Matériel et méthodes
bases de données RGD (Rat Genome Database); http://rgd.mcw.edu et Ensembl Genome
Browser : http://www.esembl.org/index.html.
Table 15 : Liste des marqueurs analysés pour des éventuelles pertes d’hétérozygotie Chromosome
RNO
Marqueur
RNOl DlRat245, DlRat246, DlRat327, DlRatl, DlRat4, DlRat252, DlRatlS, DlRat20, DlRat93, DlArb33, DlRat260, DlArb36, DlRat410
RNOl DlRat324, DlRat306, DlRatSl, DlRat88
RN02 D2Mit29, D2Uwml5, D2Got2, D2Rat6, D2Gotl4, D2Rat38, D2Rat307, D2Rat4, D2Ratl4
RN05 D5Ratl24, D5Rat209, D5Ratl90, D5Ratl30, D5Rat2, DSRatlOO, D5Rat92, D5Ratl96, D5Rat26, D5Rat39
RN09 D9Rat41, D9Ratl39, D9Ratl58
RNOlO D10Rat47, D10Rat71, D10Ratll6, D10Ratl9, D10Rat97, D10Rat203
RNOl 8 D18Ratl02, D18Rat55, D18Woxl6, D18Rat89, D18Wox6, D18Ratll, D18Rat45, D18Rat44, D18Woxl3
Les PCR ont été effectuées sur l’ADN génomique selon le protocole « GeneScan »
décrit précédemment. Ensuite, les échantillons ont été analysés par électrophorèse capillaire
en utilisant un séquenceur automatique à capillaires 3100 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems) qui permet la séparation et la détection de produits PCR fluorochromés. Nous
avons ensuite traité les données issues de ces analyses grâce au programme de génotypage
Genotyper (Applied Biosystems) et ainsi pu comparé les rapports allèliques dans le tissu sain
et dans la tumeur pour chaque marqueur dans toutes les paires d’échantillons. Notons que les
paires d’échantillons Foie/Tumeur ont été traitées simultanément de l’extraction à
l’électrophorèse afin d’éviter des biais d’analyse.
2.2.2 Séquençage et détection des SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Les réactions PCR ont été réalisées grâce à l’utilisation du kit « Expand High Fidelity
PCR System » (Cat. Num. 1732640. Roche). Les amorces ont été obtenues chez Sigma-
Aldrich.
-Séquence (5’-3’) des paires d’amorces utilisées pour l’analyse du marqueur DlRatl :
(1) GAGAAAAACACAGCAAAGGAC / TATGATTGACCTACTCCTGC.
(2) ACCCAATGAAGTTTAGGCAAG / TACCGAGTCAATGTGTCTTCT.
(3) GGCACAGATGAAGACAGAAC / GTCCATCACCTTAGTCAATA.
1. La première étape est l’hybridation d’une amorce de séquence à un produit PCR simple brin. Celui- ci est ensuite incubé en présence de plusieurs enzymes et substrats.
2. Ajout d’un des quatre déoxynucléotides triphosphates (dNTP). L’ADN polymérase catalyse l’incorporation du nucléotide si celui-ci est complémentaire à la base du brin modèle. Chaque incorporation est accompagnée par un largage pyrophosphate (PPi) en quantité proportionnelle au taux d’incorporation.
3. L’ATP sulfurylase converti
quantitativement le PPi présent en ATP. l’ATP généré permet la conversion de luciférine en oxyluciferine par la luciférase. Cette réaction génère un taux de lumière visible proportionnel à la quantité d’ATP présent. La lumière produite est alors captée
Step 2
(DNA)n + dNTP Polymerase ■>(DNA)^^.,+ PPi
step 3
Sulfurylase APS+PPi ATP
luciferin oxyluciferin
Nucléotide incorporation generates light seen as a peak in the Pyrogram
Luciferase
ATP
Ligri^^ O
Time
Matériel et méthodes
-Séquence (5’-3’) des paires d’amorces utilisées pour l’analyse du marqueur D5Ratl90 :
(1) CGAAAGGCAACGACAATGATA / TGGCACAGGCTTCAAATCC.
(2) GAACCTCTAAACCGTAAGCC / CCTGTCCAAACCAACTCAAG.
(3) TAACCACCTAACCATCTGCC / CATTCTTTGTTTTGCGTTTGTA .
(4) TTTCCTTCCTGTCTGCCTC / ACGAATACAGGCAGGGAAAG.
Les produits PCR à séquencer ont été séparés sur gels d’agarose 1.25%. Les bandes
contenant les produits d’intérêt ont été récupérées et les produits PCR ont été purifiés sur
colonne en utilisant le kit « DNA Gel Extraction » (Cat. Num. LSKG EL050. Millipore). Les
réactions de séquence ont été effectuées grâce à l’utilisation du kit « BigDye Terminator V3.1
Cycle Sequencing V2» (Cat. Num. 4337456. Applied Biosystems). Les séquences ont été
réalisées par la société BioVallée. Les séquences ont ensuite été analysées grâce à
l’utilisation de la suite de logiciel Vector NTI 9.0 (Invitrogen).
2.2.3 Pyroséquençage PSQ 96MA Systems (Biotage)
La technique de pyroséquençage est une technique de séquençage de courtes régions
d’ADN (environ 50 pb). Au cours de la réaction de séquence, une cascade enzymatique abouti
à la formation de lumière visible lorsqu’un nucléotide est incorporé. Il est donc possible de
quantifier l’incorporation des nucléotides et ainsi de réaliser un analyse quantitative des
séquences produites. Cette technique est utilisée dans le cadre de la recherche de SNP (Single
Nucléotide Polymorphism), de génotypage d’échantillons et grâce à ses propriétés
quantitatives, dans la recherche de perte d’hétérozygotie. Le principe de la technique de
pyroséquençage est détaillé dans la
Figure 18.Les SNP qui ont servi à la quantification des
allèles ont été nommés SNP-DlRatl et SNP-D5Ratl9, leur position est reprise dans
l’Annexei. Ces SNP ont été détectés lors de la mise au point de la méthode de discrimination
allèlique décrite ci-dessus.
2.2.3.1 Réaction PCR
Les réactions PCR ont été réalisées grâce à l’utilisation de kit « FastStart High Fidelity
PCR System» (Cat. Num. 03553426001. Roche). Deux particularités sont à mentionner:
pour chaque réaction, une des deux amorces était biotinilée et le nombre de cycle a été
suffisant pour consommer toutes les amorces. Les amorces ont été obtenues chez Sigma-
Aldrich. La séquence des amorces utilisées est reprise dans
VAnnexe 3.-Séquence (5’-3’) des amorces utilisées pour l’analyse du marqueur DlRatl :
Matériel et méthodes
D1 Rat 1 .r.biotin (TGGAGGCC AGC ATGAGCTATAA)
D1 Rat 1 .f (ATTGTGC AAATC AACTGGTCTGAA).
-Séquence (5’-3’) des amorces utilisées pour l’analyse du marqueur D5Ratl90 :
DSRatl 90.r.biotin (TTGCGTTTGTATATGTGCAGGTC)
DSRat 190.f (TTTGGTC AC ACGCTTGTTTAATA).
2.2.3.2 Immobilisation des brins biotinilés
L’immobilisation du brin biotinilé a été effectuée grâce à l’utilisation du kit « Pyro
Gold Reagents PSQ 96 MA » (Biotage). Elle s’effectue à l’aide de billes de sépharose
couplées à la streptavidine (Strepatavidin Sepharose HP, Amersham Biosciences). Le
mélange du produit PCR avec les billes se fait sur plaque 96 puits. Tous les puits de la plaque
sont aspirés à l’aide du Vacuum Prep Tool (Biotage). Les produits sont d’abord lavés à
Téthanol 70% ensuite avec ime solution nettoyante. Après dénaturation des brins grâce à
l’utilisation d’une solution de NaOH dénaturante, seuls les brins biotinilés couplés aux billes
restent sur les filtres. Les brins biotinilés sont resuspendus dans une solution tampon en
présence de l’amorce de séquence puis suit une étape d’hybridation à 80°C.
2.2.3.3 La réaction de pyroséquence