UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Médecine
Laboratoire d’Anatomie Pathologique Hôpital Erasme
IMPLICATION DES GALECTINES-1 ET -3 DANS L’ANGIOGENESE ET EN
PARTICULIER EN CE QUI CONCERNE LES LYMPHOMES
D’Haene Nicky
Promoteur : Pr I. Salmon
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Médicales
Année Académique 2010-2011
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Médecine
Laboratoire d’Anatomie Pathologique Hôpital Erasme
IMPLICATION DES GALECTINES-1 ET -3 DANS L’ANGIOGENESE ET EN
PARTICULIER EN CE QUI CONCERNE LES LYMPHOMES
D’Haene Nicky
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Médicales
Année Académique 2010-2011
Composition du jury : J. Devière, Président, I. Salmon, Secrétaire, D. Bron, D. Communi, D. Larsimont.
Experts extérieurs : O. Feron et M. Mareel.
Remerciements
J’aimerais tout d’abord remercier le Professeur Isabelle Salmon sans qui ce travail n’aurait jamais été réalisé. Merci de m’avoir prise sous votre aile dès le quatrième doctorat et de m’avoir fait découvrir le monde de la recherche. Merci également pour toutes les opportunités que vous m’avez offertes. Je me souviendrai longtemps de cette phrase dite à l’occasion de l’une de nos nombreuses réunions : « Ce travail, c’est ton bébé ».
Merci de m’avoir aidée à amener ce projet jusqu’au bout, même si ce fut parfois difficile.
Un tout grand merci également au professeur Christine Decaestecker. Merci pour tes précieux conseils et ta rigueur de mathématicienne !
Je tiens également à remercier tout le laboratoire d’Anatomie Pathologique pour votre aide et votre soutien. Je suis heureuse de faire partie de cette équipe !
Un merci tout particulier à Isabelle Roland, Flavienne Sandras, Audrey Verrellen, Marie Le Mercier, Nancy De Nève, Lionel Larbanoix, Xavier Moles-Lopez, Georges Lacroix, Christophe Duponchelle pour votre aide technique et scientifique ainsi que votre soutien sur le plan personnel.
Merci à Nathalie Watteau pour la relecture et la mise en page de ce travail.
Merci également à tout le staff médical du labo pour votre soutien : Myriam Remmelink, Pieter Demetter, Sandrine Rorive, Calliope Maris, Xavier Catteau, Laurine Verset et Anne- Laure Trepant. Je tiens aussi à remercier Valérie Ségers pour son soutien et sa compréhension.
Je tiens également à remercier Linda Baum et son équipe pour le stage très instructif que j’ai réalisé au sein de son laboratoire.
Je souhaite aussi remercier mes compagnons de bureau ; Calliope Maris et Sébastien Sauvage d’avoir supporté, ces derniers mois, mes hauts et mes bas. Merci Sébastien pour l’aide que tu m’as apportée sur le plan technique et scientifique. Merci Calliope de ton soutien, j’espère pouvoir t’apporter la même aide dans un futur proche...
Merci également à toute ma famille, mes parents, ma sœur et ma belle-famille, d’avoir toujours été à mes cotés. Et depuis peu, merci Sébastien d’être là et d’être toi.
Enfin, merci à toi, Pierre-Yves pour ton réconfort, ta présence et surtout ta patience de ces derniers mois.
Ce travail n’aurait pu être réalisé sans le soutien financier que le Fonds Erasme et le Fonds Yvonne Boël m’ont accordé.
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS... 6
RESUME... 8
CHAPITRE I: INTRODUCTION... 10
1. LES LYMPHOMES... 10
1.1 Les lymphomes systémiques... 10
1.1.1 Epidémiologie ... 10
1.1.2 Classification... 10
1.1.3 Anatomopathologie ... 11
1.1.4 Clinique ... 13
1.2 Les lymphomes primitifs du système nerveux central ... 14
1.2.1 Epidémiologie ... 14
1.2.2 Anatomopathologie ... 14
1.2.3 Clinique ... 15
2. LES GALECTINES ... 16
2.1 Généralités... 16
2.2 Ligands des galectines-1 et -3 ... 17
2.3 Fonctions des galectines-1 et -3 ... 17
2.3.1 Croissance tumorale ... 18
2.3.2 Potentiel métastatique ... 18
2.3.3 Réponse immune ... 19
2.4 Implications des galectines-1 et -3 dans les lymphomes... 19
2.4.1 Galectine-1 ... 20
2.4.2 Galectine-3 ... 21
3. L’ANGIOGENESE ... 23
3.1 Définition et description... 23
3.1.1 Angiogenèse physiologique ... 23
3.1.2 Angiogenèse pathologique tumorale... 25
3.2 Le système VEGF/VEGF-récepteurs ... 30
3.2.1 Les récepteurs au VEGF ... 30
3.2.2 Les corécepteurs: neuropilines 1 et 2 et heparan sulfate proteoglycans... 33
3.2.3 Les ligands: la famille du VEGF... 34
3.2.4 Effets biologiques du système VEGF/VEGFR sur les cellules endothéliales 34 3.3 Implication des galectines-1 et -3 dans l’angiogenèse ... 36
3.3.1 Rôles des galectines-1 et -3 intracellulaires ... 37
3.3.2 Rôles des galectines-1 et -3 extracellulaires ... 38
3.3.3 Expression des galectines-1 et -3 dans les cellules endothéliales ... 38
3.4 Angiogenèse et lymphomes ... 39
3.4.1 Lymphomes non hodgkiniens systémiques... 39
3.4.2 Lymphomes de Hodgkin ... 43
3.4.3 Lymphomes primitifs du système nerveux central ... 44
3.5 Applications thérapeutiques ... 45
3.5.1 Thérapies ciblant le système VEGF/VEGFR... 45
3.5.2 Limitations aux traitements anti-angiogéniques ... 47
CHAPITRE II: OBJECTIF DU TRAVAIL... 48
CHAPITRE III: MATERIEL ET METHODES... 49
1. MATERIEL... 49
1.1 Etudes I et II ... 49
1.1.1 Matériel anatomopathologique... 49
1.1.2 Données cliniques ... 49
1.2 Etude III... 50
1.2.1 Lignées cellulaires... 50
1.2.2 Matériel anatomopathologique... 51
2. METHODES ... 51
2.1 Expression de gènes ... 51
2.1.1 RT-PCR quantitative ... 51
2.1.2 Les micropuces à ADN ... 52
2.2 Expression de protéines... 53
2.2.1 Western Blots ... 53
2.2.2 Immunohistochimie... 53
2.2.3 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ... 55
2.3 Critères morphologiques pronostiques... 56
2.4 Croissance cellulaire ... 56
2.5 Formation de tubes ... 56
2.6 Statistiques ... 57
CHAPITRE IV: RESULTATS... 60
1. Etude I : The differential expression of galectin-1 and galectin-3 in normal lymphoid tissue and non-Hodgkin and Hodgkin lymphomas ... 60
2. Etude II : Endothelial hyperplasia and endothelial galectin-3 expression are prognostic factors in primary central nervous system lymphomas ... 66
3. Etude III : Involvement of vascular endothelial growth factor receptor-1 and -2 in differential response of endothelial cells to galectin-1 and galectin-3... 71
CHAPITRE V: DISCUSSION... 78
CHAPITRE VI: CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES... 90
REFERENCES... 92
ANNEXES... 113
THESE ANNEXE... 114
ABREVIATIONS
ABC: activated B-cell
ADN: acide désoxyribonucléique ADNc: ADN complémentaire Akt: protéine kinase B ARN: acide ribonucléique
ATCC: American Type Culture Collection ATP: adénosine triphosphate
Bcl-2: B-cell CLL/lymphoma 2 Bcl-6: B-cell CLL/lymphoma 6 bFGF: basic fibroblast growth factor CD: cluster de différenciation
CE: cellule endothéliale
CRD: carbohydrate-recognition domain CT: chimiothérapie
DAG: diacylglycerol
DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma - lymphome B diffus à grandes cellules DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMV: densité microvasculaire EBV: Epstein-Barr virus
ECOG: Eastern Cooperative Oncology Group EGF: epidermal growth factor
EGFR: epidermal growth factor receptor ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay eNOS: endothelial NO synthase
ERK: extracellular signal regulated kinase FAK: focal adhesion kinase
FDA: Food and Drug Administration Flt-1: fms-like tyrosine kinase Flt-4: fms-related tyrosine kinase 4 GC: germinal centre
GEO: Gene Expression Omnibus
GIST: gastrointestinal stromal tumor - tumeur stromale gastro-intestinale HEC: hyperplasie endothéliocapillaire
HER2: v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 HIF: hypoxia-inducible factor
H-Ras: v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog HRE: hypoxia-responsive element
Hsp27: heat shock protein 27
HUVEC: cellules endothéliales de veine ombilicale humaine IARC: Agence Internationale pour la Recherche contre le Cancer ICAM-1: intercellular adhesion molecule 1
IELSG: International Extranodal Lymphoma Study Group Ig: immunoglobuline
IGF: insulin-like growth factor IL: interleukine
IPI: international prognostic index IPS: international prognostic score JNK: c-Jun NH2-terminal kinase KDR: kinase insert domain receptor
KIT: v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog
KO: knock out
KPS: Karnofsky Performance Status
K-ras: v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog LA: lymphome anaplasique
LCR: liquide céphalo-rachidien LDH: lactate déshydrogénase LF: lymphome folliculaire LH: lymphome de Hodgkin
LLC/LL: leucémie lymphoïde chronique/lymphome lymphocytique LM: lymphome du manteau
LNH: lymphome non hodgkinien LP: lymphocyte predominant
LPSNC: lymphome primitif du système nerveux central MAP: mitogen-activated protein
MEC: matrice extracellulaire MEK: MAPK/ERK kinase
MMP: métalloprotéase matricielle
MSKCC: Memorial Sloan-Kettering Cancer Center mTOR: mammalian target of rapamycin
NCCN: National Comprehensive Cancer Network NO: oxyde nitrique
NWGR: asparagine- tryptophane- glycine- arginine OMS: Organisation Mondiale de la Santé
PCR: polymerase chain reaction
PDGFR: platelet-derived growth factor receptor PH: pleckstrin homology
PI-4,5-P2: phosphatidylinositol 4,5 biphosphate PI3K: phosphoinositide 3’ kinase
PKC: protéine kinase C PLC- γ: phospholipase C γ PlGF: placental growth factor PS: performance status PTB: phosphotyrosine binding
Rac: ras-related C3 botulinum toxin substrate 1
Raf: v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1 Rho: ras homolog
RT: radiothérapie
RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction RVPI: infiltrat lymphocytaire T périvasculaire
Shb: Src homology 2 domain containing adaptor protein B SH2: Src homology 2
SNC: système nerveux central
Src: v-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral oncogene homolog sVEGFR1: isoforme soluble du VEGFR1
TAECs: tumor-associated endothelial cells TGF: transforming growth factor
TMA: tissue microarray TSAd: T cell specific adapter
VE cadhérine: vascular endothelium cadhérine VEGF: vascular endothelial growth factor
VEGFR: vascular endothelial growth factor receptor
RESUME
Les lymphomes sont constitués de sous-groupes tumoraux définis par différents critères cliniques, morphologiques, immunophénotypiques et moléculaires. Néanmoins, même au sein d’un sous-groupe, il existe une grande hétérogénéité dans l’évolution clinique des patients, ce qui rend leur prise en charge difficile. Ceci souligne l’importance de découvrir de nouveaux biomarqueurs pronostiques qui amélioreraient l’approche thérapeutique personnalisée.
La revue de la littérature fait apparaitre les galectines-1 et -3 comme des protéines impliquées dans le développement des cancers ainsi que dans la biologie des lymphocytes. Pourtant, au moment où nous avons débuté ce travail, peu de chercheurs s’étaient intéressés à l’implication de ces galectines dans les lymphomes.
Nous avons donc décidé d’évaluer le rôle diagnostique ou pronostique de la galectine-1 et de la galectine-3 dans les lymphomes.
La première étude a consisté en la caractérisation de l’expression immunohistochimique de ces deux galectines au sein d’une série clinique de lymphomes systémiques humains en comparaison au tissu lymphoïde normal.
En ce qui concerne la galectine-1, les cellules lymphomateuses l’expriment peu, de façon similaire à ce qui est observé pour les cellules lymphoïdes normales. Au contraire, les cellules endothéliales associées aux lymphomes sont caractérisées par une augmentation de l’expression de galectine-1 en comparaison aux cellules endothéliales normales. Cette expression endothéliale ne montre pas de relation avec les variables cliniques de notre étude mais est corrélée à la densité microvasculaire des lymphomes.
En ce qui concerne la galectine-3, les cellules lymphomateuses des lymphomes B diffus à grandes cellules se caractérisent par une expression plus élevée comparativement aux autres sous-groupes de lymphomes et aux cellules lymphoïdes normales. Cette expression de galectine-3 n’est pas associée aux variables cliniques dans notre étude. Contrairement à la galectine-1, la galectine-3 est exprimée de façon similaire par les cellules endothéliales des vaisseaux des tissus lymphoïdes normaux et des lymphomes.
Ces données suggèrent un rôle angiogénique de la galectine-1 dans les lymphomes systémiques.
Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’expression des galectines-1 et -3 au sein d’une série clinique de lymphomes primitifs du système nerveux central (LPSNC).
Nous avons observé que les profils d’expression des cellules lymphomateuses sont similaires pour les lymphomes systémiques et les LPSNC, caractérisés par une absence d’expression de galectine-1 et une expression variable de galectine-3.
A l’opposé, nous avons observé une expression endothéliale de ces galectines différente entre les lymphomes systémiques et les LPSNC. La galectine-1 n’est pas exprimée par les cellules endothéliales des vaisseaux des LPSNC. Par contre, la galectine-3 est exprimée par les cellules endothéliales de certains LPSNC. Cette expression est associée à un mauvais pronostic.
Nous avons également démontré que l’hyperplasie endothéliocapillaire est associée à une survie diminuée.
Cette hyperplasie endothéliocapillaire et/ou l’expression endothéliale de galectine-3 sont des facteurs pronostiques indépendants au sein de notre série de patients immunocompétents atteints de LPSNC et traités par chimiothérapie.
Au vu des résultats des deux premières études, nous pensons que les galectines-1 et -3 jouent un rôle dans l’angiogenèse des lymphomes. Ce rôle est très certainement complexe comme l’illustre la différence d’expression endothéliale de ces galectines entre les lymphomes systémiques et les LPSNC. Ces variations d’expressions selon l’organe hôte sont à intégrer avec la notion générale d’hétérogénéité des cellules endothéliales. Cette hétérogénéité s’observe également entre les cellules endothéliales des vaisseaux normaux et les cellules endothéliales des vaisseaux dans un contexte tumoral (TAECs - tumor-associated endothelial cells).
Suite à ces observations, nous avons décidé d’étudier l’implication des galectines-1 et -3 extracellulaires sur deux modèles in vitro de cellules endothéliales (cellules HUVEC et EA.hy926). La revue de la littérature nous a permis de poser l’hypothèse que la lignée EA.hy926 pourrait s’apparenter aux TAECs. La première partie de cette troisième étude a pour but de valider cette hypothèse. La comparaison morphologique des lignées EA.hy926 et HUVEC cultivées sur un substrat de matrigel a permis de montrer que les tubes formés par les cellules EA.hy926 sont plus hétérogènes comme ce que l’on peut observer dans les vaisseaux tumoraux. La comparaison des profils d’expression des gènes de ces deux lignées a mis en évidence que différents gènes surexprimés dans les TAECs le sont également dans les cellules EA.hy926. Les cellules EA.hy926 présentent un profil d’expression des récepteurs au VEGF (VEGFR- vascular endothelial growth factor receptor) caractérisé par un taux élevé de VEGFR1 et un faible taux de VEGFR2 en comparaison aux cellules HUVEC. L’analyse in vivo des VEGFRs au sein des cellules endothéliales de tissus humains normaux et tumoraux nous a permis de confirmer la surexpression de VEGFR1 par les TAECs. L’ensemble de ces résultats supportent donc notre hypothèse que la lignée EA.hy926 présente des caractéristiques plus proches des TAECs en comparaison à la lignée HUVEC.
Nous avons ensuite, dans la deuxième partie de cette troisième étude, analysé les effets respectifs de la galectine-1, de la galectine-3 et de leur combinaison sur ces deux lignées.
Nous avons observé que la galectine-1 extracellulaire dans notre modèle de cellules endothéliales normales (HUVEC) augmente la croissance cellulaire ainsi que la formation de tubes sans mise en évidence de phosphorylation significative de VEGFR1 ni de VEGFR2.
Dans notre modèle de TAECs (EA.hy926), la galectine-1 extracellulaire ne favorise pas la croissance cellulaire et est faiblement angiogénique via la phosphorylation du VEGFR2, sans phosphorylation du VEGFR1.
En ce qui concerne la galectine-3, nous avons observé dans nos deux modèles des résultats similaires, à savoir une absence d’effet sur la croissance cellulaire et un effet positif sur la formation de tubes s’accompagnant d’une phosphorylation de VEGFR2 sans phosphorylation de VEGFR1.
Le résultat le plus original consiste en la mise en évidence d’un effet synergique des deux galectines sur la croissance et la formation de tubes des cellules EA.hy926. Cet effet synergique s’accompagne d’une phosphorylation de VEGFR1 et de VEGFR2. Il est important de noter que l’activation de VEGFR1 n’a été observée que pour la lignée EA.hy926 et uniquement en présence des deux galectines.
Dans ces conditions, nous avons démontré que les voies de signalisation activées suite à l’ajout de ces galectines impliquent la voie de l’extracellular signal regulated kinase1/2 et de l’heat shock protein 27.
En conclusion, ce travail nous a donc permis, à partir de la caractérisation de l’expression de galectine-1 et -3 dans une série de lymphomes systémiques et cérébraux, de proposer un rôle angiogénique pour ces galectines. Les études in vitro ont souligné les rôles différents que joueraient ces galectines extracellulaires dans l’angiogenèse non tumorale et tumorale et l’implication du VEGFR1 dans l’angiogenèse tumorale.
CHAPITRE I: INTRODUCTION
1. LES LYMPHOMES
1.1 Les lymphomes systémiques
Les lymphomes, cancers du tissu lymphoïde, sont constitués de groupes et sous-groupes anatomocliniques; on distingue les lymphomes de Hodgkin (LH) et les lymphomes non hodgkiniens (LNH) qui sont constitués des LNH de type B et des LNH de type T.
1.1.1 Epidémiologie
Se rapportant aux estimations fournies pour 2008 par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et l’Agence Internationale pour la recherche contre le Cancer (IARC) (Ferlay et coll.
2010), les LNH représentent la 12ème cause de cancer chez l’homme et chez la femme. De l’ordre de 200 000 décès dans le monde peuvent être attribués chaque année aux lymphomes.
Plus de 79% de ces nouveaux cas sont des LNH de type B, dont le sous-groupe le plus fréquent est le lymphome B diffus à grande cellules (diffuse large B-cell lymphoma -DLBCL) (Figure 1), les LH représentant 8.6% de tous les lymphomes.
Le facteur de risque principal de développer un LNH de type B est la présence d’une immunodéficience ou d’une pathologie auto-immune. Différents agents infectieux ont également été impliqués dans le développement de différents sous-groupes de lymphome, par exemple l’Epstein-Barr virus (EBV) est associé à différents LNH de type B (Swerdlow et coll. 2008). Les facteurs de risque de développer un LH sont l’infection par EBV et l’immunosuppression (Ansell et Armitage 2006; Swerdlow et coll. 2008).
1.1.2 Classification
Reflet de la complexité de ces cancers, de nombreuses classifications des lymphomes se sont succédées au cours du temps (Jaffe et coll. 2008). La classification actuellement utilisée est celle adoptée par l’OMS dont la quatrième édition a été publiée en 2008 (Swerdlow et coll.
2008) (Table 1).
La ressemblance phénotypique entre les LNH et les différents stades de différenciation des lymphocyte B ou T est à la base de cette classification (LeBien et Tedder 2008; Swerdlow et coll. 2008). La différenciation des lymphocytes B est constituée de différents stades de
maturation illustrés en Figure 2. Parallèlement à cette différenciation des lymphocytes B normaux correspondent différents sous-groupes de LNH: (1) les lymphomes B lymphoblastiques s’apparentant aux lymphocytes B précurseurs de la moelle osseuse, (2) les lymphomes du manteau aux lymphocytes B naïfs, (3) les DLBCL aux centroblastes, (4) les lymphomes folliculaires (LF) aux centrocytes et centroblastes, (5) les lymphomes de la zone marginale aux lymphocytes B mémoire et (6) les myélomes aux plasmocytes (Swerdlow et coll. 2008).
Concernant les lymphomes T, les lymphomes T lymphoblastiques se développent à partir des cellules T précurseurs de la moelle et du thymus tandis que les lymphomes T périphériques se développent à partir des lymphocytes T du tissu lymphoïde périphérique (Swerdlow et coll.
2008).
1.1.3 Anatomopathologie
La classification de l’OMS repose sur l’intégration de critères cliniques, morphologiques, immunophénotypiques, cytogénétiques et moléculaires.
L’examen morphologique évalue les anomalies architecturales (compartiment du ganglion altéré, aspect nodulaire vs diffus), les caractéristiques cytologiques des cellules lymphomateuses (taille, aspect du noyau) et l’infiltrat réactionnel d’accompagnement (Higgins et coll. 2008). Les cellules lymphomateuses B et T tendent à se localiser et à se développer dans les compartiments ganglionnaires correspondant à leur stade de maturation.
Par exemple, les LF prolifèrent dans les zones B du ganglion lymphatique et prennent un aspect nodulaire/folliculaire. Au contraire, les LNH de type T se développent dans les régions paracorticales du ganglion.
L’immunophénotypage peut être réalisé par des examens immunohistochimiques et/ou de cytométrie de flux. Etant donné le nombre croissant de nouveaux antigènes associés aux lymphomes, il est important de sélectionner de manière judicieuse les anticorps utilisés. La combinaison d’immunomarquages demandés est déterminée sur base de l’aspect morphologique. Le cluster de différenciation (CD) 20 est exprimé du stade de différenciation du lymphocyte B naïf jusqu’au stade final de différenciation (avant la différenciation en plasmocytes) et est donc utilisé comme un marqueur pan B. Le CD3 est utilisé comme marqueur pan T puisqu’il est exprimé à partir de la différenciation thymique des lymphocytes T (Higgins et coll. 2008).
Aux examens morphologiques et immunohistochimiques, s’ajoutent les tests de biologie moléculaire car certains LNH de type B présentent des anomalies génétiques caractéristiques.
Les translocations représentent le mécanisme principal d’activation de proto-oncogènes (Evans et Hancock 2003). La Table 2 illustre les différentes translocations qui peuvent être mises en évidence dans les LNH.
Le diagnostic final de lymphome repose donc sur l’intégration des résultats de l’analyse morphologique, de l’immunophénotypage et des examens de biologie moléculaire.
1.1.3.1 Les LNH
Nous employons un algorithme d’utilisation de techniques complémentaires qui se base sur des critères morphologiques afin de diagnostiquer les LNH de type B (Figure 3) (Harris et coll. 2001; Higgins et coll. 2008). La taille des cellules lymphomateuses permet d’effectuer une première distinction entre les sous-groupes.
Les proliférations de cellules tumorales de petite taille incluent différents sous-groupes qui peuvent, en partie, se différencier par leur architecture: le lymphome du manteau (LM), le lymphome de la zone marginale et le LF qui présentent une architecture nodulaire et la leucémie lymphoïde chronique/lymphome lymphocytique (LLC/LL) qui présente une architecture diffuse. De plus, ces sous-groupes sont caractérisés par un aspect des cellules lymphomateuses et un immunophénotypage différents: les cellules lymphomateuses du LM présentent un aspect centrocytique et sont CD5+ et cycline D1+. Le lymphome de la zone marginale est caractérisé par des cellules centrocytiques CD5- CD10- CD43+. Le LF est typiquement composé de deux types de cellules lymphomateuses d’aspect centrocytique et centroblastique, CD5-, CD10+, Bcl-2+ et Bcl-6+. Cependant, 5 à 30% des LF peuvent aussi être CD10-. Les cellules du LLC/LL présentent un aspect de petit lymphocyte CD5+ (Higgins et coll. 2008).
Face à une prolifération tumorale de cellules de grande taille, il faut d’abord différencier les proliférations tumorales lymphomateuses des tumeurs non lymphoïdes (anticorps anti-pan kératine pour les tumeurs épithéliales, marqueurs mélanocytaires pour les mélanomes, marqueurs pan B et pan T). Les LNH de type B caractérisés par des cellules de grande taille incluent le DLBCL et le lymphome de Burkitt. Différents panels d’immunomarquages permettent de différencier ces deux sous-groupes (Figure 3). Ils présentent tous les deux une architecture diffuse ; le lymphome de Burkitt présente classiquement un aspect en « ciel étoilé» lié à la présence de nombreux macrophages.
Les lymphomes T sont plus difficiles à diagnostiquer du fait de leur rareté et qu’ils peuvent présenter une morphologie de type « réactionnel » avec une population faite de grands et petits lymphocytes (Higgins et coll. 2008).
1.1.3.2 Les LH
Les critères diagnostiques d’un LH de forme classique reposent sur la présence de cellules tumorales mononucléées de Hodgkin ou multinucléées de Reed-Sternberg distribuées au sein d’un infiltrat mixte non néoplasique constitué de lymphocytes, de polynucléaires éosinophiles, de polynucléaires neutrophiles, d’histiocytes, de plasmocytes et de fibroblastes (Figure 4). La composition relative de cet infiltrat réactionnel a permis de subdiviser le LH de forme classique en quatre sous-groupes: riche en lymphocytes, nodulaire sclérosant, à cellularité mixte et à déplétion lymphocytaire. Les cellules de Reed-Sternberg sont CD30+ et CD15 +/- et n’expriment plus les marqueurs de différenciation lymphocytaire B (CD20, Oct-2 et BOB.1) (Swerdlow et coll. 2008).
A ces quatre formes de LH classiques s’ajoute une forme plus rare, le LH à prédominance lymphocytaire nodulaire. Il se définit comme une prolifération d’architecture nodulaire, de cellules tumorales de grande taille au noyau irrégulier, appelées cellules pop-corn ou cellules LP (lymphocyte predominant), distribuées au sein d’un réseau de cellules dendritiques contenant des lymphocytes et des histiocytes réactionnels. Ces cellules LP expriment les marqueurs de différenciation lymphocytaire B (CD20, Oct-2, BOB.1) (Swerdlow et coll.
2008).
1.1.4 Clinique
1.1.4.1 Présentation clinique
Parallèlement à l’hétérogénéité biologique des lymphomes, on observe des présentations cliniques très différentes qui peuvent rendre le diagnostic difficile. Le plus fréquemment, le patient a constaté l’apparition d’adénopathies qui peuvent être associées aux symptômes
« B », c’est-à-dire fièvre, perte de poids et sueurs nocturnes.
On distingue classiquement les lymphomes indolents (LF, LLC/LL), se présentant de façon insidieuse, des lymphomes agressifs (DLBCL, lymphome de Burkitt, LM, lymphomes T), caractérisés par une présentation clinique plus aiguë.
Le stade d’Ann Arbor est utilisé pour stratifier les patients en fonction de l’importance de leur atteinte par le lymphome (Table 3). Les stades I et II sont considérés comme localisés, tandis que les stades III et IV comme disséminés (Evans et Hancock 2003).
1.1.4.2 Pronostic
Les LNH
L’index pronostique international (IPI) est le score pronostique le plus utilisé pour les patients atteints de LNH (Tables 4 et 5). Un score de 0 ou 1 est considéré comme de faible risque, un score de 2 ou 3 d’intermédiaire et un score de 4 ou 5 de haut risque.
Différentes variantes de ce score ont été proposées pour des groupes de patients plus restreints (jeune âge, lymphome folliculaire,…) (Ansell et Armitage 2005). De plus, différents facteurs pronostiques cliniques et biologiques plus ou moins spécifiques de chaque sous-groupe ont été décrits mais sont peu utilisés en pratique clinique.
Les LH
Il est important de différencier les LH classiques des LH à prédominance lymphocytaire nodulaire. Ces derniers se comportent de façon plus indolente et, aux stades localisés, sont de meilleur pronostic (Ansell et Armitage 2006; Hoppe 2010).
Le Score Pronostique International (IPS) est le score pronostique le plus utilisé pour les patients atteints de LH (Table 6) (Hasenclever et Diehl 1998).
1.2 Les lymphomes primitifs du système nerveux central 1.2.1 Epidémiologie
Les lymphomes primitifs du SNC (LPSNC), LNH de localisation exclusive dans le SNC, représentent moins de 1% des LNH et à peu près 2 à 3% des tumeurs cérébrales (Swerdlow et coll. 2008). Leur incidence a pratiquement triplé entre 1973 et 1984 (Batchelor et Loeffler 2006) et dans les pays occidentaux, elle est estimée à 5 par million d’habitants par an (Sierra del Rio et coll. 2009).
Les patients présentant une immunodéficience congénitale ou acquise présentent un risque élevé de développer un LPSNC et, dans ce groupe de patients, le LPSNC représente la tumeur cérébrale la plus fréquente.
1.2.2 Anatomopathologie
Les LPSNC sont à 95% des DLBCL localisés exclusivement dans le SNC. Quelques rares cas de lymphomes T ou de lymphomes B indolents ont été décrits (Sierra del Rio et coll. 2009).
La classification de l’OMS de 2008 a isolé une nouvelle entité, le DLBCL primitif du SNC,
définie comme un DLBCL localisé en intracérébral ou en intra-oculaire en excluant les disséminations des lymphomes systémiques et les lymphomes des patients immunocompromis (Swerdlow et coll. 2008). De façon caractéristique, les cellules lymphomateuses ressemblent à des centroblastes, expriment les marqueurs lymphocytaires B et sont localisées autour des vaisseaux (Figure 5).
1.2.3 Clinique
1.2.3.1 Présentation clinique
Comme pour toute lésion cérébrale, la symptomatologie est fonction de la localisation. Les études statistiques rapportent que 70% des patients présentent comme symptômes des signes neurologiques focaux ou des troubles neuropsychiatriques associés ou non à des signes d’hypertension intracrânienne. Des crises comitiales partielles ou généralisées peuvent être le tableau clinique initial et ce plus particulièrement chez les patients immunocompromis (Batchelor et Loeffler 2006; Hochberg et coll. 2007).
1.2.3.2 Pronostic
Les patients atteints de LPSNC présentent un mauvais pronostic ; cependant, le développement de nouveaux schémas thérapeutiques ont permis de guérir 20 à 30% des patients immunocompétents. Le pronostic des patients immunocompromis atteints de LPSNC reste très mauvais (Kasamon et Ambinder 2005; Sierra del Rio et coll. 2009).
Seuls l’âge et le performance status (PS) (Table 7) sont internationalement reconnus comme facteurs pronostiques.
Deux groupes ont proposé des scores pronostiques préopératoires basés sur des facteurs cliniques et biologiques pour les LPSNC chez les patients immunocompétents: l’International Extranodal Lymphoma Study Group (IELSG) (Ferreri et coll. 2003) et le Memorial Sloan- Kettering Cancer Center (MSKCC) (Abrey et coll. 2006) (Tables 8 et 9). Ces scores sont actuellement encore relativement peu appliqués en clinique et devraient être validés par des études indépendantes.
Différents marqueurs ont été proposés comme facteurs pronostiques, tel que l’expression du B-cell CLL/lymphoma 6 (Bcl-6) et l’infiltrat lymphocytaire T périvasculaire (Braaten et coll.
2003; Ponzoni et coll. 2007). A ce jour, aucun marqueur morphologique ou issu de la biologie moléculaire n’est reconnu internationalement comme facteur pronostique des LPSNC.
2. LES GALECTINES
2.1 Généralités
Les galectines, membres de la famille des lectines, sont des protéines caractérisées par un domaine de liaison aux hydrates de carbone (CRD: carbohydrate-recognition domain), d’environ 130 acides aminés, qui présente une affinité pour les résidus β-galactosides.
Ce sont des protéines hautement conservées au cours de l’évolution et retrouvées dans des organismes allant du nématode au mammifère. Chez les mammifères, 15 galectines ont été identifiées; chez l’humain, 12 gènes de galectines, dont 2 pour la galectine-9, sont trouvés (Varki et coll. 2009).
Les galectines sont classées selon leur structure biochimique en 3 groupes (Figure 6):
1. le groupe prototypique dont les membres sont caractérisés par un seul CRD et qui peuvent former des homodimères (galectine-1, -2, -7, -10, -13, -14) ;
2. le groupe chimérique représenté chez les vertébrés par la galectine-3 uniquement qui, en plus du domaine CRD, possède un long domaine amino- terminal non lectine qui permet son oligomérisation ;
3. le groupe «tandem-repeat» dont les membres contiennent 2 CRD différents reliés entre eux par un domaine peptidique variant de 5 à 50 acides aminés (galectine-4, -8, -9, -12).
Les galectines sont présentes au sein des différents compartiments cellulaires (nucléaire, cytoplasmique, membranaire ou extracellulaire) au sein desquels elles exercent des fonctions différentes. Elles sont sécrétées par une voie non classique, non encore élucidée à ce jour, étant donné qu’elles ne possèdent pas de peptide signal pour la sécrétion par la voie classique passant par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En extracellulaire, elles peuvent lier les protéines de la matrice extracellulaire (MEC) ainsi que les glycoprotéines présentes à la surface cellulaire. Puisque la majorité des galectines présentent plusieurs sites de liaison aux hydrates de carbone, elles forment des interactions qui permettent les contacts cellule-cellule, l’activation de récepteurs et la formation d’un treillis galectines-glycoprotéines à la surface cellulaire (Figure 7). Alors que leurs fonctions extracellulaires sont dépendantes de leurs interactions avec les résidus β-galactosides, leurs fonctions intracellulaires semblent être médiées par des interactions de type protéine-protéine (Varki et coll. 2009).
La revue de la littérature démontre l’implication des galectines dans la plupart des processus biologiques fondamentaux (comme décrit au point 2.3). Malgré ces multiples implications, les souris knock out (KO) pour la galectine-1, la galectine-3 ou pour ces deux galectines sont viables. Ceci suggère un rôle redondant des galectines. Les souris déficientes en galectine-1 présentent cependant des anomalies dans le développement du bulbe olfactif, tandis que les souris déficientes en galectine-3 présentent une réponse inflammatoire aiguë altérée (anomalies de recrutement des polynucléaires neutrophiles, altération des macrophages) et des troubles de la différenciation des chondrocytes (Leffler et coll. 2004).
2.2 Ligands des galectines-1 et -3
La présence de galactose est essentielle à la liaison des galectines mais leur affinité pour ce monosaccharide est faible. Celle-ci augmente lors de la formation de chaines polysaccharides avec des affinités spécifiques selon les galectines (Klyosov et coll. 2008).
La galectine-1 et la galectine-3 se lient aux résidus N-acetyllactosamines présents dans les séquences de N- et O-glycosylation ; elles peuvent donc se lier à de nombreuses glycoprotéines de la surface cellulaire et de la MEC. Elles présentent également des ligands intracellulaires avec lesquels elles ont des interactions de type protéine-protéine (Camby et coll. 2006; Dumic et coll. 2006).
Les principaux ligands de la galectine-1 et de la galectine-3 sont repris dans la Table 10.
Parmi ces ligands, il est à noter que différents CD exprimés par les lymphocytes sont des ligands de la galectine-1 et de la galectine-3. De plus, la neuropiline-1 et les intégrines α5β1 ainsi que le CD13 et les intégrines αvβ3, protéines exprimées par les cellules endothéliales (CE), sont respectivement des ligands de la galectine-1 et de la galectine-3.
2.3 Fonctions des galectines-1 et -3
Comme déjà mentionné, les galectines-1 et -3 peuvent se localiser dans la cellule, dans le noyau et/ou le cytosol. Elles peuvent également se localiser à la membrane cytoplasmique ou être sécrétées dans la MEC. Ces compartiments sont caractérisés par la présence de différents ligands. Ceci explique qu’une même galectine peut avoir un effet biologique différent selon sa localisation cellulaire.
Comme illustré dans la Figure 8, les galectines ont de multiples fonctions biologiques qui les impliquent dans différents évènements physiopathologiques, tels que l’embryogenèse,
l’inflammation ou le cancer (Rabinovich 1999). Nous détaillerons spécifiquement les fonctions qui les impliquent dans le cancer, c’est-à-dire la croissance tumorale, la dissémination métastatique, la régulation de la réponse immune anti-tumorale et l’angiogenèse (Liu et Rabinovich 2005). Ce travail portant sur les lymphomes, ce point sera détaillé séparément (point 2.4). De plus, l’implication des galectines dans l’angiogenèse sera décrite au point 3.3, après avoir introduit l’angiogenèse.
2.3.1 Croissance tumorale
En ce qui concerne la croissance tumorale, les galectines agissent en régulant la transformation, l’apoptose et la prolifération cellulaire (Figure 9).
Les galectines-1 et -3 cytosoliques peuvent interagir avec les oncogènes Ras (H-Ras (v-Ha- ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog) pour la galectine-1 et K-Ras (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) pour la galectine-3) permettant de prolonger l’activation des voies des mitogen-activated protein (MAP) kinases et de la phosphoinositide 3’
kinase (PI3K), causant une augmentation de la croissance cellulaire (Elad-Sfadia et coll. 2004;
Paz et coll. 2001).
La galectine-3 cytosolique protège différentes lignées cellulaires de l’apoptose induite par différents stimuli. Suite aux stimuli proapoptotiques, la galectine-3 se localise à la membrane mitochondriale afin d’empêcher le relargage du cytochrome C et ainsi inhiber l’activation des caspases (Yang et coll. 1996). Cette activité anti-apoptotique requiert la présence du site de phosphorylation et du domaine NWGR comme démontré par des expériences de mutagenèse dirigée contre ces sites (Dumic et coll. 2006).
Les rôles décrits ci-dessus font apparaître les galectines-1 et -3 comme stimulant la croissance cellulaire, alors que d’autres fonctions de ces galectines jouent des rôles inhibiteurs. En effet, la galectine-3 nucléaire ainsi que les galectines-1 et -3 extracellulaires présentent un rôle proapoptotique (Hsu et coll. 2006). De la même façon, les galectines-1 et -3 intracellulaires induisent l’arrêt du cycle cellulaire (Liu et Rabinovich 2005).
2.3.2 Potentiel métastatique
En ce qui concerne la dissémination métastatique, les galectines agissent en régulant l’adhésion et la migration cellulaire. La galectine-1 et la galectine-3 peuvent moduler les interactions cellule-MEC et cellule-cellule de façon variable selon leur concentration, le type de MEC, le type de cellule et les glycoprotéines exprimées à sa surface. Elles peuvent augmenter ou inhiber l’adhésion des cellules à la MEC via une liaison entre les intégrines et
les différents composants de la MEC. D’autre part, elles permettent aussi des interactions cellule-cellule homotypique ou hétérotypique (cellules tumorales – CE), favorisant la dissémination métastatique (Camby et coll. 2006; Dumic et coll. 2006; Liu et Rabinovich 2005; Perillo et coll. 1998). De plus, les galectines-1 et -3 modulent la migration cellulaire (Dumic et coll. 2006; Elola et coll. 2007).
Van den Brûle et coll. démontrent le rôle des galectines-1 et -3 dans la progression des adénocarcinomes prostatiques, la récidive tumorale étant associée à un taux plus élevé de galectine-3 au sein des cellules tumorales et de galectine-1 au sein des cellules stromales (van den Brûle et coll. 2000, van den Brûle et coll. 2001, Califice et coll. 2004).
2.3.3 Réponse immune
La galectine-1 est largement impliquée dans l’échappement à la réponse immune anti- tumorale car la sécrétion de cette galectine par les cellules tumorales induit l’apoptose des lymphocytes T. Cet effet a été démontré à l’aide d’une lignée cellulaire de mélanome pour laquelle l’inhibition de l’expression de galectine-1 diminue la croissance tumorale et augmente la réponse lymphocytaire anti-tumorale (Klyosov et coll. 2008).
A l’inverse de la galectine-1, la galectine-3 est considérée comme pro-inflammatoire ; elle active les macrophages, les polynucléaires neutrophiles et éosinophiles. Cependant, elle régule également la réponse lymphocytaire en induisant l’apoptose des lymphocytes T et en inhibant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. De ce fait, elle présente également une action dans l’échappement à la réponse immune anti-tumorale (Klyosov et coll. 2008; Liu et Rabinovich 2005). Les fonctions pro et anti-inflammatoires des galectines-1 et -3 sont détaillées Figure 10.
2.4 Implications des galectines-1 et -3 dans les lymphomes
Les données publiées concernant l’expression des galectines dans les tissus lymphoides normaux consistent en une absence d’expression de galectine-1 par les cellules lymphoïdes du thymus et des ganglions lymphatiques (Baum, Pang et coll. 1995; Baum, Seilhamer et coll.
1995) ainsi qu’une expression faible et focale de galectine-3 dans le tissu amygdalien (Hoyer et coll. 2004; Konstantinov et coll. 1996; Ramos-Medina et coll. 2011).
Au début de ce travail, seules deux publications rapportaient des résultats en ce qui concerne l’expression de galectine-3 dans les LNH (Hoyer et coll. 2004; Konstantinov et coll. 1996).
Au cours de la réalisation de ce travail, neuf études supplémentaires ont été réalisées (Andreasson et coll. 2009; Gandhi et coll. 2007; Juszczynski et coll. 2007; Kim, Lee et coll.
2008; Linderoth et coll. 2008; Liu et coll. 2009; Ramos-Medina et coll. 2011; Rodig et coll.
2008; Rust et coll. 2005). Les résultats de ces différentes études sont résumés dans la Table 11. Par contre, nous n’avons trouvé aucune étude concernant les galectines et les LPSNC.
2.4.1 Galectine-1
2.4.1.1 Galectine-1 et LNH
La revue de la littérature rapporte trois études s’étant intéressées à l’expression immunohistochimique de galectine-1 dans certains sous-groupes de LNH: le lymphome anaplasique (LA) et le DLBCL (Juszczynski et coll. 2007; Rodig et coll. 2008; Rust et coll.
2005).
L’expression de galectine-1 par les cellules lymphomateuses des DLBCL semble faible puisqu’elle n’a été observée que pour 0 à 7% des cas analysés.
Pour les LA, les résultats des deux études publiées sont contradictoires quant aux cellules exprimant la galectine-1. Pour Rodig et coll., 95% des LA sont caractérisés par une expression de galectine-1 par les cellules lymphomateuses. A l’opposé, Rust et coll. observent pour les LA une expression de galectine-1 par les cellules stromales sans expression par les cellules lymphomateuses.
Il faut également noter qu’une expression immunohistochimique de galectine-1 par les macrophages, les cellules dendritiques et les CE a également été mise en évidence dans les DLBCL (Gandhi et coll. 2007; Rodig et coll. 2008; Rust et coll. 2005).
2.4.1.2 Galectine-1 et LH
En ce qui concerne les LH, les cellules de Reed-Sternberg des LH classiques expriment la galectine-1 dans une proportion variant de 62 à 100% des cas selon les études (Gandhi et coll.
2007; Juszczynski et coll. 2007; Rodig et coll. 2008).
Cette expression a été proposée comme un des mécanismes d’échappement à la réponse immune anti-tumorale puisque celle-ci s’accompagne d’une diminution de l’infiltrat lymphocytaire CD8+ et d’une réponse immune de type Th2 (Gandhi et coll. 2007;
Juszczynski et coll. 2007).
De plus, cette expression de galectine-1 dans les LH a été proposée par Rodig et coll. comme marqueur pour le diagnostic différentiel entre les LH et certains nouveaux types histologiques de LNH au diagnostic difficile tels que les lymphomes B primitifs du médiastin (Rodig et coll. 2008).
Comme pour les LA et les DLBCL, une expression immunohistochimique de galectine-1 par les macrophages, les cellules dendritiques et les CE a également été mise en évidence dans les LH (Gandhi et coll. 2007; Rodig et coll. 2008; Rust et coll. 2005).
2.4.2 Galectine-3
2.4.2.1 Galectine-3 et LNH
Contrairement à la galectine-1, un pourcentage plus élevé de DLBCL expriment la galectine-3 puisque les proportions rapportées varient de 30 à 60% (Andreasson et coll. 2009; Hoyer et coll. 2004; Kim, Lee et coll. 2008; Konstantinov et coll. 1996; Ramos-Medina et coll. 2011).
Seuls Konstantinov et coll. n’ont pas pu mettre en évidence d’expression de galectine-3 par les cellules lymphomateuses de DLBCL, alors que ces mêmes auteurs mettent en évidence une expression de galectine-3 pour 100% des LA (Konstantinov et coll. 1996). Il faut cependant noter que cette étude a été publiée en 1996, avant l’introduction de la classification de l’OMS ; certains des lymphomes qui ont été classés comme LA seraient actuellement classés en DLBCL. On peut donc en conclure que les cellules lymphomateuses de certains DLBCL sont caractérisées par une expression de galectine-3.
Concernant l’expression de galectine-3 par les LA, Ramos-Medina et coll. rapportent en 2011 des données similaires à celles de Konstantinov et coll., à savoir une expression de galectine-3 dans 100% des cas de LA (Ramos-Medina et coll. 2011).
A l’opposé de cette expression de galectine-3 observée dans certains DLBCL et dans les LA, les autres sous-groupes analysés de LNH de type B (LF, lymphome lymphocytique, lymphome de Burkitt, lymphome de la zone marginale) sont caractérisés par une expression moindre de galectine-3 qui varie selon les études et les sous-groupes de 0 à 20% des cas.
Comme cela a été observé pour la galectine-1, le stroma associé aux lymphomes constitue une source potentielle de galectine-3 extracellulaire. En effet, une expression de galectine-3 par les macrophages, les cellules dendritiques et les CE a été observée dans les différents sous- groupes de lymphomes étudiés (DLBCL, lymphome de Burkitt, LF, lymphome de la zone marginale, lymphome T de l’adulte, LA) (Andreasson et coll. 2009; Hoyer et coll. 2004;
Konstantinov et coll. 1996; Linderoth et coll. 2008; Liu et coll. 2009).
Deux études se sont intéressées au rôle pronostique de l’expression de galectine-3 dans les lymphomes. Kim et coll. ont mis en évidence un association entre un mauvais pronostic et l’expression de galectine-3 au sein des cellules lymphomateuses chez des patients porteurs de DLBCL (Kim, Lee et coll. 2008).
De façon intéressante, Linderoth et coll. ont observé qu’une expression de galectine-3 par les cellules stromales est plus fréquemment observée dans les DLBCL en rémission complète en comparaison aux DLBCL chimiorésistants (Linderoth et coll. 2008). Ce résultat, mis en parallèle avec le rôle apoptotique de la galectine-3 extracellulaire démontré in vitro sur une lignée de DLBCL (Suzuki et Abe 2008), suggère que la différence de pronostic observée dans l’étude de Linderoth et coll. pourrait s’expliquer par une action extracellulaire de la galectine-3.
Le rôle anti-apoptotique de la galectine-3 exprimée par les cellules lymphomateuses des DLBCL a été proposé comme participant à la lymphomagenèse des DLBCL. En effet, la transfection de cellules de lymphome négatives en galectine-3 avec le gène codant pour la galectine-3 protège ces cellules de l’apoptose induite par Fas (Hoyer et coll. 2004).
2.4.2.2 Galectine-3 et LH
Nous n’avons trouvé qu’une seule étude concernant la galectine-3 et les LH qui rapporte une absence d’expression de galectine-3 par les cellules de Reed-Sternberg (Konstantinov et coll.
1996).
3. L’ANGIOGENESE
3.1 Définition et description
Le processus d’angiogenèse régule le développement de nouveaux capillaires à partir d’un réseau vasculaire préexistant et joue un rôle majeur dans la formation des vaisseaux sanguins au cours du développement embryonnaire et à l’âge adulte (angiogenèse physiologique). Un déséquilibre de ce processus contribue à la pathogénie de nombreuses pathologies non tumorales et tumorales (angiogenèse pathologique).
3.1.1 Angiogenèse physiologique
3.1.1.1 Au cours du développement
Le développement du système vasculaire fait intervenir trois mécanismes: la vasculogenèse, l’angiogenèse et l’artériogenèse (Carmeliet 2000; Carmeliet 2003; Carmeliet 2005; Hendrix et coll. 2003).
- La vasculogenèse mène à la formation d’un réseau vasculaire primitif chez l’embryon à partir d’une différenciation in situ de cellules progénitrices. Les cellules progénitrices présentes dans le sac vitellin sont appelées hémangioblastes. Elles se différencient en angioblastes qui migrent dans les différents tissus avant de donner naissance aux CE qui forment un plexus vasculaire primitif (Figure 11).
- L’angiogenèse qui permet au réseau vasculaire de se développer, se fait par bourgeonnement («sprouting»), par intussusception («splitting») ou par la formation de ponts transendothéliaux («bridging») (Figure 11). Cette étape permet de passer d’un plexus vasculaire primitif à un réseau hautement organisé. L’hypoxie est le stimulus angiogénique majeur pour le développement du réseau vasculaire. Au début, les cellules sont oxygénées par simple diffusion mais lorsque les tissus se développent, l’hypoxie s’installe et stimule l’angiogenèse via l’induction du facteur de transcription hypoxia- inducible factor (HIF).
L’angiogenèse par bourgeonnement est le mode prédominant et le plus étudié de la formation de nouveaux vaisseaux et s’établit en plusieurs étapes (Figure 12) (Ferrara 2010; Patan 2000). L’angiogenèse commence par une modification de la perméabilité
vasculaire, entrainant une extravasation de protéines plasmatiques qui servent de substrat pour les CE. Les CE perdent ensuite leurs contacts intercellulaires et l’activation des CE quiescentes entraine la dégradation locale de la membrane basale et de la MEC environnante par différentes protéases telles que les activateurs du plasminogène et les MMPs. En plus de dégrader la MEC, ces protéases modifient également la structure de certains de ses composants et libèrent des activateurs de l’angiogenèse liés à la MEC (comme le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)). Les CE vont ensuite migrer en direction du stimulus angiogénique. La migration cellulaire s’effectue notamment grâce aux intégrines qui permettent l’adhésion des CE à des composants de la MEC.
Récemment, un nouveau modèle de migration a été proposé (Figure 13) (De Bock et coll.
2009; Figg et Folkman 2008). Au front de migration, les CE se différencient en «tip cells», caractérisées par un faible taux de prolifération, une grande motilité et la présence de filopodes pour guider les vaisseaux bourgeonnants vers le stimulus angiogénique.
Derrière ces cellules directrices, les CE se différencient en «stalk cells» caractérisées par un taux élevé de prolifération pour allonger le vaisseau naissant. Finalement, la lumière vasculaire se forme et le vaisseau est stabilisé par les mécanismes d’artériogenèse (voir ci- dessous). Les CE quiescentes sont appelées «phalanx cells».
L’angiogenèse par intussusception est caractérisée par des colonnes de tissu interstitiel s’immisçant dans la lumière d’un vaisseau pour le diviser. Ce mécanisme de croissance vasculaire est plus rapide et métaboliquement économique, ne nécessitant ni de dégradation de la membrane basale ni de prolifération ni de migration des CE. Cependant, l’angiogenèse par intussusception ne peut se faire qu’à partir de vaisseaux préexistants et est donc impliquée dans la formation d’un réseau vasculaire dense et complexe à partir des vaisseaux formés par bourgeonnement (Carmeliet et Jain 2000; Dome et coll. 2007;
Roskoski 2007).
L’angiogenèse par ponts transendothéliaux est caractérisée par la prolifération des CE à l’intérieur du vaisseau divisant la lumière vasculaire et produisant de nouveaux vaisseaux de plus petit calibre (Risau 1997).
Le type d’angiogenèse dans un organe donné dépend du réseau vasculaire primitif formé par les mécanismes de vasculogenèse. Par exemple, l’angiogenèse par intussusception ou ponts transendothéliaux prédomine dans le poumon qui, lors de la vasculogenèse, a développé un réseau vasculaire primitif dense. Par contre, puisqu’il n’y a pas d’angioblaste ni de réseau vasculaire primitif dans le cerveau, l’angiogenèse y est réalisée par bourgeonnement (Risau 1997).
- L’artériogenèse stabilise les vaisseaux par une apposition de péricytes (pour les vaisseaux de petit calibre) et de cellules musculaires lisses (pour les vaisseaux de plus grand calibre) autour des CE, inhibant leur prolifération et migration (Carmeliet 2000).
Enfin, selon leur localisation, les CE se différencient et peuvent acquérir un phénotype particulier qui est déterminé, en partie, par le tissu hôte. Par exemple, les interactions entre les cellules gliales et les CE mènent à la formation de la barrière hématoméningée. A l’opposé, dans les organes endocrines, les capillaires restent fenêtrés, permettant ainsi plus d’échanges (passage des hormones dans le sang) (Carmeliet 2003; Carmeliet 2005).
3.1.1.2 A l’âge adulte
Après la naissance, l’angiogenèse contribue à la croissance des différents organes. Cependant, à l’âge adulte, la plupart des vaisseaux restent à l’état quiescent grâce à un équilibre dynamique entre les facteurs stimulant ou inhibant l’angiogenèse. On observe des phénomènes d’angiogenèse physiologique lors du cycle menstruel et lors de la grossesse.
Néanmoins, les CE quiescentes conservent leur capacité à se diviser rapidement suite à un stimulus tel que l’hypoxie (Carmeliet 2005).
3.1.2 Angiogenèse pathologique tumorale
3.1.2.1 Le concept de switch angiogénique
Les tumeurs ne peuvent dépasser une taille critique de 1-3 mm3 sans formation de nouveaux vaisseaux. Le switch angiogénique est induit lorsque les effets des molécules angiogéniques ne sont plus contrebalancés par les inhibiteurs de l’angiogenèse. La Figure 14 illustre les principaux facteurs impliqués dans ce switch angiogénique. Le VEGF est considéré comme le médiateur le plus important de l’angiogenèse tumorale, et, comme détaillé ci-dessous (point 3.2), est aussi la molécule la mieux caractérisée (Carmeliet et Jain 2000; Kerbel 2008).
Différents évènements peuvent initier ce switch angiogénique tels que les stress métaboliques (hypoxie, hypoglycémie, pH bas), le stress mécanique, la réponse immune/inflammatoire et les mutations génétiques (activation d’oncogènes, délétion de gènes suppresseurs de tumeurs) (Carmeliet et Jain 2000; Kerbel 2008).
Les molécules activatrices ou inhibitrices de l’angiogenèse peuvent provenir des cellules tumorales, des CE, des cellules stromales (macrophages, fibroblastes), du sang ou de la MEC (Chung et coll. 2010; Furuya et coll. 2009; Mareel et coll. 2009) . La contribution de chacun de ces acteurs varie selon le type de tumeur, sa localisation et sa progression. L’initiation de l’angiogenèse est principalement liée à l’hypoxie, ce qui induit la sécrétion de VEGF par les cellules tumorales. Par la suite, dans ce contexte tumoral, on observe une activation des fibroblastes et une initation d’une réponse immunitaire anti-tumorale. Par la sécrétion de différents facteurs angiogéniques, ces cellules stromales et immunes amplifient les phénomènes d’angiogenèse induits par les cellules tumorales (Figure 15). Contrairement à l’angiogenèse physiologique, l’angiogenèse tumorale est donc continuellement activée (Chung et coll. 2010; Furuya et coll. 2009).
3.1.2.2 Mécanismes de vascularisation tumorale
En plus des mécanismes d’angiogenèse physiologique (point 3.1.1.1.), la formation de vaisseaux dans un contexte tumoral peut également se faire par d’autres mécanismes tels le recrutement de CE progénitrices, la co-option, la «vasculogenic mimicry» et la formation de vaisseaux «mosaïques» (Carmeliet et Jain 2000; Roskoski 2007):
- Différentes études ont mis en évidence que des CE progénitrices originaires de la moelle osseuse peuvent circuler et se différencier en CE (vasculogenèse post-natale). Le VEGF est également impliqué dans le recrutement de ces CE progénitrices. Bien que le recrutement de ces CE progénitrices participe à la vascularisation tumorale, l’importance de leur contribution doit encore être définie (Dome et coll. 2007; Ferrara 2010).
- Les mécanismes de co-option s’observent lorsque les tumeurs présentent une croissance par invasion du tissu hôte, les cellules tumorales restant en contact avec les vaisseaux préexistants. Ce phénomène peut se rencontrer dans les phases initiales de tumorigenèse mais également plus tardivement. Ce mode d’action de vascularisation a été observé pour les mélanomes, les cancers pulmonaires non à petites cellules et dans certaines métastases hépatiques de carcinomes colorectaux (Carmeliet et Jain 2000; Dome et coll. 2007).
- La «vasculogenic mimicry» est caractérisée par la formation de tubes vasculaires qui ne sont pas bordés de CE mais au sein desquels circulent des hématies. La paroi de ces tubes est constituée de composants de la MEC, essentiellement de la laminine, et bordée de cellules tumorales. Ce mécanisme a été surtout observé dans le mélanome mais également dans d’autres tumeurs telles que les carcinomes mammaires, prostatiques ou les sarcomes d’Ewing (Dome et coll. 2007; Hendrix et coll. 2003).
- La paroi des vaisseaux «mosaïques» est formée à la fois par des CE et des cellules tumorales. Bien que différents modèles animaux ont mis en évidence la présence de vaisseaux mosaïques dans différentes tumeurs dont les mélanomes (Zhang et coll. 2006), l’importance de ce mécanisme dans la vascularisation tumorale humaine a été peu étudiée.
Nous n’avons trouvé qu’une étude s’intéressant aux adénocarcinomes coliques humains qui rapporte qu’environ 13% des vaisseaux tumoraux sont en mosaïques, bordés à la fois de CE et de cellules tumorales (Chang et coll. 2000) .
3.1.2.3 Hétérogénéité de la vascularisation tumorale
Différents modèles animaux ont souligné l’hétérogénéité de la vascularisation tumorale en fonction du tissu hôte ou de la progression tumorale (Figure 16).
L’implication du tissu hôte a été démontrée dans un modèle (Figure 16A) où une lignée d’astrocytome sauvage ou KO pour le gène HIF1A est implantée chez des souris en intracrânien ou en sous-cutané. La densité vasculaire est différente selon la localisation d’implantation de la lignée; la densité vasculaire est augmentée par rapport à la lignée sauvage si la lignée KO est implantée en intracrânien et diminuée si elle est implantée en sous-cutané.
La croissance de la tumeur modifie également les phénomènes d’angiogenèse ; dans un modèle de mélanome, les tumeurs de petite taille sont caractérisées par des vaisseaux de petit calibre avec des lumières de petite taille tandis que les tumeurs de plus grande taille comprennent, en plus de ces vaisseaux de petite taille, des vaisseaux de plus grand calibre avec des diamètres irréguliers (Figure 16B) (Langenkamp et Molema 2009).
L’hétérogénéité de la vascularisation tumorale s’observe également morphologiquement au sein des tumeurs humaines. Les tumeurs gliales, et en particulier le glioblastome, constituent l’exemple le plus évident que les mécanismes d’angiogenèse varient selon le tissu hôte et le grade tumoral. La prolifération vasculaire et l’hyperplasie endothéliocapillaire font partie des critères anatomopathologiques de diagnostic de glioblastome qui représente le grade de malignité le plus élevé des astrocytomes. Celles-ci ne sont pas observées dans les astrocytomes de bas grade (Louis et coll. 2007). Cette prolifération vasculaire présente un aspect morphologique de type pseudoglomérulaire. Celle-ci est rarement observée en dehors des tumeurs du système nerveux central (SNC). La composition unique de la MEC du SNC a été proposée comme élément pour expliquer cette vascularisation caractéristique des glioblastomes (Brat et Van Meir 2001).
Alors que de nombreuses études in vitro et des modèles animaux se sont intéressés aux mécanismes d’angiogenèse, peu d’études se sont intéressées à la vascularisation des tumeurs humaines.
Eberhard et coll. (Eberhard et coll. 2000) ont souligné l’hétérogénéité de la vascularisation tumorale en étudiant la prolifération des CE et la présence de péricytes des vaisseaux de 6 types de tumeurs humaines. Ces auteurs ont démontré que l’indice de prolifération des CE associées aux tumeurs (tumor-associated endothelial cells –TAECs) varie selon les tumeurs ; les glioblastomes et les carcinomes rénaux présentent les plus hauts indices de prolifération (de l’ordre de 8%) et les carcinomes prostatiques les plus faibles (de l’ordre de 2%). Ils ont de plus observé qu’au sein d’un même groupe de tumeurs, cet indice de prolifération des TAECs varie au sein de chaque cas.
Ces auteurs ont également étudié la maturation des vaisseaux en calculant le pourcentage de vaisseaux associés à des péricytes (c’est-à-dire ayant été stabilisés par les mécanismes d’artériogenèse). Les résultats observés mettent également en évidence une grande variation selon les types de tumeurs, les carcinomes mammaires présentant de l’ordre de 70% des vaisseaux associés à des péricytes et les glioblastomes de l’ordre de 10%.
De façon étonnante, la quantification de la densité microvasculaire (DMV), qui correspond à l’évaluation du nombre de vaisseaux par surface de tissu et qui est utilisée comme mesure de l’angiogenèse, est similaire entre les différents types de tumeurs.
Ces résultats suggèrent donc que les mécanismes de vascularisation tumorale varient selon le type de tumeur. En effet, l’indice de prolifération des TAECs évalue l’angiogenèse par bourgeonnement car la prolifération des CE est une des étapes de ce mécanisme (point
3.1.1.1) ; on peut donc supposer que les tumeurs avec un faible taux de prolifération des TAECs utilisent d’autres mécanismes de vascularisation tumorale. Parallèlement, la présence de nombreux vaisseaux associés à des péricytes peut suggérer que la vascularisation de ces tumeurs se fait en partie par co-option (vaisseaux matures pré-existants).
3.1.2.4 Caractéristiques spécifiques des vaisseaux dans un contexte tumoral
Les vaisseaux tumoraux se différencient des vaisseaux normaux par leurs aspects architecturaux, morphologiques et fonctionnels (Ferrara 2010).
Les vaisseaux tumoraux sont désorganisés (on n’observe pas la hiérarchie classique:
artérioles, capillaires et veinules), tortueux, de diamètre variable (Figure 17) et présentent une distribution hétérogène résultant en une répartition inégale en oxygène et nutriments au sein de la tumeur. Cette hypoxie présente dans certaines zones tumorales entraine une modulation de l’expression des facteurs stimulant ou inhibant l’angiogenèse (Carmeliet et Jain 2000; Jain 2005). Comparées aux CE normales, les TAECs présentent moins de connections intercellulaires et une raréfaction des péricytes permettant une plus grande perméabilité des vaisseaux (Ferrara 2010).
Les TAECs et les CE quiescentes se caractérisent par des profils d’expression de gènes et de protéines différents (Carmeliet et Jain 2000; Furuya et coll. 2009). Par des techniques de screening large telles que les micropuces à ADN, différentes molécules ont été identifiées comme spécifiques des TAECs. Les TAECs sont caractérisées par une augmentation d’expression de marqueurs de surface, tels que le CD105 (endogline), le CD13, le vascular endothelial growth factor receptor 1 (VEGFR1) ou les intégrines αvβ3 et α5β1 (Furuya et coll. 2009). A l’heure actuelle, il n’existe cependant pas de biomarqueur spécifique des TAECs applicable en clinique.
Le fait que les TAECs présentent un phénotype différent des CE normales est exploité dans le développement des thérapies ciblées dites de «vascular disrupting». Ces thérapies agissent en induisant des hémorragies ou des thromboses dans le réseau vasculaire tumoral et privent ainsi la tumeur de son apport en nutriments et oxygène (Abdelrahim et coll. 2010; Feron 2004; Ma et Adjei 2009). Cette stratégie cible les vaisseaux déjà formés et est complémentaire des autres stratégies anti-angiogéniques ciblant le développement de nouveaux vaisseaux (point 3.5).
En conclusion, la vascularisation d’une tumeur est complexe, constituée de vaisseaux préexistants matures (vaisseaux co-optés), de vaisseaux néoformés (par angiogenèse et/ou recrutement de CE progénitrices), de vaisseaux en cours de formation ainsi que de vaisseaux mosaïques. Cette complexité peut expliquer les limitations observées lors d’un traitement anti-angiogénique (point 3.5).
L’implication de l’angiogenèse dans les lymphomes sera décrite au point 3.4 après avoir introduit le système du VEGF/VEGF-récepteurs et l’implication des galectines dans l’angiogenèse (points 3.2 et 3.3).
3.2 Le système VEGF/VEGF-récepteurs
Parmi les différents facteurs angiogéniques découverts à ce jour, le système VEGF/VEGFR est considéré comme le régulateur majeur de l’angiogenèse physiologique et pathologique. Ce système se compose de 5 ligands (VEGF-A ou VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D et Placental Growth Factor (PlGF)), de 3 récepteurs (VEGFR1, VEGFR2 et VEGFR3) et de corécepteurs (neuropiline-1 et -2 et heparan sulfate proteoglycans). La Figure 18 illustre les interactions des membres de la famille du VEGF avec les VEGFRs.
3.2.1 Les récepteurs au VEGF
Les trois récepteurs des ligands de la famille du VEGF (VEGFR1, VEGFR2 et VEGFR3) appartiennent à la famille des récepteurs tyrosine kinases. Le VEGFR2 est considéré comme le médiateur principal des effets du VEGF. Les VEGFR1 et VEGFR2 sont des glycoprotéines transmembranaires composées d’un domaine extracellulaire contenant 7 domaines immunoglobuline (Ig)-like, un segment transmembranaire, un segment juxtamembranaire et un domaine intracellulaire possédant une activité tyrosine kinase (divisé en deux par l’insertion d’une partie «kinase insert» de 70 acides aminés) (Figure 18) (Roskoski 2007). Le site de liaison au ligand se situe dans le 2ème et 3ème domaine Ig-like (Fischer et coll. 2008).
Suite à la liaison des ligands, les récepteurs se dimérisent et activent le domaine tyrosine kinase. L’activité tyrosine kinase de l’un des récepteurs phosphoryle un résidu tyrosine de l’autre récepteur et inversement. Les VEGFRs peuvent former des homo- et des hétérodimères. L’activité des VEGFRs est contrôlée, d’une part, par des phosphotyrosines phosphatases qui déphosphorylent les résidus tyrosine et, d’autre part, par une internalisation et une dégradation du récepteur (Olsson et coll. 2006).
