta2 Marker On 0 O
1
DlSRatSO D18Ratl02 ... D18Got33 -DI8W0X8 D18Mit202 D18Rat21 D18Gotl01 D18Rat94... D18MU8 ... 'J::: D18Rat55 .. ... D18Ratl4 -D18Rat45 ,D18Rat44Figure 17.B: Représentation schématique du chromosome ayant fait l’objet de l’introgression d’un segment d’origine
WKY dans un fond génétique SPRD-Cu3 et définissant la congénique C18.Mcstm2/Mcsta2. Les QTLs associés au cancer mammaire localisés sur RN018 sont représentés à gauche de la congénique C18.Mcsm2/Mcsta2. Les marqueurs situés le long de la carte sont ceux utilisés pour définir le segment différentiel de la lignée congénique. Deux marquems en italique définissant les bornes du QTL Emca9 n’ont pas été utilisés pour réaliser la lignée congénique. Le nom des marqueurs est indiqué à gauche de la carte et leur position correspondante en Mégabases à droite. Les traits gris flanquant les segments différentiels indiquent les Intervalles de recombinaison entre les deux génomes parentaux. Les positions des QTLs ont été tirées des références reprises dans le texte.
Discussion sensibilité au cancer mammaire induit par oestrogènes. L’analyse de la structure haplotypique de la région commune dans les différentes lignées impliquées dans les croisements a permis de conclure que dans le cas ou ces QTLs sont identiques, les gènes causaux se trouveraient
dans une région distale de celle du QTL Mcs5 (en fait deux régions ont été mises en évidence)
(Stieber et al., 2007). Ce dernier argument appuie l’hypothèse de l’existence de sous-QTLs
dans la région Mcstml.
Les lignées congéniques ClO.Mcstal et C18.Mcstm2/Mcsta2 montrent respectivement une réduction de 18% et 33% de la multiplicité tumorale. De manière remarquable, les QTLs
localisés sur les chromosomes 10 et 18 avaient été associés dans un premier temps au
phénotype de vitesse de croissance tumorale. L’observation d’im phénotype de multiplicité tumorale de ces lignées congéniques intégrant une région initialement associée au phénotype de vitesse de croissance peut s’expliquer dans le cas de la lignée congénique C.lO.Mcstal par le fait que la réduction, bien que significative de la multiplicité tumorale est modeste et de ce fait difficile à détecter lors de l’analyse de liaison génétique. Dans le cas de la lignée congénique C18.Mcstm2/Mcsta2, une explication de ce fait est que la région qui contient le QTL d’agressivité présente également un QTL de multiplicité mais à un niveau statistiquement faible qui avait été ignoré en première analyse (Quan et al., 2006; Stieber et al., 2007). Les résultats de l’analyse phénotypique de la lignée congénique C.18.Mcstm2/Mcsta2 démontrent que la liaison génétique qui n’était que faiblement
suggestive est bien réelle et nous avons appelé ce QTL Mcstm2. Le QTL Mcstm2 est le
premier locus de sensibilité au cancer mammaire induit chimiquement assigné au chromosome 18. Il faut toutefois noter qu’un locus associé au cancer mammaire induit par
œstrogènes, Emca2, a été localisé sur le chromosome 18 (Gould et al., 2004) (Figure 17.B).
Plusieurs arguments permettent de soutenir l’hypothèse que les deux QTLs sont distincts, notamment l’analyse de la structure haplotypique de la région commune aux deux locus qui a révélé que les lignées étudiées ne partagent pas d’haplotype commun au niveau de la région d’intérêt (Stieber et al., 2007).
En ce qui concerne le locus Iq.tel, la lignée congénique associée ne montre aucune réduction de la multiplicité tumorale en comparaison avec la lignée parentale sensible. Nous n’avons donc pas été en mesure de confirmer les résultats des analyses de liaisons qui prédisaient que la région du chromosome 1 bordée par les marqueurs DlRat324 (229.5 Mb) et
DlRat88 (265.8 Mb) contenait un locus impliqué dans la détermination de la multiplicité
tumorale. Ces observations n’excluent pas la possibilité que le QTL Iq.tel joue un rôle dans la détermination de la sensibilité au cancer mammaire. Une hypothèse pour expliquer la perte du phénotype lors de la réalisation de la lignée congénique est que des interactions intergéniques peuvent être nécessaires pour permettre à un QTL donné d’exercer son effet sur le phénotype
Discussion
(phénomène d’épistasie, comme observé sur le QTL Mcsa2 sur le chromosome 18).
2.2 Phénotype de latence tumorale
Nous avons montré que les QTLs de sensibilité au cancer mammaire identifiés statistiquement sur les chromosomes 5, 9 et 10 manifestent leur effet sur le phénotype de latence tumorale au moins en partie indépendamment de la présence des autres QTLs identifiés. En ce qui concerne le QTL localisé sur le chromosome 9 que nous avons appelé
Mcstll, les analyses de liaison prédisaient l’effet inverse de celui observé lors de la caractérisation phénotypique. Dans ce dernier cas c’est l’allèle WKY qui augmente le temps de latence et confère la résistance.
De manière surprenante, bien qu’aucim QTL associé à ce trait n’avait été détecté dans les régions définissant les lignées congéniques CS.Mcstml et ClO.Mcstal, celles-ci montrent des différences significatives en terme de latence tumorale par rapport à la lignée parentale sensible. Les allèles d’origine WKY de chacim des deux locus sont capables, à eux seuls, d’augmenter et de réduire, respectivement, de façon significative le temps d’apparition de la
première tumeur. Le QTL Mcstml (chromosome 5) est donc impliqué à la fois dans la
détermination de la multiplicité et de la latence tumorale, l’allèle WKY de Mcstml conférant
la résistance dans les deux cas. Le QTL Mcstal localisé sur le chromosome 10 est également
impliqué dans la détermination des deux traits mais dans ce cas, T allèle WKY confère soit la résistance soit la sensibilité. Ces résultats constituent un argument pour appuyer l’hypothèse que les trois phénotypes tumoraux sont au moins en partie indépendants.
2.3 Phénotype de vitesse de croissance tumorale
Nous avons pu montrer que le QTL localisé sur le chromosome 10 identifié statistiquement manifeste son effet sur le phénotype de vitesse de croissance tumorale au moins en partie indépendamment des autres QTLs identifiés. La congénique ClO.Mcstal montre une réduction statistiquement significative de 26% de la vitesse de croissance des tumeurs les plus agressives par rapport à celle de la lignée parentale. L’allèle d’origine WKY du locus est capable à lui seul de diminuer la vitesse de croissance de tumeurs mammaires induites chimiquement. Cette diminution était attendue sur base des études de liaisons
génétiques. Nous avons appelé ce QTL, Mcstal. Le locus Mcstal est donc impliqué dans
chacrm des trois phénotypes tumoraux. Cependant, son effet est cryptique lorsque Ton considère le phénotype de latence tumorale. A l’inverse, en terme de multiplicité et de vitesse de croissance, Tallèle WKY confère la résistance mais l’amplitude de l’effet du QTL sur le premier est réduite (18% de réduction de la charge tumorale) par rapport à celle de l’effet sur la vitesse de croissance.
Discussion
2.4 Evaluation des effets d’une combinaison génétique entre les QTLs localisés sur les
chromosomes 5 et 18.
Lors de l’analyse des relations d’épistasie entre les locus localisés sur les
chromosomes 5 (Mcstml) et 18 (initialement appelé Mcstm2) nous avons pu observer que la
lignée double congénique présentait une réduction de 49% du taux moyen de croissance de la tumeur la plus rapide par rapport à celui de la lignée parentale. Rappelons qu’aucune des deux lignées congéniques simples ne présente de réduction de la vitesse de croissance tumorale par rapport à la lignée sensible. Les allèles WKY des QTLs localisés sur les chromosomes 5 et 18 interagissent de manière synergique pour moduler la vitesse de croissance tumorale. Ces résultats constituent également une confirmation physique du fait que le QTL détecté sur le chromosome 18 par les analyses de liaisons est impliqué dans la vitesse de croissance tumorale, bien que son effet ne puisse être détecté dans la congénique simple du chromosome 18 (Quan et al., 2006; Stieber et al., 2007). Des interactions épistatiques semblables avaient été mises en évidence par M.Gould et collaborateurs lors de l’analyse du croisement entre les
lignées WKY et WF. Ces analyses ont montré que bien que le locus Mcsml (« Mammary
cancer susceptibility modifierl », RN06) n’exerce pas à lui seul d’effet majeur sur le phénotype de multiplicité tumorale, l’allèle WKY au locus diminue l’effet de l’allèle de
résistance WKY au locus Mcs8 (RN014) (notons que dans ce cas-ci, l’allèle d’origine WKY
du locus Mcs8 est capable à lui seul de diminuer la multiplicité tumorale) (Lan et al., 2001).
La région du chromosome 18 contenant le QTL Mcstm2 contrôle à la fois la
multiplicité tumorale et la vitesse de croissance tumorale. Cependant les deux traits sont
indépendamment modulés par la région du chromosome 5 contenant le QTL Mcstml, étant
donné que l’allèle WKY du QTL Mcstm2 n’a pas d’effet sur la multiplicité en présence de
l’allèle WKY du QTL Mcstml alors que ces deux régions agissent de manière synergique sur
la vitesse de croissance tumorale. Les phénotypes de multiplicité tumorale et de croissance tumorale sont au moins en partie indépendants. Ceci justifie que nous ayons considéré que la région du chromosome 18 bordée par les marqueurs D18Wox8 (32.5 Mb) et D18Rat44 (86.9 Mb) contient deux QTLs et décidé d’utiliser ime dénomination distincte pour chacun d’eux
(Mcstm2 et Mcsta2).
De manière remarquable, aucim QTL n’avait encore été associé au phénotype de vitesse de croissance chez le rat. Il faut toutefois noter que plusieurs QTLs contrôlant le développement de métastases ont été identifiés chez la souris, ceux-ci ont été localisés sur les chromosomes 7, 9, 13, 17 et 19 de souris (Lancaster et al., 2005). Le chromosome 10 de rat est partiellement homologue au chromosome 17 de souris, par contre, le chromosome 18 ne présente pas d’homologie à l’un ou l’autre de ces chromosomes de souris.
Discussion Les résultats de la présente étude confirment l’importante complexité du caractère de sensibilité au cancer mammaire chez le rat. Il semble que pour mieux comprendre et expliquer le trait, il soit utile de considérer les trois phénotypes de manière indépendante. D’abord parce que trois des six régions étudiées ont montré une implication dans plus d’un phénotype tumoral. Ensuite parce que l’amplitude de l’effet de l’allèle WKY d’une région peut être très variable, voir opposée (effet cryptique sur im phénotype et non-cryptique sur un autre) comme c’est le cas pour le QTL du chromosome 10, selon le phénotype considéré. L’identification de locus impliqués dans plus d’im phénotype tumoral avait déjà été rapportée dans le cadre de la recherche de QTLs associés au cancer mammaire induit par oestrogènes. En effet, l’étude des croisements ACI X COP et ACI X BN a permis d’identifier au moins trois QTLs de ce type. De plus, les allèles de plusieurs de ces QTLs agissent dans des sens opposés selon le
phénotype étudié, citons par exemple les allèles des QTLs Emca3 (RN02) et EmcaS (RN05)
qui agissent dans le sens de la résistance ou dans le sens de la sensibilité selon que Ton considère le phénotype de latence ou de multiplicité tumorale (Gould et al., 2004; Schaffer et al., 2006; Shull, 2007). Notons que l’étude de QTLs associés au cancer mammaire induit par oestrogènes a également permis de mettre en évidence différents types de relations d’épistasie
entre plusieurs QTLs. Il a été montré d’une part que les allèles ACI des QTLs Emca4 (RN07)
et EmcaS (RN05) sont capables d’augmenter la multiplicité tumorale de manière
indépendante et d’autre part que T allèle de résistance BN au locus Emca4 est capable de
contrecarrer l’effet de sensibilité de Tallèle ACI du locus EmcaS. De la même manière que
dans notre étude, ces études ont également révélée que le locus Emca9 (RN018) est associé à
la sensibilité au cancer mammaire mais que Tallèle ACI de celui-ci n’a d’effet sur la
multiplicité tumorale qu’en présence de Tallèle BN au locus Emca7 (RN06) (Schaffer et al.,
2006).
Plusieurs études ont démontré l’existence de QTLs complexes chez le rat (Haag et al., 2003; Samuelson et al., 2005; Samuelson et al., 2007; Schaffer et al., 2006) (pour revue voir aussi (Szpirer and Szpirer, 2007)). Etant donné la très grande taille des régions identifiées (de 14.9 à 138.4 Mb), il est fort probable que Tun ou l’autre des QTLs contieime plus d’un gène de sensibilité au cancer mammaire et l’hypothèse de l’existence de QTLs complexes dans notre modèle ne doit pas être écartée. De plus, les effets des allèles des sous-QTLs pourraient agir dans des sens opposés et chacun des sous-QTLs pourraient faire l’objet de relations d’épistasie avec im autre QTL (ou sous-QTL) faisant partie ou non du même QTL complexe. Une des solutions pour répondre à la question des QTLs complexes est de créer et de caractériser des lignées sous-congéniques à partir des lignées congéniques établies. Ceci permettrait également de mieux comprendre les relations d’épistasie qui existent entre les différents QTLs. Nous avons entamé ce travail pour le locus au chromosome 5 en créant deux
Discussion lignées sous-congéniques. Ce travail s’est achevé en toute fin de thèse et nous n’avons pas eu le temps de caractériser ces lignées.
3. Etude de gènes candidats
Lorsque l’existence d’un QTL associé à un phénotype est confirmée, il s’agit finalement d’identifier le ou les gènes responsables du phénotype étudié. Cependant la taille des régions qui contieiment chacun des QTLs dont nous avons confirmé l’effet sur le phénotype de sensibilité au cancer mammaire est élevée (de 14.9 à 138.4 Mb), ce qui rend l’application de la méthode classique du gène candidat peu efficace, étant donné le très grand nombre de gènes contenus dans chacune des régions d’intérêt.
L’approche générale de la présente étude a consisté en une combinaison d’approches complémentaires : l’étude de lignées congéniques, l’application de la méthode du gène candidat transcriptiormelle par l’analyse à grande échelle des transcriptomes des lignées parentales et l’application de la méthode du gène candidat positionnel. Bien que cette démarche ne permette pas d’établir une liste exhaustive de gènes candidats (en effet, elle oublie notamment les gènes dont des modifications de séquence influencent la fonction des protéines et non les taux de transcription et les gènes régulés par la voie des microRNAs) elle s’est avérée être intéressante dans le cadre de ce travail pour limiter le nombre de gènes candidats à analyser. La liste des gènes potentiellement candidats associés à notre modèle a été réduite de plusieurs centaines de gènes à 27 gènes. La candidature de sept d’entre eux a été testée dans le présent travail en comparant leur taux d’expression relatifs dans les différentes lignées congéniques étudiées.
Parmi les sept gènes dont nous avons testé la candidature, deux ont vu leur taux
d’expression associé à la résistance au cancer mammaire : les gènes Ccl2 et Acaa2. Il est peu
probable que ces gènes soient des gènes causaux mais leur régulation pourrait être indirecte et refléter un changement global de l’état du tissu mammaire, par exemple un changement dans l’état de différenciation des glandes mammaires. Un effet général de l’allèle WKY sur l’état de différenciation de la glande mammaire avait déjà été rapporté lors d’une étude menée au laboratoire (Lella et al., 2007).
De manière intéressante, deux gènes, Pla2g2a et Pfnl, sont régulés par un
déterminant génétique situé sur le même chromosome (« synténie » au sens original de ce
terme), ce qui suggère que l’effet de régulation pourrait être un effet agissant en cis. La
phospholipase sécrétée Pla2g2a (chromosome 5) semble jouer différents rôles dans les maladies humaines, incluant le cancer du colon, les maladies coronariennes et l’inflammation
(Touqui et al., 2001 ; (Cormier et al., 1997). De plus, une expression élevée du gène Pla2g2a
a été rapportée dans plusieurs types de cancer dont celui de la prostate et du pancréas (Jiang et 54
Discussion
al., 2002; Kashiwagi et al., 1999). Le lien le plus important entre le gène Pla2g2a et le cancer
vient d’études génétiques chez la souris : il a été montré que l’homologue murin de Pla2g2a,
Moml (modifier of Mini) réduit considérablement la sensibilité au cancer intestinal chez les
souris APC min/+, un modèle murin de la polypose familiale (Cormier et al., 1997; Dietrich et
al., 1993; MacPhee et al., 1995). Il est à noter que la séquence du gène Pla2g2a avait été
étudiée au laboratoire par D. Stieber. L’existence de quatre polymorphismes de séquence entre les lignées parentales SPRD-Cu3 et WKY a été révélée dans la région 3’UTR. Cependant, les polymorphismes identifiés ne sont ni localisés dans des régions fortement conservées entre les espèces, ni dans des régions prédites d’hybridation de miRNAs, ce qui plaide en faveur de l’hypothèse que ces mutations sont silencieuses. L’étude devra donc être élargie aux séquences promotrices et introniques du gène. Il est tout à fait envisageable que ce gène puisse jouer un rôle dans le cadre de la sensibilité au cancer mammaire, toutefois étant
donné qu’il constitue une des bornes du QTL Mcstml, il est peu probable qu’il constitue un
gène causal dans notre modèle.
Le deuxième gène dont les taux d’expression et la présence de l’allèle WKY du QTL
dans lequel il est localisé montre un effet de synténie est le gène de la profiline 1 (Pftl)
(chromosome 10). Les profilines sont impliquées dans de nombreuses cascades de réactions. L’importance des profilines dans le processus de prolifération et de différenciation des cellules normales a été documentée dans des études montrant que des disfonctionnements de gènes de profiline mènent à une diminution de la mobilité et de la croissance des cellules (Haugwitz et al., 1994; Magdolen et al., 1988). De manière intéressante, il a également été montré que des faibles taux de profilines sont critiques pour la différenciation des cellules épithéliales humaines. Plus particulièrement, des études ont souligné l’importance du gène
Pfnl dans le processus de différenciation des tissus humains. Ces études ont montré que des
cellules humaines dont le taux d’expression du gène est bas adoptent im phénotype non-
tumorigénique lorsque le taux d’expression du gène Pjhl augmente (Janke et al., 2000).
Cependant, dans notre étude nous avons pu montrer que le gène Pfnl est sous-exprimé dans la
lignée WKY résistante (et dans la lignée congénique ClO.Mcstal) par rapport à la lignée sensible SPRD-Cu3.
La présente étude de gènes candidats a donc permis de mettre en évidence deux modes
d’expression dans les gènes localisés dans les QTLs Mcstml, Mcstm2!Mcsta2 et Mcstal. Le
premier est complexe et refléterait un état global de la glande mammaire. Dans le deuxième cas, il semble que les éléments régulateurs, qui peuvent être désignés comme des QTLs d’expression ou eQTLs sont localisés sur le même chromosome que les gènes structurels en question. Les éléments régulateurs et les gènes seraient donc synténiques et il semble que les eQTLs soient des eQTLs agissant en cis.
Discussion
4. Conclusion
L’étude réalisée dans le présent travail a permis d’assurer l’existence de cinq locus impliqués dans la détermination de la sensibilité au cancer mammaire chimiquement induit
chez le rat : McstmS (RNOl), Mcstml (RN05), Mcstll (RN09), Mcstal (RNOlO) et
Mcstm2/Mcsta2 (RNOl8). Chacun de ces locus a été associé à un ou plusieurs des trois phénotypes tumoraux. Nous avons également pu mettre en évidence deux effets épistatiques
contrastés impliquant le locus Mcstml (RN05). Nous avons pu montré que les allèles WKY
des QTLs localisés sur les chromosomes 5 et 18 agissent de manière synergique pour moduler la vitesse de croissance et de manière non additive lorsque l’on considère le phénotype de
multiplicité tumorale. Dans ce dernier cas, l’action de l’allèle WKY du locus Mcstm2 est
masquée par un ou plusieurs gènes localisés au locus Mcstml.
Le problème de l’identification des gènes qui sous-tendent les QTLs identifiés a été abordé en combinant les résultats de l’étude des lignées congéniques et les résultats d’vme analyse de profils d’expression génique. Ceci nous a permis d’établir une liste restreinte de gènes candidats positionnels et fonctionnels. Nous avons testé la candidature de sept d’entre
eux dont les gènes Pla2g2a (RN05) et Pfnl (RNOlO). De manière intéressante l’étude des
taux d’expression de ces gènes a permis de mettre en évidence que l’expression de ceux-ci est
modulée par des eQTLs agissant en cis. Dans un deuxième temps nous avons amorcé la
dissection des QTLs identifiés en réalisant des lignées sous-congéniques de la lignée